唐 盼，劉 渤

400016 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科

椎間盤(pán)退變是年齡相關(guān)性疾病，并在遺傳因素、吸煙、感染、異常力學(xué)負(fù)荷、椎體終板營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸減少等誘因刺激下進(jìn)行性加重。異常炎癥被認(rèn)為是椎間盤(pán)退變的重要原因，胞外誘因刺激下，髓核細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥因子如IL-1β和TNF-α，經(jīng)過(guò)NF-κB及MAPK通路激活如P65、ERK、JUNK等內(nèi)信號(hào)分子，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起聯(lián)級(jí)的擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，促使髓核細(xì)胞發(fā)生不可逆的改變，并伴隨過(guò)度的髓核細(xì)胞凋亡、衰老、自噬改變。此外，炎性通路的激活促進(jìn)金屬基質(zhì)蛋白酶表達(dá)增加，如MMP3、MMP13、ADAMTS4、ADAMTS5，導(dǎo)致胞外親水基質(zhì)的減少以及纖維環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞，從而導(dǎo)致椎間盤(pán)退變甚至髓核突出，造成慢性疼痛，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。

鋅指蛋白A20是一種內(nèi)源性保護(hù)蛋白，其可通過(guò)A20自身的去K-63泛素酶及K-48泛素酶對(duì)同一底物實(shí)行去泛素化及泛素化實(shí)現(xiàn)負(fù)反饋地抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路的傳導(dǎo)，在炎癥疾病領(lǐng)域受到密切關(guān)注。本課題組的前期研究揭示，A20對(duì)髓核細(xì)胞具有內(nèi)源性的保護(hù)作用，減弱LPS刺激引起的炎癥信號(hào)NF-κB過(guò)度激活、傳導(dǎo)及相關(guān)親水基質(zhì)的分解，但在人退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中鋅指蛋白A20對(duì)細(xì)胞衰老及凋亡影響不明確。因此本實(shí)驗(yàn)擬使用小干擾RNA降低A20表達(dá)，LPS作為炎癥刺激因素，探究A20對(duì)細(xì)胞衰老及凋亡的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人退變椎間盤(pán)髓核組織 實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本均來(lái)自于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，并獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2016-059)，且術(shù)前與患者簽署知情同意書(shū)。收集2020年6月至2021年12月住院患者術(shù)中常規(guī)切除的退變椎間盤(pán)組織。標(biāo)本來(lái)自20例患者，男性9例，女性11例，年齡(42.10±12.07)歲?；颊咝g(shù)前癥狀、體征和影像學(xué)檢查確診為腰椎間盤(pán)突出癥，經(jīng)保守治療無(wú)效，Pfirrmann 分級(jí)均為Grade Ⅲ～Ⅴ。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液(以色列BI公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，Ⅱ型膠原酶和LPS(美國(guó)Sigma公司)，兔抗人P21多克隆、兔抗人P16多克隆(中國(guó)萬(wàn)類(lèi)生物科技公司)，兔抗人BCL2單克隆、兔抗人BID單克隆、兔抗人BAX單克隆(美國(guó)Abcam公司)，兔抗人P-P65單克隆、兔抗人TNFAIP3單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling 公司)，兔抗人P65多克隆抗體、羊抗兔二抗(中國(guó)博士德公司)，CAPE(中國(guó)美侖生物公司)，一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(綠色熒光，中國(guó)碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 髓核細(xì)胞的提取及培養(yǎng) 將患者術(shù)中切除并廢棄的退變髓核組織用50 mL離心管收集，放置冰上。用已高溫高壓消毒的眼科剪及眼科鑷小心分離混入髓核組織中的破碎骨片、肌肉及部分纖維環(huán)。無(wú)菌PBS溶液仔細(xì)沖洗髓核組織，直至沖洗后的廢液無(wú)明顯變色，將髓核組織剪成3～5 mm長(zhǎng)寬的碎片，夾入15 mL無(wú)菌離心管內(nèi)，加入大約2倍體積0.25%胰蛋白酶，充分混勻，放置于37 ℃、5%CO的細(xì)胞孵箱內(nèi)消化30 min，隔10 min搖勻1次。0.25%胰蛋白酶消化完畢后，1 200 r/min離心5 min，吸棄上清液，并加入2倍體積的0.2%二型膠原酶，充分搖勻，消化4 h，每隔40～60 min手動(dòng)混勻1次。用一次性的200目細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液，并用無(wú)菌PBS溶液沖洗細(xì)胞篩，收集濾液，1 200 r/min離心8 min，棄上清，保留底部沉淀。加入完全培養(yǎng)基，充分重懸，轉(zhuǎn)移至由透氣孔的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加完全培養(yǎng)基至4 mL，放置細(xì)胞孵箱待其貼壁。髓核細(xì)胞大致4 d左右可見(jiàn)明顯貼壁細(xì)胞形態(tài)，大約20 d融合度達(dá)90%，進(jìn)行傳代，傳至P2用于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 人小干擾RNA-A20的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 siRNA-A20由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)及合成，序列為A20, 正義鏈5′-CUACUAAUGGGAUCAUUCATT-3′;反義鏈5′-UGAAUGAUCCCAUUAGUAGTT-3′。提前將髓核細(xì)胞接種至6 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，密度為50%左右，待其充分貼壁約24 h后，進(jìn)行小干擾RNA的轉(zhuǎn)染。準(zhǔn)備已消毒的1.5 mL EP管，各管內(nèi)加入100 μL無(wú)血清及雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，一半EP管加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑，一半加入適當(dāng)?shù)膕iRNA，靜止5 min后將其兩兩混勻，充分混勻后靜止20 min。吸棄培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS洗滌2～3次，加入無(wú)血清及無(wú)雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓大約15 min。轉(zhuǎn)染試劑及siRNA混合液緩慢加入上述的髓核細(xì)胞中，siRNA-A20轉(zhuǎn)染終濃度100 nmol/L，放置細(xì)胞孵箱。轉(zhuǎn)染4～6 h，將含有轉(zhuǎn)染混合物的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，并用PBS清洗1～2次，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，并觀察其形態(tài)是否良好，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組處理 為探索鋅指蛋白A20在LPS刺激下對(duì)細(xì)胞凋亡及衰老影響，設(shè)置對(duì)照組、LPS組、siRNA-A20組、siRNA-A20+LPS組。為明確下調(diào)鋅指蛋白A20時(shí)LPS刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及衰老通過(guò)NF-κB通路實(shí)現(xiàn)，設(shè)置對(duì)照組、LPS組、siRNA-A20+LPS組、siRNA-A20+LPS+CAPE組。siRNA-A20轉(zhuǎn)染終濃度100 nmol/L，LPS均為200 μg/mL處理24 h，CAPE為2.5 μmol/L預(yù)處理2 h。

