陳 均， 高 揚， 蘇香楠， 于 亮,2△

(1. 北京體育大學運動人體科學學院， 北京 100084； 2. 北京體育大學體能訓練學院， 北京 100084)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥疾病，當發(fā)生在下肢時臨床特征為間歇性跛行、嚴重肢體缺血[1]，并伴有運動能力降低、骨骼肌功能受損[2,3](如收縮功能下降)等[4]。研究已證實，AS小鼠表現(xiàn)為運動能力下降、心肌/平滑肌肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣調(diào)控失衡以及鈣調(diào)控釋放蛋白蘭尼定受體(Ryanodine receptor，RyR)[5,6]和回收蛋白肌漿網(wǎng)鈣ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)[7]表達異常，而有氧運動可逆轉(zhuǎn)心肌肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣紊亂[8]以及相應(yīng)的鈣調(diào)控蛋白。目前未見有氧運動對AS小鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白RyR及SERCA的影響報道。此外，越來越多的研究表明，載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)在AS發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。作為血漿脂蛋白的重要構(gòu)成，ApoE是細胞表面的一類脂蛋白受體(如LDL受體)的配體，而ApoE缺失可導(dǎo)致循環(huán)血液中膽固醇積累進而誘發(fā)AS，并在此基礎(chǔ)上予以高脂膳食喂養(yǎng)可以進一步加速AS形成[4]。然而，目前鮮有AS對骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白的影響的相關(guān)報道?；诖?，本研究選取ApoE敲除小鼠作為研究對象，從骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白的角度入手，探討六周有氧運動對ApoE敲除小鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

采用健康25只9周齡ApoE敲除小鼠(ApoE knockout mice，ApoE KO)和10只野生型C57BL/6J小鼠(wild type mice，WT)作為本實驗的研究對象，購于北京維通利華實驗技術(shù)有限公司(SCXK(京)2016-0006)，體重為(25±0.6)g。

ApoE KO鼠和WT鼠各隨機分為三組：野生鼠組(WT)、ApoE敲除鼠喂高脂鼠組(KO)、ApoE敲除鼠喂高脂+有氧運動鼠組(KE)，每組10只。其中高脂飼料的成分：脂肪含量為21%(w/w)，膽固醇含量為1.5%(w/w)，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司；普通飼料的成分：脂肪含量為4～5%(w/w)，無膽固醇，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

所有動物飼養(yǎng)于北京體育大學科研中心小鼠飼養(yǎng)室內(nèi)，分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只。小鼠房溫度維持在20～25℃，相對濕度維持在50%～70%，小鼠房提供模擬自然光照，周期為每天12 h，并保證小鼠的自由進食和飲水。本次實驗方案被北京體育大學運動倫理委員會所批準。

1.2 運動方案

安靜組小鼠正?；\中活動，運動組小鼠先進行1周適應(yīng)性跑臺訓練，方案為：坡度0°，跑速12 m/min，持續(xù)時間15 min/d，運動頻率每周5 d。

最大跑速測試方案 5只用于測定最大跑速的小鼠及有氧訓練組小鼠在測試及運動訓練前均進行3 d的適應(yīng)性訓練。

5只ApoE-/-小鼠在跑步機上進行最大跑速測試。測試方案為：初始速度為4.8 m/min，坡度為0°，持續(xù)5 min后，每3 min速度增加1.2 m/min，直至小鼠力竭。判斷標準為小鼠在電網(wǎng)上連續(xù)停留3 s以上或接受100次電擊[9]。最大跑速的測試結(jié)果為(27.0±2.4)m/min。

有氧運動正式訓練方案：速度為最大跑速的40%(10.8 m/min)，運動強度持續(xù)時間40 min/d，運動頻率每周3 d，共持續(xù)6周。

1.3 取材

所有小鼠取材均在最后一次運動結(jié)束后休息至少48 h后進行，小鼠麻醉后經(jīng)心臟穿刺取血并脫頸處死，立即取小鼠雙側(cè)腿部腓腸肌，迅速稱量，取約100 mg，然用錫紙包裹，標記，立刻投入液氮中。然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，保存待用。

1.4 骨骼肌蛋白提取

將100 mg骨骼肌加入800 μl裂解液A(已加入EDTA)中，勻漿機高速充分勻漿；于冰上靜置10 min，渦旋振蕩5 s，再于冰上靜置10 min，渦旋振蕩5 s，15 000 r/min，4℃離心10 min；取上清液于離心管中，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 組織Ca2+含量測定

