王肖婷， 湯一冰， 林青青， 王新雨， 宋正陽(yáng)， 郝卯林， 錢(qián) 巍， 王萬(wàn)鐵△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035； 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科， 浙江 溫州 325000；3. 杭州臨安區(qū)人民醫(yī)院全科醫(yī)療科， 浙江 臨安 311300)

近年來(lái)，隨著袖式肺葉切除術(shù)和活體肺葉移植等手術(shù)治療的發(fā)展，術(shù)后出現(xiàn)肺缺血/再灌注(lung ischemia /reperfusion，LI/R)引起的遠(yuǎn)端臟器損傷，如腦損傷、腎臟損傷、肝臟損傷等的發(fā)生率正在不斷提高[1]，但目前對(duì)這一現(xiàn)象的研究還很少，其發(fā)生機(jī)制也仍不清楚，因而也尚無(wú)有效的防治手段。細(xì)胞自噬(cell autophagy) 作為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，是指活細(xì)胞在某種條件下，細(xì)胞將自身受損的細(xì)胞結(jié)構(gòu)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)入溶酶體(lysosome) 并自主降解的過(guò)程[2]。有關(guān)在臟器缺血/再灌注損傷中，細(xì)胞自噬所起的作用問(wèn)題近來(lái)備受關(guān)注。據(jù)此，本研究以SD大鼠的肺缺血/再灌注損傷(lung ischemia/reperfusion injury, LI/RI)模型為研究對(duì)象，探索肺缺血/再灌注過(guò)程中肝臟的損傷情況，以及細(xì)胞自噬在其中所起的作用，為日后研究LI/R引起的肝損傷提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，體重(200±20)g，清潔級(jí)，購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為 SCXK(浙)2018-0149。

1.2 主要試劑

二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、水合氯醛購(gòu)于中國(guó)上海生工生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗大鼠 p-AMPK/AMPK 抗體、抗 p-mTOR/mTOR 抗體、抗 LC3II抗體、抗 p62 抗體、抗 beclin-1 抗體和抗 GAPDH 抗體均購(gòu)自 Abcam 公司；山羊抗兔IgG HRP抗體購(gòu)自Biosharp公司。

1.3 大鼠LI/RI模型的構(gòu)建

手術(shù)前腹腔注射5%水合氯醛(10 ml/kg體重)麻醉大鼠后，暴露并切開(kāi)氣管實(shí)施氣管插管，并接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，小動(dòng)物呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為：潮氣量30 ml/kg，呼吸頻率70次/分，吸呼比3∶2，外接100%濃度的氧氣。開(kāi)胸并用微型動(dòng)脈夾夾閉左肺門(mén)，若觀察到左側(cè)肺組織不再膨脹，則可認(rèn)為已夾閉肺門(mén)，以此模擬肺組織缺血缺氧；在夾閉肺門(mén)30 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾，可見(jiàn)左側(cè)肺組織重新膨脹，使左肺再灌注3 h，期間監(jiān)測(cè)大鼠生命體征。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，重新打開(kāi)胸腔，抽取腔靜脈血，取肺組織，濾紙吸凈肺組織表面并稱(chēng)重，記錄重量為濕重(wet weight，W)，之后烘箱70℃烘干24 h后再次稱(chēng)重，記為干重(dry weight，D)，計(jì)算肺組織濕干重比，即W/D作為肺組織損傷及造模是否成功的依據(jù)[3]。之后使用過(guò)量麻藥使大鼠死亡，并取肝臟組織進(jìn)行之后的檢測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

隨機(jī)將大鼠分為4組，每組6只，實(shí)驗(yàn)操作前12 h均禁食禁飲。各組分別作如下處理：(1)假手術(shù)組(sham組)：將大鼠麻醉后，氣管插管并打開(kāi)胸腔，機(jī)械通氣3.5 h后取材檢測(cè)；(2)缺血/再灌注組(I/R組)：見(jiàn)1.3；(3)溶劑組(DMSO組)：根據(jù)稱(chēng)量的體重，術(shù)前1 h腹腔注射與3-MA組等量的DMSO溶液，余操作同I/R組；(4)自噬拮抗劑組(3-MA組)：術(shù)前1 h腹腔注射3-甲基腺嘌呤溶液30 mg/kg(使用DMSO溶解3-MA，使3-MA溶液濃度為30 mg/kg)，余操作同I/R組。

1.5 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

將大鼠處死后，取再灌注側(cè)肺下葉及肝臟下葉，先進(jìn)行組織固定脫水，再通過(guò)浸蠟、包埋、切片、脫蠟等步驟，最后用蘇木素-伊紅(HE)染色并封片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)改變，主要包括肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞形態(tài)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。

