倪鼎文，陳紅剛

（1.蘭州財經(jīng)大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000）

鐵棒錘為毛茛科烏頭屬植物，別名鐵牛七、雪上一枝蒿、斷腸草、黑烏草、榜那、龐阿那保[1]，分布于海拔2 000～3 700 m 的山坡草地、林緣或疏林下，藥用部位為塊根，味微苦、辛，性熱，有大毒，主要含有烏頭堿、去氧烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等，具有活血化瘀、止痛消腫、解熱等作用，用于治療跌打損傷、風濕關(guān)節(jié)痛、牙痛等[2]。

隨著鐵棒錘藥理學研究的深入及藥用價值的挖掘，其用途愈顯廣泛，除了鐵棒錘相關(guān)藥品的開發(fā)之外，鐵棒錘提取物在一些殺蟲劑、滅鼠劑等生物農(nóng)藥的開發(fā)方面效果明顯[3-4]。目前鐵棒錘藥材主要來源于野生，但僅靠野生資源已無法滿足市場用藥的需求，且無節(jié)制的采挖容易導致野生資源的滅絕，為了保護有限的野生資源和對現(xiàn)有資源進行合理的開發(fā)利用，開發(fā)新的藥源成了解決鐵棒錘資源匱乏的必然選擇。近年來，甘肅、寧夏等地嘗試了鐵棒錘的人工馴化栽培[5-7]，也進行了利用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)鐵棒錘藥材的探索[8-9]，但人工生產(chǎn)鐵棒錘藥材質(zhì)量的研究報道較少。本研究以烏頭堿為指標性成分，考察不同栽培技術(shù)及栽培年限對鐵棒錘藥材質(zhì)量的影響，旨在為鐵棒錘的規(guī)范化栽培及資源保護及開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 鐵棒錘藥材

鐵棒錘種子來源于甘肅中醫(yī)藥大學和政藥用植物園，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學杜弢教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘種子，鐵棒錘種苗為和政藥用植物園種子育苗后統(tǒng)一提供，移栽所用種苗大小一致，田間管理方法相同，藥材采挖后去除雜質(zhì)、陰干保存，不定根由組織培養(yǎng)方法獲得，生產(chǎn)周期140 d[10-12]。樣品信息詳見表1。

1.2 試驗地概況

大田試驗在甘肅省和政縣甘肅中醫(yī)藥大學和政藥用植物園進行，海拔2 400 m，年平均氣溫5.8 ℃，年降雨量592.7 mm，無霜期111 d，年日照數(shù)約2 150～2 400 h。土壤為黑壚類，pH 為7.44，有機質(zhì)4.16%，全氮0.267%，全磷0.106%，全鉀2.17%，水解氮194.25 mg/kg，速效磷26.7 mg/kg，速效鉀158 mg/kg，地塊平整，肥力均勻，土壤熟化程度高。

1.3 儀器

Aglient1200 高效液相色譜儀（G1311C 型四元梯度泵、G1315D 型二級管陣列檢測器（DAD、G1316A型柱溫箱、G1329B 型自動進樣器、Chemstation 色譜工作站），Phenomenxe Luna 5u C18（250×4.6 mm）色譜柱，HH-S24 電熱恒溫水浴鍋（江蘇大地自動化儀器廠），超聲波清洗器（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司BX7200HP，十萬分之一電子天平(奧豪斯儀器（上海）有限公司JB/T 5374-1991）。

1.4 試劑

氨水、異丙醇、乙酸乙酯、乙酸銨、三氯甲烷為分析純，乙腈、四氫呋喃為色譜純。標準品：烏頭堿（上海源葉生物科技有限公司Z06F6B1）。

2 方法

2.1 樣品制備

分別稱取不同來源過二號篩的鐵棒錘粉末0.5 g，放置于50 ml 的錐形瓶中，加入氨試液0.75 ml，異丙醇和乙酸乙酯（1∶1）的混合液13 ml，密封。在頻率59 kHz、溫度25 ℃條件下超聲提取40 min，抽濾，取濾液6.5 ml 置于口徑60 mm 的蒸發(fā)皿中，在40 ℃的恒溫水浴鍋中蒸干。蒸干后在殘渣中加入異丙醇和三氯甲烷（1∶1）混合液溶解，定容到2 ml 容量瓶中，過0.45 m 的微孔濾膜，于4 ℃密封保存。