根據(jù)鈣(Ca)測試盒(C004-2-1)說明書，準確稱取組織含量(50 mg)按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入9倍體積的去離子水，冰水浴勻漿， 2 500 r/min，離心10 min，取10%的勻漿上清液待測，加入工作液，酶標儀(BIO-RAD，USA)測定吸光度計算出組織中Ca2+含量。根據(jù)以下計算公式：

注：單位為：mmol/gprot

1.6 Western blot測定骨骼肌蛋白表達

采用美國Pierce公司生產(chǎn)的蛋白濃度試劑盒，BCA方法測定骨骼肌的蛋白濃度。以上樣蛋白量20 μg為一次上樣量，根據(jù)測定的蛋白濃度計算蛋白上樣量。采用美國life technologies公司生產(chǎn)的Bolt 3%～8%Bis-Tris Plus凝膠(用于測定RyR)以及Bolt 4%～12%Bis-Tris Plus凝膠，電泳分離目的蛋白(RyR、CaM、CaMKⅡ、SERCA1)及內(nèi)參(β-actin)，而后采用美國Invitrogen公司的iBlot2進行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃一抗搖床過夜。一抗稀釋比例為：RyR(1∶200，SC-376507)、CaM(1∶500，SC-5537)、CaMKⅡ(1∶500，SC-9035)、SERCA2(1∶1 000，SC-365098)以及內(nèi)參蛋白β-actin(1∶ 1 000，SC-47778)。次日以1×TBST洗3次，每次10 min。加二抗(RyR(1∶2 000)，CaM(1∶2 000)，CaMKⅡ(1∶2 000)，SERCA2(1∶3 000)，β-actin(1∶2 500))室溫孵育1 h，然后用1×TBST洗3次，每次10 min。洗膜后，加入發(fā)光液(Thermo 34095)，曝光結(jié)果采用Image Lab軟件讀取條帶積分灰度值，結(jié)果用以下公式計算的比值表示。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 6周有氧運動對ApoE-/-小鼠骨骼肌Ca2+濃度的影響

與WT組相比，KO組Ca2+濃度顯著性降低(WT組Ca2+濃度為(0.052±0.012)mmol/g prot，KO組Ca2+濃度為(0.028±0.007)mmol/g prot，P<0.01)，然而KE組Ca2+濃度無明顯變化。但是，與KO組相比，KE組Ca2+濃度明顯升高，KE組Ca2+濃度為 (0.045±0.013)mmol/g prot，P<0.01)。

2.2 6周有氧運動對ApoE-/-小鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣釋放蛋白表達的影響

通過Western blot發(fā)現(xiàn)，如表1、圖1所示，與WT組相比，KO組骨骼肌RyR蛋白表達顯著降低(P<0.01)，KE組骨骼肌RyR蛋白表達雖有下降趨勢但無顯著差異。KE組與KO組相比，骨骼肌RyR蛋白表達無明顯變化。

由表1、圖1可知，與WT組相比，KO組和KE組骨骼肌CaM蛋白的表達均無明顯變化。與KO組相比，KE組骨骼肌CaM蛋白表達雖有降低趨勢但無顯著性。

如表1、圖1所示，KO組與WT相比，骨骼肌CaMKⅡ蛋白表達顯著低(P<0.05)。與KO組相比，KE組CaMKⅡ蛋白的表達無顯著性變化。

Tab. 1 Mice skeletal muscle SR calcium releasing protein expression n=10)

Fig. 1 Mice skeletal muscle SR calcium releasing protein expression

2.3 6周有氧運動對ApoE-/-小鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣回收蛋白表達的影響

通過Western blot發(fā)現(xiàn)，如表2、圖2所示，與WT組比較，KO組骨骼肌SERCA1和SERCA2蛋白表達均明顯降低(P<0.01)。KE組與KO組相比，骨骼肌SERCA1和SERCA2蛋白的表達均顯著增加(P<0.05)。

Tab. 2 Mice skeletal muscle SR calcium uptake protein expression n=10)

