楊建林， 田家俊， 張 浩， 陳倩影， 呂亞豐， 曹春雨

(三峽大學醫(yī)學院， 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室， 湖北 宜昌 443002)

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉移與腫瘤細胞中高多胺含量和多胺代謝異常密切相關，因此近年來多胺代謝途徑成為抗腫瘤防治的研究熱點被廣泛重視[1，2]，精胺氧化酶(spermine oxidase, SMO)是多胺代謝途徑中的關鍵酶，對維持細胞中多胺含量和代謝的穩(wěn)態(tài)起重要作用。已有研究報道[3-5]，高表達SMO是多種惡性腫瘤的重要誘發(fā)因素和預后不良的指征，與胃腸癌、前列腺癌和結腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。因此作為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要方向之一，尋找靶向SMO抑制劑受到廣泛關注[6]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，小分子SI-4650作為一種新型SMO抑制劑，能通過有效抑制SMO活性，干擾細胞多胺代謝、耗竭多胺含量等機制發(fā)揮對人非小細胞肺癌A549細胞的抗腫瘤活性[7]。本研究針對人卵巢癌SKVO-3細胞，驗證SI-4650是否能同樣對人卵巢癌SKVO-3細胞發(fā)揮抗腫瘤活性，并探究其相應的機制。為人卵巢癌臨床治療藥物研發(fā)和抗腫瘤研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢腺癌細胞SKVO-3細胞購于上海中國科學院細胞庫，SI-4650 購自荷蘭Specs生物特殊化合物公司，細胞培養(yǎng)相關試劑(DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗等)均購自美國Gibco公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司，凋亡途徑相關蛋白(Bax、Bcl-2)、EMT途徑相關蛋白(Vimentin、E-Cadherin、N-Cadherin)、基質金屬蛋白酶MMP2、MMP9等抗體均購自Proteintech公司， 各類檢測試劑盒(CCK8檢測試劑盒、PI/FITC-Annexin V雙染凋亡檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、JC-1檢測試劑盒)均為上海碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品，Transwell Permeable Supports 為美國Corning公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)和CCK8法檢測細胞增殖

人卵巢癌SKVO3細胞用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%FBS、100 U/ml 青霉素、100 μmol/L鏈霉素)在5%CO2細胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。分別用SI-4650(終濃度0、15、30、60、120 μmol/L)處理細胞24、48、72 h，同時設有無細胞的空白組。按照CCK8試劑盒說明書操作，加入CCK8試劑37℃孵育1 h，450 nm波長處檢測每孔吸光度A值。SKVO-3細胞生長抑制率=[1-(A藥物處理組- A空白組)/(A未加藥組- A空白組)]×100%。

1.3 實驗分組

將對數(shù)生長期SKVO-3細胞隨機分為3組：正常對照組(未加藥)和藥物低、高濃度(根據(jù)上步CCK8實驗結果， SI-4650終濃度分別為30，60 μmol/L)實驗組，每組設置3個復孔，均培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)機制研究實驗。

1.4 化學發(fā)光法檢測細胞中SMO酶活性

化學發(fā)光法直接檢測SKVO-3細胞內SMO的酶活性實驗：參照文獻 [8]，將3個組細胞分別加入甘氨酸溶液(0.083 mol/L, pH 8.0)放置于-80℃冰箱中24 h，低溫高速離心，取相等蛋白質含量的各組細胞上清液，檢測其中酶促反應產(chǎn)物引起的化學發(fā)光物質熒光強度，用相同蛋白質量(mg)和時間(s)內的熒光強度(RLU)表示細胞中SMO酶活性(RLU.mg/(protein.s))。

流式細胞儀檢測SMO酶促反應產(chǎn)物ROS含量實驗：將3個組細胞按照ROS活性氧檢測試劑盒說明書操作，無熒光的DCFH-DA進入細胞，經(jīng)胞內的酯酶水解和ROS氧化轉變?yōu)榫哂袩晒獾腄CF，流式細胞儀檢測DFC熒光強度表示細胞內活性氧的含量。

1.5 高效液相色譜法檢測細胞中多胺含量

收集3個組細胞裂解后低溫離心，取相等蛋白含量的各組細胞裂解上清液，用ddH2O補足體積，依次加入10 μl苯甲酰氯、20 μl DAH(1 mmol/L)、500 μl NaOH(2 mol/L)混勻后30℃水浴，加入NaCl飽和溶液終止反應，用乙醚混勻萃取3次，將萃取物用 1 ml甲醇溶解過濾。以Luna C18色譜柱為固定相， 38∶62比例混合的乙腈-水為流動相，254 nm 波長下檢測萃取物的吸光度值，繪制流出曲線。計算單位蛋白質量(mg)中多胺的濃度(μmol)來表示樣品中多胺的含量(μmol.mg/protein)。

