王穎 張莎娜 李建康 郭思成☉ 田沛藝◇ 劉海龍 楊寶 李亞農(nóng) 劉振強李春徳 姜濤¤

Li-Fraumeni綜合征（Li-Fraumeni syndrome，LFS；OMIM 151623）是一種常染色體顯性遺傳的腫瘤易感綜合征，該病患者具有腫瘤發(fā)生高風(fēng)險和腫瘤發(fā)生低齡化特點，患者發(fā)生癌癥的概率比普通人群高24倍，30歲以前人群的發(fā)病率最高，很多患者發(fā)生二次或者多次原發(fā)性腫瘤[1,2]。1990年MALKIN等[3]首次確定了抑癌基因TP53為LFS綜合征的責(zé)任基因，70%～80%的LFS家族可檢測到TP3基因突變。國內(nèi)對于兒童腦腫瘤合并Li-Fraumeni綜合征了解尚少，本研究回顧性分析首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科門診就診的12例脈絡(luò)叢癌（choroid plexus carcinoma,CPC）和髓母細(xì)胞瘤（medulloblastoma，MB）為首發(fā)疾病的 Li-Fraumeni綜合征患兒資料，報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會審批同意后，納入2016年1月至2021年1月我院門診就診的Li-Fraumeni綜合征患者作為研究對象。本文采用的LFS診斷標(biāo)準(zhǔn)：①患兒病理診斷為中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤；②患兒外周血基因檢測結(jié)果為TP53基因突變。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①患兒確診LFS，父母或者監(jiān)護人同意參與該調(diào)查；②患兒年齡小于14歲；③具備腫瘤組織石蠟切片以供分析。排除標(biāo)準(zhǔn)：患兒失訪或者臨床資料不全，無法分析。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 本研究為回顧性資料分析，患兒父母或者監(jiān)護人簽署知情同意后，課題組采集患兒臨床基本信息，包括但不限于：性別、出生日期、手術(shù)時間、手術(shù)方式、病理診斷、手術(shù)后治療方案、臨床預(yù)后、患兒父母及其家庭病史等。隨訪時間為從手術(shù)時間開始，至最后一次隨訪或者死亡時間。

1.2.2 髓母細(xì)胞瘤分子亞型檢測及TP53基因突變分析 利用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA）試劑盒從患者新鮮冷凍樣本、福爾馬林固定石蠟包埋組織或血液中分離基因組DNA，利用前期報告的方法[4]及與分型相關(guān)的39個基因panel（Genetron Health，北京，中國），利用Hiseq X10平臺（Illumina,San Diego，CA）進行低深度的全基因組測序以協(xié)助臨床進行髓母細(xì)胞瘤的分子分型判斷。

利用腫瘤相關(guān)基因 panel（Genetron Health，北京，中國）對患者及進行靶向測序以分析包含TP53在內(nèi)的基因突變。利用Hiseq X10平臺（Illumina,San Diego,CA）進行測序分析（平均覆蓋深度超過100×，目標(biāo)區(qū)域的覆蓋率約為99%）。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)分析 使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）將測序讀長與人類參考基因組（hg19）進行比對。去除重復(fù)序列、進行局部重比對和堿基質(zhì)量值重校正后，檢測體細(xì)胞單核苷酸變異（single-nucleotide variations，SNVs）、檢測及小插入/缺失（insertion/deletion，INDEL）及體細(xì)胞拷貝數(shù)異常（copy number variations，CNVs）。通過已建立的分子分型的指導(dǎo)基因，采用隨機森林法構(gòu)建髓母細(xì)胞瘤分型模型。

1.2.4 基因突變分析 胚系突變預(yù)測采用SIFT和PPYPE2生物信息學(xué)工具。報告的變異使用人類基因突變數(shù)據(jù)庫、ClinVar和位點特異性數(shù)據(jù)庫確定。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入12例患兒，其中4例髓母細(xì)胞瘤，8例脈絡(luò)叢癌。髓母細(xì)胞瘤患兒男1例，女3例，年齡5～9歲，經(jīng)典型1例，促纖維增生/結(jié)節(jié)型2例，大細(xì)胞/間變型髓母細(xì)胞瘤1例。髓母細(xì)胞瘤患兒均為SHH亞型。脈絡(luò)叢癌患兒男6例，女2例，年齡14～102個月，平均（44.13±29.83）個月。