1.2.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 裂解各組細(xì)胞后，冰浴，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清并定容，BCA 法測(cè)定上清中蛋白濃度，加入RIPA稀釋蛋白以平衡各組間蛋白濃度，以1/4蛋白體積上樣緩沖液混合煮沸15 min后上樣，恒壓80 V進(jìn)行電泳分離，恒流250 mA進(jìn)行電轉(zhuǎn)，將蛋白電轉(zhuǎn)至0.22 mm PVDF 膜。用快速封閉液對(duì)轉(zhuǎn)好的膜封閉30 min，TBST洗滌3次，每次5 min。一抗(1∶500)4 ℃孵育12 h，TBST洗滌3次，每次15 min，二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌2次，每次15 min。顯影，發(fā)光。用Image J 軟件處理。系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.2.5 β-半乳糖苷酶檢測(cè) 對(duì)于6孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS或HBSS洗滌1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸除細(xì)胞固定液，用PBS或HBSS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)將β-半乳糖苷酶染色液A、B、C及X-Gal溶液按照比例配置成染色工作液，每孔加入1 mL染色工作液。用parafilm或保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)，在無(wú)CO孵育箱中37 ℃孵育過(guò)夜，普通光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞占比。

1.2.6 流式細(xì)胞儀Annexin V-PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀 Annexin V-PI雙標(biāo)法檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡: 髓核細(xì)胞培養(yǎng)和處理同前。用PBS洗滌3次，用無(wú)EDTA胰蛋白酶消化后，PBS 洗滌3次，1 000 r/min離心5 min，采用Annexin V-PI染料染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制適當(dāng)量的TUNEL檢測(cè)液，充分混勻。用PBS或HPBS洗滌2次。在樣品上加50 μL TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min。PBS或HPBS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，拍照并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞占比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人退變髓核組織選擇及細(xì)胞培養(yǎng)