Fig. 2 Mice skeletal muscle SR calcium uptake protein expression

3 討論

機體細胞得以維持正常生理功能的基礎(chǔ)鈣離子濃度穩(wěn)態(tài)有關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，Ca2+在AS中扮演重要作用，但Ca2+在疾病發(fā)病機制中的具體機制仍不清楚，尚待進一步研究。Van等[10]以4周齡ApoE-/-小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠心肌細胞內(nèi)Ca2+含量無明顯變化。本研究結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠經(jīng)6周高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌Ca2+濃度明顯降低。與Van等研究結(jié)果不一致，本實驗采取6周高脂膳食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，而Van等的實驗經(jīng)過4周干預(yù)且組織類型為心肌，因此，推測造模時間以及組織類型差異對骨骼肌Ca2+濃度有影響。此外，目前關(guān)于AS中骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+之間關(guān)系的報道尚少，相關(guān)機制仍不明確，故未來可深入探究。

眾所周知，運動作為一種新的防治AS的有效手段，正逐漸受到學者關(guān)注。研究已證實，運動訓練能夠通過預(yù)防肌萎縮，繼而改善骨骼肌氧化能力引起的毛細血管稀疏以及降低心衰小鼠的氧化應(yīng)激，從而逆轉(zhuǎn)外周動脈引起的骨骼肌肌?。淮送?，運動還可以預(yù)防心血管疾病患者的Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)[8]，但相關(guān)機制仍不明確。越來越多的研究表明，在心肌/骨骼肌中，有氧運動訓練能夠增加心衰小鼠的心臟收縮力，并改善Ca2+穩(wěn)態(tài)，推測可能是參與了肌漿網(wǎng)Ca2+釋放(不同的DHPR亞基和RyR)和再攝取(SERCA和NCX)蛋白表達顯著降低有關(guān)[11]。本實驗研究結(jié)果顯示，6周有氧運動對ApoE-/-小鼠高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌Ca2+濃度顯著升高。目前，關(guān)于運動對動脈粥樣硬化中Ca2+相關(guān)調(diào)控機制仍不清楚，需要進一步的探索研究。

肌漿網(wǎng)鈣釋放蛋白主要由RyR通道蛋白構(gòu)成，在哺乳動物中表達的RyR有三種類型：RyR1、RyR2和RyR3。其中，RyR1在骨骼肌中表達；RyR2在心肌中廣泛表達；RyR3在多種組織(神經(jīng)系統(tǒng)和膈肌)中以低水平表達。RyR蛋白的活性主要受到細胞溶質(zhì)Ca2+濃度、CaM和CaMKII的影響。CaMKⅡ由鈣結(jié)合鈣調(diào)蛋白(Ca2+/CaM)激活，磷酸化多種底物，協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)Ca2+介導(dǎo)的細胞功能改變，而CaMKⅡ活性受到CaM和Ca2+濃度的共同調(diào)節(jié)[12]。目前，大多數(shù)研究認為AS對肌漿網(wǎng)鈣釋放蛋白表達的影響降低。馮利霞等[5]觀察到ApoE-/-小鼠經(jīng)喂養(yǎng)高脂喂養(yǎng)20周后，ApoE-/-小鼠平滑肌細胞內(nèi)RyR3蛋白表達顯著下降，同時隨著小鼠周齡的延長其RyR3的表達亦降低。但也有部分研究認為AS中RyR蛋白的表達上升。經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)20周后，ApoE-/-小鼠平滑肌RyR3蛋白的表達明顯增加，進而導(dǎo)致AS斑塊的形成，推測可能是由于miR-29b表達下降所引起的[6]。本實驗研究結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠經(jīng)6周高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌RyR蛋白表達明顯降低，與上述研究結(jié)果相一致，盡管組織類型、蛋白亞型有差異，但可能其相關(guān)機制一致。據(jù)前文可知，RyR通道活性受CaMKⅡ和CaM蛋白影響，當ApoE-/-小鼠骨骼肌RyR蛋白表達下降，進而引起RyR通道活性減弱，導(dǎo)致骨骼肌CaMKⅡ蛋白的表達明顯降低；而骨骼肌組織內(nèi)Ca2+濃度的降低，促使骨骼肌CaMKII活性降低，導(dǎo)致肌漿網(wǎng)鈣釋放功能減弱。因此，本實驗結(jié)果顯示，骨骼肌CaMKⅡ蛋白的表達顯著降低，而CaM蛋白表達無明顯變化。故未來可深入探究AS對骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣釋放蛋白的影響。