1.6 肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

用生理鹽水漂洗后將組織迅速地放在預(yù)冷并滴有固定液的蠟板上，在固定液中用手術(shù)刀片將組織塊修成1 mm×1mm×1mm的立方體組織塊。各組織塊分別經(jīng)過(guò)后固定、塊染、丙酮梯度脫水、浸透、包埋聚合、半薄切片、超薄切片等一系列步驟后，在電鏡下觀察肝細(xì)胞的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，拍照保存。

1.7 肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)水平的檢測(cè)

大鼠在造模完成處死前，抽取腔靜脈血，將標(biāo)本離心分離出血清。取丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒，采用ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶的水平。

1.8 RT-qPCR檢測(cè)肝細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白基因(mRNA)的表達(dá)水平

將肝組織剪成小塊，加入Trizol在冰上裂解5 min。加入約200 μl氯仿后顛倒混勻，低溫高速離心后吸取上層水相。加入等體積異丙醇，顛倒混勻，離心后棄去上清液加入75%乙醇，再次離心后除去乙醇?xì)堃?，收集沉淀即為提取的總RNA。將RNA沉淀溶于30 μl DEPC水中，測(cè)定總RNA濃度并根據(jù)濃度計(jì)算上樣體積，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。引物的設(shè)計(jì)和合成工作由上海捷瑞生物工程有限公司及上海生物工程股份有限公司負(fù)責(zé)(表1)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)和融解曲線(xiàn)，根據(jù)目的基因與內(nèi)參GAPDH基因的Ct值計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

Tab. 1 The sequences of the primers for RT-qPCR

1.9 Western blot法檢測(cè)肝臟組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

將各組肝組織剪碎，在含PMSF的RIPA裂解液中充分裂解，低溫高速離心并收集上層蛋白溶液，后采用BCA蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度。各組測(cè)定濃度后確定上樣量，用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉與一抗二抗孵育、化學(xué)發(fā)光成像等步驟，并使用Image J 軟件對(duì)得到的圖像進(jìn)行分析。將自噬相關(guān)蛋白LC3-B、Beclin 1、p62蛋白條帶的灰度值分別與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶相比，比值作為反映蛋白表達(dá)水平的相對(duì)指標(biāo)。將p-AMPK與AMPK蛋白條帶，p-mTOR與mTOR蛋白條帶灰度值之比反映蛋白磷酸化表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組肺濕/干重比的比較

與Sham組(2.120±0.461)相比，I/R組(5.285±1.187)、DMSO組(5.694±0.727)、3-MA組的肺濕/干重比(4.243±0.626)均有升高(P<0.01)；與DMSO組(5.694±0.727)相比，3-MA組的肺濕/干重比(4.243±0.626)略有下降(P<0.05)。W/D作為反映肺組織損傷程度的指標(biāo),說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的肺缺血/再灌注模型構(gòu)建成功。

2.2 各組肝臟組織光鏡觀察形態(tài)學(xué)的比較

光鏡下可見(jiàn)，Sham組的肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝小葉完整，肝細(xì)胞索排列有序呈輻射狀，肝細(xì)胞形態(tài)正常，未見(jiàn)水腫、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。I/R組、DMSO組的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索結(jié)構(gòu)消失不見(jiàn)，肝細(xì)胞水腫，細(xì)胞間出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死。而3-MA組肝小葉較為完整，仍可見(jiàn)肝索結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞稍有水腫(圖1)。

Fig. 1 HE staining of hepatic tissues in each group(×200, Bar=50 μm)

2.3 各組肝臟組織透射電鏡觀察形態(tài)學(xué)的比較

透射電鏡下可見(jiàn)，Sham組肝細(xì)胞線(xiàn)粒體形態(tài)良好，無(wú)明顯空泡，肝細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完好。而I/R組、DMSO組有較多線(xiàn)粒體出現(xiàn)空泡狀，其中DMSO組可見(jiàn)自噬小體，細(xì)胞損傷也較重。3-MA組自噬體形成明顯受到抑制，肝細(xì)胞損傷也相對(duì)較輕(圖2)。

Fig. 2 Hepatic cell ultrastructure of each group under electron microscopy(×15 000, Bar=0.5 μm)

2.4 各組谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶水平的比較

與Sham組相比，I/R組、DMSO組、3-MA組的ALT和AST水平均升高顯著 (P<0.05)；而I/R組、DMSO組間的ALT和AST水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；相較于DMSO組，3-MA組的ALT水平有所下降(P<0.05)。即缺血/再灌注時(shí)肝細(xì)胞損傷可能加重(表2)。