1.6 Trabswell法檢測細胞侵襲、遷移

將3個組細胞用DMEM培養(yǎng)基(含0.2% BSA)重懸。24孔細胞培養(yǎng)板中加入800 μl/well的DMEM培養(yǎng)基(含20% FBS)，將檢測遷移能力的Transwell小室和檢測侵襲能力鋪有基質膠的Transwell小室放入24孔板中，并分別加入收集的3個組細胞，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18 h，將小室依次多聚甲醛(4%)固定，結晶紫染色，擦除膜內側細胞并洗滌后，倒置顯微鏡下觀察穿過小室膜孔的細胞并拍照。

1.7 PI單染流式細胞術法檢測細胞周期

將3個組細胞分別用PBS配置的 75%乙醇固定過夜，離心收集細胞，加入500 μl PBS(0.1% TritonX-100、50 μg/L Rnase、0.02 g/L PI)重懸細胞，避光孵育30 min，流式細胞儀檢測處于不同細胞周期的細胞比例。

1.8 PI/FITC-Annexin V雙染流式細胞術法檢測細胞凋亡

流式細胞術檢測凋亡細胞率實驗：收集3個組細胞，按照PI/FITC-Annexin V試劑盒說明書，每樣品中加入5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

流式細胞術檢測線粒體膜電位實驗：按照JC-1試劑盒說明書操作，當細胞線粒體膜電位由強變弱時，原本聚集在線粒體基質中的JC-1聚合物解聚，以單體形式出現(xiàn)細胞中，發(fā)出綠色熒光。通過檢測單體JC-1綠色熒光強度可確定線粒體膜電位的變化。

1.9 Western blot法檢測細胞凋亡、侵襲遷移相關蛋白表達水平

收集3個組細胞裂解離心后，取相等蛋白含量的各組細胞裂解上清液，經(jīng)電泳、電轉印，5%脫脂牛奶封閉后，用目的蛋白抗體孵育PVDF膜結合過夜，再加入對應二抗孵育2 h，化學發(fā)光法顯影拍照并灰度分析，目的蛋白灰度/β-actin蛋白灰度表示目的蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 SI-4650對SKVO-3細胞增殖的影響

細胞增值實驗結果顯示(表1)，隨SI-4650劑量增加和時間的延長，對SKVO-3細胞增殖抑制效率逐漸增加(P<0.01)。SI-4650處理SKVO-3細胞48 h，計算其IC50值為(68.13±5.48)μmol/L。因此在后續(xù)實驗中設定，SI-4650終濃度為30 μmol/L(低濃度實驗組)和60 μmol/L(高濃度實驗組)處理48 h的SKVO-3細胞為實驗組，以未加藥細胞(以0 μmol/L SI-4650表示)為正常對照組。

Tab. 1 Effects of SI-4650 on the proliferation rate of SKVO-3 cells(%,ˉ n=3)

2.2 SI-4650對SKVO-3細胞SMO酶活性的影響

HPLC分析表明，對照組中未檢測到SI-4650，實驗組中隨培養(yǎng)基中SI-4650濃度的增加，SKVO3細胞中SI-4650含量也逐漸增加(P<0.01，表2)。

如表2所示，SI-4650能顯著性抑制SKVO-3細胞中SMO的酶活性，使之從3362.45(RLU)RLU/(mg·s)下降至1413.26(RLU)RLU/(mg·s)。HPLC結果也證實SMO酶促反應產(chǎn)物Spd含量從2.11 μmol/mg顯著減少至0.92 μmol/mg(表3)，流式細胞儀檢測DFC熒光強度下降，也證實另一種酶促反應產(chǎn)物ROS隨SI-4650增加而減少(表2 )。同時可見，細胞中總多胺含量呈濃度依賴性顯著下降(表3)，與對照組相比較，以上結果均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示SI-4650可有效進入SKVO-3腫瘤細胞中，通過抑制SMO酶活性，干擾正常多胺代謝穩(wěn)態(tài)，減少細胞總多胺含量發(fā)揮相應生物學效應。

Tab. 2 Effects of SI-4650 on SMO activity of SKVO-3 n=3)

Tab. 3 Effects of SI-4650 on intracellular polyamine contents of SKVO-3 cells(μmol.mg/protein， n=3)

2.3 SI-4650對 SKVO-3細胞侵襲、遷移能力的影響

Transwell分析結果表明，SI-4650處理后，SKVO-3細胞的侵襲和遷移能力明顯下降(P<0.01，圖1)。細胞上皮細胞間質轉化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)相關蛋白表達水平的分析結果顯示，隨SI-4650濃度增加，SKVO-3細胞中上皮細胞表型標志物鈣粘蛋白(E-cadherin)相對表達量增加，而間質細胞標志物鈣粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)相對表達量明顯減少，基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的相對表達水平也顯著降低(P<0.01，圖2、表4)。提示SI-4650抑制SKVO-3細胞的侵襲、遷移能力，機制可能與抑制SKVO-3細胞上皮細胞間質化進程相關。

