任加云，尚 帥，夏江寶

(1.濱州學(xué)院 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256600； 2.濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濱州 256600)

引 言

近年來中國近岸海域鎘離子(Cd2+)污染呈上升趨勢[1-2]，某些海區(qū)鎘離子的濃度已經(jīng)超過水產(chǎn)養(yǎng)殖用水標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，嚴(yán)重威脅著對海洋環(huán)境生態(tài)安全[5-11]。雙殼貝類營濾食性生活，代謝率低，富集重金屬能力較強(qiáng)[12-13]，許多學(xué)者研究顯示鎘離子對貝類具有明顯的毒性效應(yīng)如氧化損傷，DNA損傷和細(xì)胞凋亡等[14-16]。

已有研究表明雙殼貝類濾食率、耗氧率可以作為評估外界環(huán)境壓力的重要行為指標(biāo)[17-18]，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)作為生物轉(zhuǎn)化過程中關(guān)鍵酶，是毒物生物轉(zhuǎn)化功能的重要評價(jià)指標(biāo)[19-20]，目前應(yīng)用行為和生物轉(zhuǎn)化指標(biāo)綜合評價(jià)鎘離子對貝類毒性影響的研究尚未見報(bào)道。文蛤(Meretrixmeretrix)、四角蛤蜊(Mactraveneriformis)為我國淺海養(yǎng)殖重要的經(jīng)濟(jì)貝類，常被作為海洋污染的指示生物[21-23]，本文研究了鎘離子(Cd2+)對2種雙殼貝類濾食率(filtration rate)、耗氧率(respiration rate)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活性的影響，比較分析了2種雙殼貝類對Cd2+脅迫響應(yīng)的差異，探討了雙殼貝類在Cd2+作用下行為指標(biāo)和生物轉(zhuǎn)化機(jī)能的關(guān)系，為我國海洋環(huán)境Cd2+污染評估和監(jiān)測提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

文蛤和四角蛤蜊于2019年9月取自山東省濱州市無棣縣沿海灘涂養(yǎng)殖基地，實(shí)驗(yàn)所用文蛤、四角蛤蜊為同一批苗種養(yǎng)殖的貝類，平均殼高為3.2±0.3 cm，海水鹽度為28，海水鎘離子濃度為0.513±0.021 ng·L-1。

實(shí)驗(yàn)用海水為當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的天然海鹽和清潔淡水配置成鹽度為28的海水，分別將文蛤和四角蛤蜊放入裝有30 L海水的60×45×35 cm的塑料水槽中，連續(xù)充氣，養(yǎng)殖海水pH值為7.8，水溫為21±1 ℃，以凍干小球藻粉(Chlorellavulgaris)為餌料，日投喂量為5.0 mg·L-1，日換水1/2，共暫養(yǎng)14 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置

根據(jù)中國海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[24](養(yǎng)殖水域鎘離子濃度需≤0.005 mg·L-1)，按照此標(biāo)準(zhǔn)的10倍、20倍、50倍設(shè)置實(shí)驗(yàn)鎘離子暴露濃度，分別為0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1和0.25 mg·L-1。暴露實(shí)驗(yàn)前，利用CdCl2·2.5H2O(AR級)制備高濃度Cd2+母液，然后稀釋至實(shí)驗(yàn)所需的濃度。分別隨機(jī)挑選健康的文蛤、四角蛤蜊各100只放入塑料水槽中，每種貝類每個(gè)染毒梯度均設(shè)置6個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)期間的充氣、換水量和投喂等管理跟暫養(yǎng)期間基本一致，換水時(shí)加入海水為含對應(yīng)染毒濃度Cd2+的海水，每2 d測定養(yǎng)殖水槽的水溫、pH、鹽度和Cd2+濃度等數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)期間各實(shí)驗(yàn)梯度鎘離子濃度分別為0.04±0.01 mg·L-1、0.11±0.04 mg·L-1和0.28±0.08 mg·L-1。在暴露實(shí)驗(yàn)的第0，1，3，6，10，15天取樣，每個(gè)水槽分別隨機(jī)取文蛤和四角蛤蜊各6只，解剖取消化盲囊和鰓絲組織，迅速用4 ℃超純水洗凈后置于1.5 mL離心管中，保存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于測定GST酶的活性，樣品在采樣后24 h內(nèi)測定；同時(shí)取部分個(gè)體同步進(jìn)行行為指標(biāo)(濾食率和耗氧率)的測定實(shí)驗(yàn)。