2.2TP53突變分析 12例患者中，共檢測到11種類型的TP53突變，以錯義突變?yōu)橹鳎?例），還包含剪切位點突變、移碼突變及無義突變各1例。9例突變位于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DBD）;錯義突變（c.566C＞A，p.A189D）見于CPC患者，該變異在ClinVar數(shù)據(jù)庫中未收錄，IARC TP53數(shù)據(jù)庫中僅1例出現(xiàn)于SHH型MB報告，但國內(nèi)患者未見，目前功能了解較少，SIFT和PPYPE2軟件分析均為損傷性突變；錯義突變c.808T＞G，p.F270V，見于MB患者，在LFS中未見報告，目前ClinVar中報告為意義未明的突變，利用SIFT和PPYPE2軟件分析分別為有害或可能損傷性突變。；移碼突變c.454_455dupCC，p.P153Rfs發(fā)生于MB患者，在中國LFS/LFL患者中未見報告；除未見報告的突變外，其余突變均證實為致病性或可能致病突變。通過錯義突變及無義突變的功能分類，發(fā)現(xiàn)6例突變表現(xiàn)顯性負(fù)效應(yīng)及功能缺失，2例突變無顯性負(fù)效應(yīng)但有功能缺失（表1）。

表1 12例患者臨床特征和TP53突變特點

2.3 家族史 12例患兒家庭中，患兒1、2、10、12可見明確家族病史，3例患兒親屬可見LFS相關(guān)腫瘤，患兒1母親診斷為肺癌和乳腺癌，患兒2姨媽25歲時死于“肉瘤”，患兒12祖母膠質(zhì)瘤，母親為胃癌和乳腺癌；患兒10母親可見TP53突變，但尚未發(fā)現(xiàn)腫瘤病史?；純?1父母基因檢測結(jié)果均陰性。其余7例患兒家庭中未基因檢測，未見明確LFS相關(guān)腫瘤病史。

2.4 治療與預(yù)后 所有患兒隨訪3～48個月，平均16個月。8例脈絡(luò)叢癌患兒，患兒1～3手術(shù)后接受化療+局部放療，腫瘤均復(fù)發(fā)，2例死亡，1例目前維持化療?；純?、5腫瘤切除后未接受任何治療，1例腫瘤復(fù)發(fā)死亡，1例目前尚無復(fù)發(fā)?；純?、8手術(shù)后接受化療，腫瘤未復(fù)發(fā)。患兒7手術(shù)后采用局部放療，腫瘤復(fù)發(fā)。需要注意，尚未復(fù)發(fā)的脈絡(luò)叢癌患兒，目前隨訪時間均較短（3～8個月）。髓母細(xì)胞瘤患兒4例，手術(shù)后均接受全腦脊髓放療+化療，具體化療方案不詳，4例患兒均已死亡。患兒9既往外院手術(shù)，診斷為膝關(guān)節(jié)骨肉瘤。

3 討論

LFS和兒童顱腦腫瘤的關(guān)系為近年來研究熱點之一，但國內(nèi)對此了解尚少。在LFS相關(guān)性腫瘤中，以肉瘤、乳腺癌、腦腫瘤和腎上腺皮質(zhì)癌最為常見，約占所有腫瘤的70%[5-6]；中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中LFS以膠質(zhì)瘤、SHH亞型髓母細(xì)胞瘤和脈絡(luò)叢乳頭狀癌為主[7-9]。2020年，F(xiàn)REBOURG等[10]進一步提出了TP53相關(guān)遺傳性癌癥綜合征（heritableTP53-related cancer syndrome，hTP53rc）的概念，一些和LFS關(guān)系密切的腫瘤被稱之為core cancers，主要包括：骨肉瘤、軟組織肉瘤、乳腺癌、SHH亞型髓母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、脈絡(luò)叢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、急性白血病等。早期發(fā)現(xiàn)LFS，對于患兒及其家庭具有重要的臨床意義。目前國際上已經(jīng)推薦對SHH亞型髓母細(xì)胞瘤和脈絡(luò)叢乳頭狀癌患兒及其家庭常規(guī)進行基因檢測以排除TP53胚系突變。