Fig. 1 Effects of SI-4650 on invasion and migration of SKVO-3 cells

Fig. 2 Effects of SI-4650 onthe expressions of EMT-related proteins in SKVO-3 cells

2.4 SI-4650對SKVO-3細胞周期的影響

流式細胞術檢測結果表明，SI-4650處理可引起G0/G1期細胞數(shù)量從(50.54±2.17)%減少為 (30.09±1.34)%，而S期細胞數(shù)量從(25.50± 2.04)%明顯增多至(42.12±3.76)%，呈濃度依賴性改變(表5)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示SI-4650可誘導SKVO-3細胞發(fā)生S周期阻滯，抑制細胞增殖。

Tab. 4 Effects of SI-4650 on EMT-related protein expressions of SKVO-3 n=3)

Tab. 5 Effects of SI-4650 on cell cycle of SKVO-3 cells(%, n=3)

2.5 SI-4650對SKVO-3細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測凋亡細胞比例實驗結果表明，SI-4650處理后，隨藥物濃度增高FITC-Annexin V(+)的凋亡細胞比例從0.41%逐漸增多至43.51%(圖3)，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示SI-4650可誘導SKVO-3細胞發(fā)生凋亡。進一步Western blot分析證實(圖4，表6)，SKVO-3細胞中Bax表達上調、Bcl-2表達下調，Bax/Bcl-2比值升高，Caspase3剪切增多，活性小片段c-Caspase3增加，灰度分析差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。此外流式細胞儀檢測SKVO-3細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)結果顯示，隨著SI-4650濃度的逐漸增高，線粒體膜電位逐漸降低(P<0.01，表7)。以上結果提示，SI-4650誘導SKVO-3細胞發(fā)生線粒體依賴的內源性細胞凋亡。

Fig. 3 Effects of SI-4650 on apoptosis of SKVO-3 cells

Fig. 4 Effects of SI-4650 on the expressions of apoptosis-related proteins in SKVO-3 cells

3 討論

在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌由于發(fā)生位置不易覺察，癥狀不明顯，導致患者就診時多為晚期癥狀且出現(xiàn)腫瘤轉移。手術和化療等方式治療后，仍有超過50%患者轉移復發(fā)，五年生存率低于50%[9]。因此急需研發(fā)高效抗人卵巢癌的新型藥物用于臨床治療。

細胞中多胺(polyamine, PA)由精脒(spermidine, Spd)、精胺(spermine, Spm)和腐胺(putrescine, Put)組成，是存在于所有真核細胞中的陽離子烷基胺，對細胞增殖、分化、發(fā)育等重要生理過程至關重要[10]。SMO在多胺代謝途徑中，以Spm為底物，催化產(chǎn)生Spd、3-氨基丙醛和H2O2[11]。研究報道在幽門螺桿菌感染誘發(fā)胃癌的過程中，胃上皮細胞SMO高表達，酶促反應產(chǎn)物3-氨基丙醛轉化成的丙烯醛和H2O2的大量產(chǎn)生是導致細胞DNA受損，成為誘發(fā)胃癌的重要因素；抑制SMO則顯著減弱組織細胞DNA損傷，降低胃癌發(fā)生的幾率[12]。此外，SMO與前列腺癌、結腸癌和肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后均密切相關[3-5]。SI-4650是本課題組前期篩選獲得的一種靶向SMO的新型小分子抑制劑，為探索SI-4650是否具有抗人卵巢癌的藥理學活性及其潛在的臨床應用價值，本研究分析了SI-

Tab. 6 Effects of SI-4650 on apoptosis-related protein expressions and mitochondrial function of SKVO-3 n=3)