選擇退變等級(jí)為3級(jí)或4級(jí)的髓核組織。提取原代細(xì)胞第5天，可見(jiàn)明顯呈短梭狀、聚集細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)21 d可見(jiàn)細(xì)胞逐漸呈長(zhǎng)梭形聚集，融合度達(dá)85%以上，且細(xì)胞形態(tài)良好(圖1)。

2.2 下調(diào)A20促進(jìn)衰老相關(guān)蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，LPS組P21、P16蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，siRNA-A20組及siRNA-A20+LPS組P21、P16蛋白水平明顯增加(

P

<0.05)，siRAN-A20+LPS組P16及P21略高于siRNA-A20，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

2.3 siRNA-A20處理后β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加

與對(duì)照組相比，LPS組陽(yáng)性細(xì)胞占比無(wú)明顯增加，siRNA-A20組及siRNA-A20+LPS組陽(yáng)性細(xì)胞占比明顯增加(

P

<0.05)。見(jiàn)圖3。

A：β-半乳糖苷酶染色結(jié)果；B：各組陽(yáng)性細(xì)胞占比 a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

2.4 下調(diào)A20促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，LPS組僅BID蛋白量增加(

P

<0.05)，BCL2、BAX蛋白水平無(wú)明顯差異；siRNA-A20組蛋白表達(dá)與LPS組類(lèi)似；siRNA-A20+LPS組BID及BAX蛋白明顯增加，BCL2明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)圖4。

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：半定量分析 1：對(duì)照組；2：LPS組；3：siRNA-A20組；4：siRNA-A20+LPS組 a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

2.5 下調(diào)鋅指蛋白A20表達(dá)量LPS可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

單純LPS刺激及單純siRNA-A20處理組中細(xì)胞凋亡明顯高于對(duì)照組(

P

<0.05)，但兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；siRNA-A20+LPS組細(xì)胞凋亡顯著增加，高于二者單獨(dú)作用對(duì)細(xì)胞凋亡影響(

P

<0.05，圖5)。TUNEL染色中，LPS組及siRNA-A20組陽(yáng)性細(xì)胞占比明顯高于對(duì)照組(

P

<0.05)，但明顯低于siRNA-A20+LPS組(

P

<0.05，圖6)。

A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果；B：細(xì)胞凋亡率 1：對(duì)照組；2：LPS組；3：siRNA-A20組；4：siRNA-A20+LPS組 a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

A：TUNEL染色結(jié)果；B：陽(yáng)性細(xì)胞占比 1：對(duì)照組；2：LPS組；3：siRNA-A20組；4：siRNA-A20+LPS組 a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

2.6 下調(diào)A20表達(dá)量LPS刺激可明顯增加NF-κB通路活性

與對(duì)照組相比，p-P65蛋白水平在LPS組中增加(

P

<0.05)，在siRNA-A20+LPS組中顯著上升(

P

<0.05)，在siRAN-A20組中無(wú)明顯差異(圖7)。

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：半定量分析 1：對(duì)照組；2：LPS組；3：siRNA-A20組；4：siRNA-A20+LPS組 a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

2.7 CAPE預(yù)處理后衰老及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化

與siRNA-A20+LPS組相比，CAPE預(yù)處理后，p-P65、P21、P16、BID、BAX蛋白表達(dá)降低(

P

<0.05)，BCL2蛋白表達(dá)增加(

P

<0.05)，A20及P65蛋白水平無(wú)明顯變化(圖8)。

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：半定量分析 1：對(duì)照組；2：LPS組；3：siRNA-A20+LPS組；4：siRNA-A20+LPS+CAPE組 a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與siRNA-A20+LPS組比較