1.3 文蛤和四角蛤蜊行為指標(biāo)測定

本實(shí)驗(yàn)測定文蛤和四角蛤蜊的耗氧率和濾食率來評價(jià)兩者的行為變化，具體測定方法如下：

每次取樣四角蛤蜊和文蛤迅速放入燒杯中進(jìn)行密閉，濾食率(FR)的測定采用Coughlan等人的方法[25]，稍加改進(jìn)，該方法基于中性紅色染料顆粒從水體中的損失速度來表示濾食率，將每個(gè)濃度組出水管伸縮健康的文蛤和四角蛤蜊分別放入含有100 mL中性紅溶液(1 mg·L-1)的燒杯(每個(gè)燒杯1個(gè)蛤)中，在將蛤放入溶液之前，從每個(gè)燒杯中取出水測定初始濃度C0，2 h后取出蛤蜊，剩余溶液(CT)與初始溶液(C0)用5%鹽酸調(diào)整pH=5，在550 nm處測量吸光度，計(jì)算中性紅濃度。中性紅的標(biāo)準(zhǔn)隨樣品一起測量，并用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從中可以推斷中性紅染料濃度。FR的計(jì)算公式為FR=[M/nt]log(C0/Ct)，其中FR換算為每g濕重文蛤或者四角蛤蜊的濾食率(mg·g-1·h-1)，M為水的總體積，n為蛤的數(shù)量，t為時(shí)間(h)，C0和Ct分別為兩次采樣的濃度值。

用校準(zhǔn)好的氧電極連接血氧計(jì)，采用Basti等人的方法[26]分別測定在4只文蛤和四角蛤蜊測量呼吸速率(RR)。每30 min進(jìn)行一次氧濃度下降測定，持續(xù)3 h，并使用以下公式計(jì)算耗氧率RR=[CT0-CTi]×V/(Ti-T0)，其中RR為耗氧率,用蛤每g濕重每小時(shí)消耗的氧氣量來表示(mg·g-1·h-1)，CT0和CTi分別是時(shí)間在開始T0和Ti時(shí)間點(diǎn)的氧氣濃度，V為密閉燒杯總?cè)芤旱捏w積(mL)。

1.4 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的測定

現(xiàn)將消化盲囊和鰓絲在已經(jīng)調(diào)配好的磷酸鹽緩沖液(pH=7.7，溫度為4 ℃)冰浴中進(jìn)行勻漿，時(shí)間為5 min，轉(zhuǎn)速為12,000 r·min-1，勻漿后取勻漿液放入1.5 mL離心管中，然后在高速冷凍離心機(jī)以10,000 r·min-1離心25 min后，取上清液作為酶液測定GST酶的活力。GST活力根據(jù)Habig等[27]的測定方法稍加改進(jìn)，取200 μL酶液，快速加入磷酸緩沖液2.0 mL，H2O 400μL，GSH (15.0 mmol) 200 μL，CDNB (15.0 mmol·L-1) 200 μL，然后利用分光光度計(jì)在340 nm連續(xù)讀數(shù)120 s，酶活力用每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生的2,4-二硝基苯谷胱甘肽(2,4-dinitrophenylglutathione)的nmol量來表示，單位為nmol·mg-1·min-1；蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)染色法(Bradford法)[28]測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，并用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)暴露組與對照組的行為反應(yīng)差異，然后通過雙向方差(two-way ANOVA)分析評估各濃度組兩種蛤之間各指標(biāo)變化差異性。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著(*表示)，當(dāng)P<0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著(**表示)，其它認(rèn)為差異不顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 鎘暴露對文蛤和四角蛤蜊濾食率和耗氧率的影響