TP53是位于染色體17p上的抑癌基因，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，在細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，其編碼蛋白p53作為重要的轉(zhuǎn)錄因子通過序列特異性方式與目標(biāo)DNA結(jié)合，參與DNA修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯和凋亡等過程，從而維持細(xì)胞基因組的完整性[11]。TP53突變往往干擾p53轉(zhuǎn)錄活性從而影響細(xì)胞損傷的修復(fù)并引發(fā)癌變。TP53中大部分癌癥相關(guān)突變類型是錯義突變，并且絕大多數(shù)發(fā)生在其DNA結(jié)合域的6個“熱點突變”位點。突變型p53蛋白可能從功能缺失、顯性失活和功能獲得三方面發(fā)揮不同的促癌作用[3]。本研究中涉及到的12例腦腫瘤患者的TP53胚系突變以錯義突變?yōu)橹鳎渲?例位于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，剩余1例位于四聚化結(jié)構(gòu)域，符合已有的發(fā)現(xiàn)。

隨著二代測序（NGS）等技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用，越來越多患兒被發(fā)現(xiàn)伴有TP53胚系突變而得到診斷[12]，很多癌癥患者并沒有典型家族史，或者尚未出現(xiàn)其他惡性腫瘤，尤其是在嬰幼兒、兒童癌癥和早期乳腺癌成年患者中。本組病例中，只有部分患兒有著明顯的家族病史，1例患兒伴有骨肉瘤病史，符合以上特點。這提示我們對于SHH亞型髓母細(xì)胞瘤和脈絡(luò)叢癌，患兒及其家庭成員均應(yīng)接受TP53胚系變異分析，并進行腫瘤預(yù)防監(jiān)測[13]。

TP53胚系突變往往意味著更差的臨床預(yù)后，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)染色體重排或染色體碎裂，有較高的基因組不穩(wěn)定性。基于變異的p53蛋白的分子功能，LFS相關(guān)腫瘤往往對放療抵抗，放療和烷化劑化療（alkylating chemotherapy）患者發(fā)生二次腫瘤的概率明顯增加[9,12,14-15]。髓母細(xì)胞瘤中，TP53基因胚系突變主要見于SHH亞型，高發(fā)年齡5～10歲，最新版WHO病理分類中歸為高危型，預(yù)后極差[16-17]，本組數(shù)據(jù)也顯示了類似的結(jié)果。SHH亞型髓母細(xì)胞瘤需要篩查TP53基因胚系突變，患兒需要盡量避免放療，可以選用大劑量化療；患兒家庭成員可能也會伴有Li-Fraumeni綜合征，需要定期體檢、早期發(fā)現(xiàn)相關(guān)腫瘤，以盡可能提高臨床預(yù)后[18]。脈絡(luò)叢癌患兒約有一半左右伴有TP53基因胚系突變[19]，本課題組既往研究結(jié)果顯示在脈絡(luò)叢癌患兒如果合并有TP53基因胚系突變，放療反而會帶來更差的臨床預(yù)后[20-21]。

LFS為相對罕見病例，國內(nèi)外報告均較少，需要引起臨床醫(yī)生和患者家庭的關(guān)注，早期進行基因檢測，盡可能提高患兒及其家庭的生存預(yù)后和生活質(zhì)量。本研究為回顧性病例分析，為本研究的主要缺點，未來將展開多中心的病例登記，開展前瞻性研究，提高對LFS的了解，從而改善患兒及家庭的預(yù)后。