2.2 烏頭堿含量測定

參照馬學琴[13]、張帆[14]、楊金[15]等人的方法進行烏頭堿含量的測定。色譜條件：采用phenomenxe Luna 5u C18（250×4.6 mm）色譜柱，以乙腈-四氫呋喃（25∶15）為有機相，以0.1 molL-1 醋酸銨溶液（加冰醋酸0.5 ml/1 000 ml）為水相，按表2 中規(guī)定進行梯度洗脫，檢測波長為235 nm，柱溫35 ℃，流速0.8 ml/min，理論板數(shù)按烏頭堿峰計算應(yīng)不低于5 000，進樣量5μL。

表2 流動相洗脫梯度

2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007 軟件進行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)方差分析。

3 結(jié)果與分析

不同栽培技術(shù)及栽培年限鐵棒錘藥材質(zhì)量差異見圖1，B、C、D、E 來源的鐵棒錘藥材烏頭堿含量高于A，說明二年生藥材質(zhì)量優(yōu)于一年生藥材；C 來源的藥材烏頭堿含量高于B（P＜0.05），說明相同的生長時間用子根繁殖的藥材質(zhì)量優(yōu)于種子直播的藥材；D來源的藥材烏頭堿含量高于C，說明打頂處理可以提高鐵棒錘藥材質(zhì)量；C 來源的藥材烏頭堿含量高于E（P＜0.05），說明秋季采收的藥材質(zhì)量優(yōu)于春季采收藥材；F 來源的藥材烏頭堿含量低于C、D 來源藥材，但高于A、B、E 來源藥材，說明利用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)鐵棒錘不定根是一種可行的鐵棒錘藥材生產(chǎn)方法。

圖1 栽培技術(shù)及栽培年限對鐵棒錘藥材質(zhì)量的影響

4 結(jié)論與討論

鐵棒錘為二年生藥材，二年生藥材質(zhì)量優(yōu)于一年生。鐵棒錘可以通過種子直播及育苗移栽的方法種植，而育苗移栽生產(chǎn)的鐵棒錘藥材質(zhì)量更好。打頂會使藥材的葉面積及光合特性發(fā)生改變，抑制頂端優(yōu)勢，促進根系生長發(fā)育[16]，利于鐵棒錘藥材中烏頭堿含量的積累，可提高鐵棒錘藥材質(zhì)量。采收時令對藥材本身的質(zhì)量、療效有直接的影響，所以合時合理地采收是保證藥材質(zhì)量的關(guān)鍵所在[17]，秋季采收的鐵棒錘藥材比春季采收的藥材烏頭堿含量更高，質(zhì)量更好，可能是由于鐵棒錘比較耐寒，在開春土壤解凍時，子根越冬芽已經(jīng)開始生長，消耗了部分能量物質(zhì)，導致鐵棒錘藥材中烏頭堿含量下降，藥材質(zhì)量降低。

鐵棒錘不定根培養(yǎng)技術(shù)雖然剛剛起步，繁殖效率較低，繁殖成本高于大田生產(chǎn)，但利用不定根培養(yǎng)生產(chǎn)次生產(chǎn)物具有生長周期短、條件可控、來源單一、遺傳背景一致、經(jīng)濟方便、重復性強、效率高和可周年試驗或生長等優(yōu)點[18]。本研究中鐵棒錘不定根中烏頭堿含量高于A、B、E 來源藥材，但低于C、D 來源藥材，說明利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速大量獲得不定根，可以為鐵棒錘野生資源保護及現(xiàn)有資源的開發(fā)利用提供一條可行的新途徑，能夠有效的解決鐵棒錘野生資源不足，種植周期長及有效成分不穩(wěn)定的問題，具有顯著的生態(tài)效益及社會效益。