圖1和圖2分別為文蛤和四角蛤蜊在各濃度鎘離子暴露下濾食率變化圖?？梢娫阪k暴露影響下，兩種蛤的濾食率整體呈現(xiàn)下降趨勢，0.05 mg·L-1暴露組的文蛤和四角蛤蜊濾食率從第3天和第1天開始明顯低于對照組(P<0.05)；兩者在0.10 mg·L-1和0.25 mg·L-1暴露組從第1天開始均顯著低于對照組(P<0.05)，且在0.25 mg·L-1處理組均從第1天開始極顯著低于對照組(P<0.01)。經(jīng)過計(jì)算，四角蛤蜊在各個(gè)濃度鎘離子處理下的濾食率幅度均顯著高于文蛤(P<0.05)，其中在0.25 mg·L-1處理組在第15天文蛤的濾食率為對照組的16.7%，而四角蛤蜊為對照組的8.0%。

圖1 鎘離子對文蛤?yàn)V食率的影響

圖2 鎘離子對四角蛤蜊濾食率的影響

圖3和圖4分別為文蛤和四角蛤蜊在各濃度鎘離子暴露下耗氧率變化圖。0.05 mg·L-1暴露組文蛤的耗氧率并未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)，四角蛤蜊從第6天開始顯著低于對照組(P<0.05)；0.10 mg·L-1處理組的文蛤和四角蛤蜊分別從第3天和第1天明顯低于對照組(P<0.05)，兩者在0.25 mg·L-1處理組均從第1天開始顯著低于對照組(P<0.05)。經(jīng)過計(jì)算得知，各濃度鎘離子影響下四角蛤蜊耗氧率降低速度比文蛤快。

圖3 鎘離子對文蛤耗氧率的影響

圖4 鎘離子對四角蛤蜊耗氧率的影響

通過計(jì)算得知兩種蛤的濾食率下降幅度要明顯高于耗氧率，耗氧率呈現(xiàn)顯著下降的時(shí)間點(diǎn)相對于濾食率滯后。

2.2 鎘暴露對文蛤和四角蛤蜊消化盲囊和鰓絲GST活力的影響

圖5和圖6分別為文蛤消化盲囊和鰓絲在各濃度鎘暴露下GST酶活性變化圖。0.05 mg·L-1暴露組的文蛤消化盲囊在實(shí)驗(yàn)期間并未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)，而鰓絲則從第3天明顯高于對照組(P<0.05)，且一直上升；0.10 mg·L-1暴露組的文蛤消化盲囊從第3天開始明顯高于對照組(P<0.05)，然后一直上升，而鰓絲則從第1天開始明顯高于對照組(P<0.05)，在第6天達(dá)到最高值，隨后下降，但未低于對照組的水平；在0.25 mg·L-1暴露組，文蛤消化盲囊從第1天開始明顯高于對照組(P<0.05)，在第6天達(dá)到最高，然后下降，最后階段仍然高于對照組的水平，而鰓絲則在第3天達(dá)到最高值，隨后下降，在第15天明顯低于對照組(P<0.05)。

圖5 鎘離子對文蛤消化盲囊GST酶活性的影響

圖6 鎘離子對文蛤鰓絲GST酶活性的影響

圖7和圖8分別為鎘暴露下四角蛤蜊消化盲囊和鰓絲GST酶活性變化圖。0.05 mg·L-1暴露組的四角蛤蜊消化盲囊和鰓絲分別從暴露后第3天和第1天明顯高于對照組(P<0.05)，且一直上升； 0.10 mg·L-1處理組的四角蛤蜊消化盲囊從第1天明顯高于對照組(P<0.05)，在第3天達(dá)到最高，隨后下降，在第15天明顯低于對照組(P<0.05)，而鰓絲則在第1天明顯高于對照組(P<0.05)，然后下降，從第6天開始明顯低于對照組(P<0.05)；0.25 mg·L-1處理組的四角蛤蜊消化盲囊在第3天達(dá)到最高值然后下降，從第10天開始顯著低于對照組(P<0.05)，而鰓絲則從暴露實(shí)驗(yàn)第1天開始就明顯低于對照組(P<0.05)，一直下降。