Tab. 2 Theserum levels of ALT and AST in each group (U/L， n=6)

2.5 各組肝臟組織自噬相關(guān)基因(mRNA)表達(dá)的比較

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R、DMSO、3-MA三組肝臟組織的AMPK、Beclin 1和LC3 mRNA表達(dá)均有增多，而mTOR和p62 mRNA表達(dá)降低(P<0.05或P<0.01)；I/R和DMSO組相比，兩組間AMPK、Beclin 1、LC3、mTOR和p62 mRNA的表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與DMSO組相比，3-MA組的AMPK、Beclin 1和LC3 mRNA表達(dá)顯著下降，而mTOR和p62 mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05或P<0.01，表3)。

2.6 各組肺組織自噬相關(guān)蛋白水平的比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組相比，AMPK蛋白磷酸化水平和Beclin 1、LC3-B蛋白表達(dá)在其余各組肝臟組織中均明顯升高，mTOR蛋白磷酸化水平和p62蛋白表達(dá)則顯著下降(P<0.05或P<0.01)；I/R組與DMSO組比較，各蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)；與DMSO組相比，AMPK蛋白磷酸化水平和Beclin 1、LC3-B蛋白表達(dá)在3-MA組中顯著下降，mTOR蛋白磷酸化水平和p62蛋白表達(dá)有明顯上升(P<0.05或P<0.01，圖3、表4)。

Fig. 3 The protein expressions of LC3-B and Beclin 1 in hepatic tissue and the protein phosphorylation levels of AMPK, mTOR and p62 in each group

3 討論

隨著肺移植、心臟外科手術(shù)體外循環(huán)、心肺復(fù)蘇以及肺外科中單側(cè)肺循環(huán)阻斷技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，肺缺血/再灌注(lung ischemia/reperfusion，LI/R)的發(fā)生率正顯著提高，其?？梢鸲喾N不良后果，包括低氧血癥及急性呼吸功能衰竭等[4]。LI/RI的發(fā)生涉及到了多重細(xì)胞及分子機(jī)制。最新研究表明，無(wú)菌性免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、補(bǔ)體或纖維蛋白激活、內(nèi)皮功能異常等[5,6]在肺缺血/再灌注損傷中起到重要作用。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)， LI/R與細(xì)胞壞死和程序性凋亡亦有相關(guān)性，細(xì)胞或程序性死亡及其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)也正被廣泛研究。

LI/R除了直接損傷肺臟外，還可通過(guò)某些機(jī)制影響遠(yuǎn)端臟器。臨床上觀察到，肺缺血/再灌注不僅僅是一個(gè)局部事件，在造成肺臟本身?yè)p傷的同時(shí)，還可通過(guò)全身循環(huán)影響遠(yuǎn)端器官，包括腦、心肌、腎臟、肝臟等損傷[7,8]

肝和肺都是人體中非常重要的器官，肝臟作為“生化工廠(chǎng)”，承擔(dān)著代謝、解毒、分泌膽汁、免疫及凝血等多種功能，而肺進(jìn)行氣體交換，維持人體一系列的生命活動(dòng)。在人體中，肝與肺互相調(diào)節(jié)，共同維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，而當(dāng)某疾病發(fā)生時(shí)，肝與肺又會(huì)互相影響，參與并推動(dòng)疾病的病理生理過(guò)程。 肝臟的疾病如肝肺綜合征(HPS)、肝源性膿毒血癥等[9]會(huì)引起肺功能紊亂，同樣的，肺臟的疾病如ARDS，甚至是最近研究的熱點(diǎn)新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)[10,11]，亦都會(huì)對(duì)肝臟造成損傷。而對(duì)于LI/R引起的肝臟損傷，目前的研究認(rèn)為其機(jī)制可能是過(guò)量的活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 引發(fā)氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致急性炎癥反應(yīng)，其誘因與腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 、白細(xì)胞介素-1 (IL-1) 、白細(xì)胞介素-6 (IL-6) 等細(xì)胞因子有關(guān)，其特點(diǎn)是中性粒細(xì)胞的活化和大量活性氧的釋放[12]，但相關(guān)的研究還較少，因而深入的研究可能對(duì)尋找有效的防治措施具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