3 討論

應(yīng)用siRNA-A20處理髓核細(xì)胞后，衰老相關(guān)蛋白P21、P16明顯增加，且β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞占比顯著提高，提示細(xì)胞衰老程度提升。年齡相關(guān)性疾病中，細(xì)胞衰老占據(jù)著重要影響，可由一系列內(nèi)在和外在的傷害引起，包括致癌激活、氧化和遺傳毒性應(yīng)激、線粒體功能障礙、輻射或化療藥物。在退變的椎間盤(pán)中，髓核處于炎性微環(huán)境的刺激下，易誘導(dǎo)髓核細(xì)胞及其祖細(xì)胞的衰老。此外，衰老細(xì)胞可產(chǎn)生的衰老相關(guān)分泌表型(SAPA)影響周?chē)?xì)胞，加之異常的炎癥環(huán)境促使正常功能髓核細(xì)胞急劇減少，加速髓核組織中干細(xì)胞的耗竭，導(dǎo)致椎間盤(pán)退變。抑制精氨酸酶Ⅱ可減少I(mǎi)L-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老及凋亡，其機(jī)制涉及對(duì)NF-κB炎癥信號(hào)通路的抑制。彭鑫等研究顯示，siRNA-A20+TNF-α可明顯誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞的衰老，其機(jī)制可能涉及NF-κB通路的過(guò)度激活。但在本實(shí)驗(yàn)中單純siRNA-A20處理后，細(xì)胞衰老明顯增加，聯(lián)合LPS刺激后，P-P65雖明顯上升，但P21、P16及陽(yáng)性細(xì)胞占比與siRNA-A20組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果差異可能與細(xì)胞種屬及分組不同有關(guān)，并且本課題組前期研究提示單純下調(diào)A20可能減弱髓核細(xì)胞自噬，因此A20調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老的機(jī)制還有待深入探索。

本研究結(jié)果表明，LPS或siRNA-A20處理時(shí)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且siRNA-A20+LPS組凋亡細(xì)胞占比顯著升高，并伴隨著B(niǎo)ID、BAX表達(dá)量增加，BCL2下降。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，是正常生長(zhǎng)發(fā)育的一部分，也在多種疾病中存在，主要分為依賴線粒體的內(nèi)源性途徑及依賴死亡配體受體的外源性途徑，但最終都通過(guò)Caspase家族蛋白發(fā)揮作用。髓核組織處于IL-1β、TNF-α高表達(dá)的微環(huán)境，這些炎性刺激可通過(guò)細(xì)胞外Fas受體、腫瘤壞死因子受體1及腫瘤壞死因子相關(guān)配體1誘導(dǎo)外源性的細(xì)胞凋亡，并且在炎性因子的作用下，細(xì)胞內(nèi)NF-κB、MAPK等多種信號(hào)通路激活，導(dǎo)致了內(nèi)源性的凋亡發(fā)生——線粒體途徑凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，siRNA-A20+LPS組線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白BID、BAX、BCL2明顯改變。BCL2及BID是線粒體凋亡途徑的重要蛋白，可激活BAX、BAK，促使線粒體外膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C，Caspase家族激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，猜測(cè)siRNA-A20+LPS處理時(shí)，凋亡可能通過(guò)該途徑實(shí)現(xiàn)。

髓核細(xì)胞中，cortistatin、SS-31均可抑制炎癥刺激誘導(dǎo)的NF-κB激活、線粒體損傷及凋亡，sirt 6可通過(guò)抑制mTOR磷酸化提升髓核細(xì)胞自噬流量，阻礙細(xì)胞衰老及IL-1β誘導(dǎo)凋亡，從而延緩椎間盤(pán)退變。本研究中，下調(diào)鋅指蛋白A20的表達(dá)，LPS可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞衰老及凋亡，造成髓核細(xì)胞的損傷。給予NF-κB抑制劑CAPE預(yù)處理后，可明顯減少衰老及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，提示siRNA-A20+LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老及凋亡可能通過(guò)NF-κB通路實(shí)現(xiàn)，并且在本課題組前期研究中也已證明過(guò)表達(dá)鋅指蛋白A20可延緩LPS誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞退變，因此A20在延緩椎間盤(pán)的退變中相當(dāng)重要。

綜上所述，本研究顯示鋅指蛋白A20在人退變髓核細(xì)胞中同時(shí)具有抗細(xì)胞凋亡及衰老作用，且在LPS刺激下更凸顯出A20蛋白對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果，該作用通過(guò)抑制NF-κB實(shí)現(xiàn)。此外，下調(diào)A20后LPS刺激下線粒體凋亡通路蛋白明顯增加，提示鋅指蛋白A20的抗凋亡作用可能通過(guò)保護(hù)線粒體實(shí)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究A20對(duì)髓核細(xì)胞的內(nèi)源性保護(hù)作用提供可靠方向。本研究再次證明鋅指蛋白A20對(duì)髓核細(xì)胞退變的保護(hù)作用，并且提示了凋亡可能的作用機(jī)制，但在椎間盤(pán)退變中A20具體保護(hù)機(jī)制仍不明確，需進(jìn)一步探究。