圖7 鎘離子對四角蛤蜊消化盲囊GST酶活性的影響

圖8 鎘離子對四角蛤蜊鰓絲GST酶活性的影響

3 討論

3.1 鎘暴露對文蛤和四角蛤蜊行為指標(biāo)的影響

截止目前，關(guān)于環(huán)境因素對貝類代謝行為指標(biāo)影響有一定研究，一般認(rèn)為，相關(guān)環(huán)境因子變化可以導(dǎo)致其濾食和耗氧指標(biāo)的下降[17-18,29]，而針對具體污染物對文蛤和四角蛤蜊行為指標(biāo)影響的研究相對較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明文蛤和四角蛤蜊在鎘暴露下，其行為指標(biāo)整體呈現(xiàn)下降趨勢，且濃度越高，暴露時(shí)間越長，下降越明顯，目前有研究發(fā)現(xiàn)在二氧化鈦等有毒物質(zhì)作用下，貝類的濾食率和耗氧率同樣呈現(xiàn)下降趨勢[30-31]，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果類似，另據(jù)報(bào)道，貝類濾食率和耗氧率下降的主要是由于機(jī)體主動(dòng)降低其能量消耗而導(dǎo)致[32]。本實(shí)驗(yàn)文蛤的兩個(gè)行為指標(biāo)被抑制的時(shí)間點(diǎn)明顯晚于四角蛤蜊，且四角蛤蜊在暴露時(shí)間相同的情況下，相比對照組的下降幅度更大，說明四角蛤蜊的耗氧和濾食行為受到的影響更明顯。耗氧率指標(biāo)在個(gè)別濃度組沒有變化或相對濾食率被抑制時(shí)間點(diǎn)滯后，說明兩種蛤?yàn)V食行為能更早體現(xiàn)出機(jī)體對鎘暴露的反應(yīng)，有研究認(rèn)為在毒物作用下貝類可以首先通過主動(dòng)降低其攝食量來降低對污染物的攝入或者在神經(jīng)系統(tǒng)的控制下，貝類鰓絲部位肌肉收縮和纖毛擺動(dòng)行為發(fā)生變化導(dǎo)致其濾食行為變化更明顯[33-35]，可以進(jìn)一步導(dǎo)致貝類鰓絲耗氧和清除食物顆粒的能力下降。另外有研究表明，貝類行為指標(biāo)變化與體內(nèi)某些功能酶活力變化也具有一定的關(guān)系，有研究發(fā)現(xiàn)AChE酶活性的抑制和行為指標(biāo)的抑制具有協(xié)同性[36]，所以結(jié)合體內(nèi)某些代謝酶活性和行為指標(biāo)的變化來判別貝類受影響的程度更全面，而本研究則結(jié)合了谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的變化來闡述與蛤行為指標(biāo)變化的關(guān)系。

3.2 鎘暴露對文蛤和四角蛤蜊組織GST活性的影響

生物機(jī)體對污染物解毒的第一步是生物轉(zhuǎn)化，分為相I和相II兩個(gè)過程，其中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)為相II過程中的關(guān)鍵酶，可以促進(jìn)一級代謝物與谷胱甘肽(GSH)結(jié)合，使其變成親水性物質(zhì)進(jìn)一步解毒[37-39]，有較多的研究發(fā)現(xiàn)，GST酶活性在污染物的作用下會(huì)呈現(xiàn)升高現(xiàn)象，以提升機(jī)體的解毒代謝能力[40-41]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，除文蛤消化盲囊在0.05 mg·L-1處理組GST酶活性無變化之外，其余組織在低濃度組或者高濃度組的開始階段呈現(xiàn)上升趨勢，說明兩者在低濃度Cd2+或者高濃度Cd2+短時(shí)間影響下，有能力提升GST酶活性以解毒一級代謝物，此時(shí)機(jī)體受到的毒害效應(yīng)較低。但是在高濃度組后期，GST酶活性明顯下降，且最后階段均接近或明顯低于對照組，這說明文蛤消化盲囊利用GST酶進(jìn)行解毒的能力較強(qiáng)，鰓絲受到的毒害影響較為明顯，特別是四角蛤蜊鰓絲GST酶活性在0.25 mg·L-1濃度組全程被抑制，之前有較多的研究也發(fā)現(xiàn)雙殼貝類在高濃度污染物或長時(shí)間的作用下明顯被抑制的情況[38,40]，對比可見，兩種蛤的鰓絲GST被抑制的時(shí)間點(diǎn)都早于消化盲囊，鰓絲受到的毒性作用更明顯，這說明兩種組織特別是鰓絲由于污染物或者其一級代謝物不能及時(shí)清除，積累逐漸增多反而導(dǎo)致兩種組織GST酶被抑制。