4650對人卵巢癌SKVO-3細胞可能的抗腫瘤作用，及其對多胺代謝、細胞周期、誘導凋亡、侵襲和遷移的影響。

結合HPLC、流式細胞儀檢測等實驗結果，本研究首先證實SMO的靶向抑制劑SI-4650能夠進入SKVO-3細胞內，發(fā)揮SMO抑制劑的作用，阻滯SMO催化的酶促反應，導致反應產(chǎn)物Spd和ROS含量下降，以及總多胺含量的減少。但實驗中發(fā)現(xiàn)，SMO 酶促反應底物Spm含量并未升高，反而明顯下降，我們推測由于SI-4650顯著抑制SMO酶活性，干擾多胺代謝正常途徑，打破細胞多胺含量和代謝穩(wěn)態(tài)，從而激活細胞多胺跨膜轉運系統(tǒng)，引起堆積的Spm等多胺成分經(jīng)細胞膜轉運至胞外，更進一步加重細胞中總多胺下降程度，其真正的機制有待進一步研究。鑒于減少細胞中多胺含量可有效抑制腫瘤細胞增殖[13]，本研究進一步探究了SI-4650對SKVO-3細胞增殖作用的影響。CCK8實驗證實，SI-4650顯著抑制人卵巢癌SKVO-3細胞的增殖，處理SKVO-3細胞48 h的IC50值為(68.13±5.48)μmol/L。腫瘤細胞抑制率與SI-4650作用時間和劑量呈正相關性。以上結果提示SI-4650具有高效殺傷人卵巢癌SKVO-3腫瘤細胞的作用，其機制與SI-4650抑制SMO活性，干擾多胺代謝，降低腫瘤細胞中總多胺含量有關。

對SI-4650抗腫瘤機制研究發(fā)現(xiàn)，SI-4650不僅引起SKVO-3細胞S期周期阻滯，同時誘導凋亡抑制蛋白Bcl-2表達減少而促凋亡蛋白Bax表達增加，Bax二聚體在線粒體膜聚集，引起膜通透性增加，線粒體電位降低，從而釋放出線粒體內促凋亡因子，啟動Caspase級聯(lián)反應，剪切活化的c-Caspase-3增加，最終導致細胞凋亡。以上結果與內源性線粒體途徑凋亡特質相一致[14]，提示SI-4650抗腫瘤機制可能還有S期周期阻滯和誘導內源性線粒體途徑凋亡。黃嬌嬌等[15，16]發(fā)現(xiàn)SI-4650對人黑素瘤A375、人結腸癌CT-26細胞的抗腫瘤機制包括細胞凋亡和自噬性死亡，但在本研究中并未見明顯自噬現(xiàn)象，可能與不同腫瘤細胞具有不同的遺傳背景，對SI-4650敏感性差異等相關。

腫瘤細胞向周圍組織浸潤擴散和遠端器官轉移決定其惡性度，也是腫瘤臨床治療的重點和難點。EMT是惡性腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉移的重要病理基礎，與腫瘤細胞侵襲、遷移能力密切相關[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與未使用SI-4650處理細胞相比較，SI-4650處理后，SKVO-3細胞表型更趨向運動能力弱的上皮表型細胞，具體表現(xiàn)為E-cadherin相對表達量增加，N-cadherin、Vimentin相對表達量減少，SKVO-3細胞穿過Transwell膜孔的遷移能力明顯降低；同時細胞合成的基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP9減少，降解細胞外基質的能力減弱，穿過Transwell基質膠膜孔的侵襲能力也顯著下降。提示SI-4650有效抑制SKVO-3細胞侵襲、遷移能力，其機制與SI-4650抑制SKVO3細胞EMT進程相關。有學者研究報道，多胺含量更高的腫瘤細胞可大量合成釋放如：絲氨酸蛋白酶、基質金屬蛋白酶、組織蛋白酶等蛋白酶，進而降解周圍組織，促使腫瘤細胞侵襲遷移，增強腫瘤細胞惡性度[18]。本研究發(fā)現(xiàn)SI-4650抑制SMO酶活性，干擾多胺代謝，降低多胺含量，同時基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9表達顯著下降，與文獻報道相符。因此分析，SI-4650可能通過抑制腫瘤細胞的EMT進程，腫瘤細胞向粘附力強的穩(wěn)定上皮細胞形態(tài)轉化，減弱運動能力，降低腫瘤細胞降解細胞外基質能力的方式，實現(xiàn)高效抑制人卵巢癌SKVO-3細胞侵襲、遷移。

本研究通過體外細胞培養(yǎng)實驗，證實SI-4650靶向性抑制多胺代謝途徑關鍵酶SMO的酶活性，一方面通過干擾多胺代謝，減少腫瘤細胞中多胺含量，抑制腫瘤細胞生長；一方面誘導細胞凋亡直接殺傷腫瘤細胞；同時干擾腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，通過多途徑共同發(fā)揮抗腫瘤作用。與其他抗腫瘤藥物相比較，SI-4650有可能實現(xiàn)更有效的抗腫瘤效應。但SI-4650在機體中是否依舊有效，尚需進一步研究。

綜上所述，本研究證實SI-4650作為一種新型SMO小分子抑制劑，可抑制人卵巢癌SKVO-3細胞的增殖、侵襲和遷移。其機制可能與通過抑制SMO活性、干擾多胺代謝引起的多胺含量減少有關；SI-4650還可將細胞阻滯于S期、誘導內源性線粒體途徑細胞凋亡發(fā)生以及阻滯腫瘤細胞EMT進程，SI-4650在卵巢癌臨床治療上具有潛在的應用價值。