目前研究已證實長期的有氧運動訓練可以引起心肌/骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生適應(yīng)性變化。與大多數(shù)人的研究一致，認為運動能夠使肌漿網(wǎng)上RyR蛋白表達增加[13]。例如，Bueno等[14]以腎上腺素受體敲除(ARKO)小鼠為研究對象，經(jīng)8周的有氧運動訓練，發(fā)現(xiàn)比目魚肌RyR蛋白表達顯著升高。然而亦有部分文獻報道，M?nttiri等[15]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)15周有氧低強度訓練干預(yù)后，小鼠腓腸肌和股直肌RyR蛋白表達未見明顯變化，可能與機體產(chǎn)生了適應(yīng)性有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，6周有氧運動對ApoE-/-小鼠高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌RyR蛋白表達無明顯變化。與M?nttiri等研究結(jié)果一致，但與Morán研究結(jié)果不一致。可能與運動強度、干預(yù)周期以及研究對象不同而引起的。綜合以上研究結(jié)果，6周有氧運動對ApoE-/-小鼠高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌RyR蛋白表達無明顯變化；此外，骨骼肌CaMKⅡ和CaM蛋白表達均無統(tǒng)計學差異，推測可能與骨骼肌RyR蛋白表達無明顯變化有關(guān)。目前關(guān)于運動與AS模型中骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣釋放蛋白表達之間的研究尚少，相關(guān)機制仍不清晰，故未來可進一步深入研究以厘清二者關(guān)系。

SERCA作為肌漿網(wǎng)上Ca2+的回收通道蛋白，將Ca2+運回肌漿網(wǎng)官腔，從而控制肌漿網(wǎng)中Ca2+的濃度。目前，現(xiàn)有研究集中探討了AS模型中心肌/平滑肌SERCA蛋白的表達。近期研究發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠高脂膳食喂養(yǎng)16周后，ApoE-/-小鼠平滑肌SERCA2b蛋白的表達顯著下降[7]。此外，亦有研究探討了人體AS模型中骨骼肌SERCA蛋白表達之間的關(guān)系。Fodor等[16]以AS股骨截肢患者為研究對象，觀察到骨骼肌SERCA1a蛋白的表達明顯增加。本實驗研究結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠經(jīng)6周高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌SERCA蛋白的表達明顯降低。與上述研究結(jié)果一致[6]，但與Fodor等研究結(jié)果不一致。主要原因與研究對象不同，人體骨骼肌SERCA1a高表達表明在AS缺血性肌肉中存在代償機制[16]。

目前普遍認為，長期的運動訓練能夠明顯增強骨骼肌SERCA蛋白表達。例如，Bueno等[14]以心力衰竭的小鼠為研究對象，經(jīng)過8周的有氧運動訓練后，結(jié)果顯示，小鼠骨骼肌SERCA1/SERCA2蛋白的表達均明顯增加。但急性運動使骨骼肌SERCA蛋白表達降低。丁海麗等[17]觀察到SD大鼠經(jīng)一次性離心運動干預(yù)后，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)比目魚肌SERCA蛋白表達呈降低后逐漸回升趨勢、在0 h、12 h、24 h和48 h均顯著降低。SERCA2分別在慢肌纖維以及心肌中廣泛表達，而SERCA1僅在快肌纖維中特異性表達[18]。因此，運動對骨骼肌SERCA不同亞型的影響機制也存在差異。例如，MELO等[19]以心肌梗塞大鼠為研究對象，經(jīng)10周的有氧運動訓練后，結(jié)果表明，心肌梗塞大鼠SERCA2蛋白的表達顯著增加，進而恢復(fù)了心肌梗塞大鼠心室舒張功能，推測可能長期的耐力訓練可以引起microRNA-1和microRNA-214的表達來調(diào)節(jié)心肌梗塞大鼠SERCA2a蛋白表達。也有研究報道了不一致的結(jié)果，Morissette等[20]進一步觀察到AMPKα2激酶轉(zhuǎn)基因小鼠心肌SERCA2明顯增加，提示，運動誘導(dǎo)的心肌SERCA2a蛋白變化可能依賴于AMPKα功能。本實驗研究結(jié)果顯示，6周有氧運動對ApoE-/-小鼠高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌SERCA1/SERCA2蛋白表達明顯增加。但是，目前運動對AS模型中骨骼肌SERCA蛋白表達的報道尚少，鑒于運動調(diào)控AS中骨骼肌SERCA的分子機制仍不明確，故未來可進一步在體內(nèi)、體外實驗上給予佐證，以期為運動訓練防治AS提供有益策略。

綜上所述，高脂膳食可使ApoE敲除小鼠骨骼肌Ca2+濃度降低、肌漿網(wǎng)鈣釋放作用和鈣回收作用減弱，6周有氧運動訓練能夠顯著提高其Ca2+濃度、促進肌漿網(wǎng)鈣回收作用。