3.3 鎘暴露影響下兩種蛤受影響規(guī)律對比及各指標(biāo)關(guān)系探討

通過分析，文蛤和四角蛤蜊濾食率和耗氧率均隨時(shí)間整體呈現(xiàn)下降趨勢，且鎘離子暴露濃度越高，下降越明顯，而四角蛤蜊受抑制的程度更顯著，兩種蛤的行為指標(biāo)變化敏感度存在一定的差異，結(jié)合實(shí)驗(yàn)期間兩種蛤外部行為變化也可以看出，四角蛤蜊在0.25 mg·L-1濃度組或者長時(shí)間鎘暴露下，其入水管萎縮程度較文蛤明顯，四角蛤蜊攝食行為受阻顯著；0.05 mg·L-1處理組的文蛤消化盲囊GST酶活性并無變化，而四角蛤蜊則明顯上升，且在其它濃度組，四角蛤蜊酶活性上升開始時(shí)間點(diǎn)和被抑制時(shí)間點(diǎn)都較文蛤早，上升幅度和被抑制幅度相對文蛤顯著，所以高濃度Cd2+影響下四角蛤蜊的生物轉(zhuǎn)化功能受到了更明顯的影響，兩種蛤?qū)χ亟饘俚慕舛敬x存在差異，根據(jù)報(bào)道，不同貝類對于重金屬的積累和代謝有差異主要跟每個(gè)種類消化吸收率、同化利用率和釋放速率存在差異有關(guān)[42-43]，且不同種類的解毒策略包括抗氧化酶系統(tǒng)、溶酶體與金屬硫蛋白(metallothioneins，MT)結(jié)合等功能有所不同[44]，文蛤?qū)︽k的解毒功能強(qiáng)于四角蛤蜊。

本實(shí)驗(yàn)兩種蛤行為指標(biāo)和GST酶活性的變化趨勢對比可知，行為指標(biāo)數(shù)據(jù)整體呈現(xiàn)下降趨勢，但是GST酶活性在某些濃度組和時(shí)間段則呈現(xiàn)上升趨勢，說明兩種蛤首先通過主動(dòng)降低攝食率和耗氧量來減少Cd2+的攝入，然后在低濃度或者高濃度的開始階段，則可以通過生物轉(zhuǎn)化酶的上升來促進(jìn)進(jìn)入體內(nèi)的Cd2+的轉(zhuǎn)化，而在高濃度長時(shí)間影響下，機(jī)體受鎘影響的毒性反應(yīng)較為明顯，此時(shí)文蛤和四角蛤蜊耗氧率和攝食率的下降則可能是一種被動(dòng)的反應(yīng)，機(jī)體GST酶活性受到嚴(yán)重抑制，兩種蛤已經(jīng)不能完全通過主動(dòng)保護(hù)性行為來降低Cd2+的攝入，此時(shí)GST酶活性、耗氧率和濾食率都呈現(xiàn)明顯的被抑制狀態(tài)，機(jī)體受到的損傷較為嚴(yán)重，所以文蛤和四角蛤蜊在Cd2+影響下，其主動(dòng)解毒、被動(dòng)受毒害時(shí)間點(diǎn)以及能應(yīng)對解毒的Cd2+濃度范圍可以在后期做進(jìn)一步的研究確定。