Tab. 3 The mRNA expressions of LC3, Beclin 1, AMPK, mTOR and p62 in each group

本研究依據(jù)文獻(xiàn)構(gòu)建大鼠的LI/R模型，通過(guò)該模型測(cè)定肝臟的相關(guān)指標(biāo)，可反映肺缺血/再灌注時(shí)肝臟發(fā)生的相關(guān)變化。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)大量存在于肝臟內(nèi)。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，ALT和AST會(huì)從細(xì)胞中釋放并導(dǎo)致血液中該兩項(xiàng)指標(biāo)迅速上升，因此測(cè)定ALT和AST水平可反映肝臟組織的受損情況。本實(shí)驗(yàn)中3-MA組的ALT和AST水平均較低，說(shuō)明自噬拮抗劑3-MA可減輕肝臟組織的受損情況。光鏡和透射電鏡的結(jié)果也表明，肺缺血/再灌注在引起肺組織損傷的同時(shí)，也的確可引起肝臟組織的損傷。

在缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, I/RI)中，細(xì)胞自噬被認(rèn)為起到雙向調(diào)控的作用[13]。適度的自噬增強(qiáng)可為細(xì)胞提供能量，但若再灌注損傷超過(guò)細(xì)胞承受范圍，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]。當(dāng)細(xì)胞在應(yīng)激時(shí)自噬會(huì)被激活, 如缺血和缺氧, 在這些條件下抑制自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加。相反, 誘導(dǎo)自噬可以保護(hù)動(dòng)物免受缺血/再灌注損傷。研究表明，大鼠缺血/再灌注肺損傷時(shí)細(xì)胞自噬作用增強(qiáng)[15]。在肝臟組織，由于自噬調(diào)節(jié)過(guò)程的機(jī)制復(fù)雜，其與肝、I/RI之間的具體作用關(guān)系仍存在著矛盾與爭(zhēng)議[16]。AMP依賴(lài)的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR) 作為自噬信號(hào)通路的上游調(diào)控蛋白，可分別誘導(dǎo)和抑制自噬的發(fā)生[17,18]。本研究中，經(jīng)肺缺血/再灌注處理的實(shí)驗(yàn)組AMPK mRNA和蛋白磷酸化水平上升，而mTOR則為相反趨勢(shì)；Beclin 1作為Beclin 1-PI3K class III通路中的重要蛋白，也在自噬啟動(dòng)階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，而本研究中的3-甲基腺嘌呤(3-MA)即是通過(guò)抑制ClassIII-PI3K的活性來(lái)抑制自噬[19,20]。除此之外，自噬效應(yīng)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)作為自噬的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)水平可有效反映細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量，是與自噬發(fā)生的程度呈正相關(guān)性的自噬體標(biāo)志物之一[21,22]。p62也是自噬溶酶體系統(tǒng)蛋白降解過(guò)程中的重要蛋白之一，在自噬的過(guò)程中，p62被不斷消耗，因此其表達(dá)與細(xì)胞自噬的活性呈負(fù)相關(guān)。在本研究中，將其亦作為檢測(cè)自噬水平的關(guān)鍵指標(biāo)[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肺缺血/再灌注會(huì)引起肝臟組織中Beclin 1、 LC3 mRNA表達(dá)增加，對(duì)應(yīng)的自噬正性蛋白Beclin 1、LC3-B蛋白的表達(dá)也有上升， 而p62 mRNA和p62蛋白水平下降，說(shuō)明肺缺血/再灌注會(huì)引起肝組織細(xì)胞自噬水平上升；而應(yīng)用自噬抑制劑3-MA后，可觀察到自噬被抑制，同時(shí)肝細(xì)胞損傷情況有所改善。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，DMSO可通過(guò)自噬誘導(dǎo)減少肝細(xì)胞脂質(zhì)積累，并認(rèn)為DMSO可能通過(guò)抑制激活轉(zhuǎn)錄因子(activating transcription factor 4，ATF4)表達(dá)來(lái)激活自噬，但存在時(shí)間和劑量依賴(lài)性[24]。本實(shí)驗(yàn)中，DMSO組與I/R組各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)明顯差異，故可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中的DMSO濃度尚不足以影響其對(duì)自噬的調(diào)節(jié)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠LI/R模型，證實(shí)在大鼠肺組織發(fā)生缺血/再灌注時(shí)，會(huì)誘發(fā)肝臟組織損傷并出現(xiàn)自噬的高表達(dá)；而抑制自噬后，可減輕肺缺血/再灌注帶來(lái)的肝臟組織損傷。在缺血/再灌注損傷過(guò)程中，如何適當(dāng)干預(yù)自噬調(diào)控通路，從而有效保護(hù)細(xì)胞，減輕損傷，是我們今后研究工作努力的方向。