亢美娟，黃思棋，劉芳玉，鄭云鵬，馮海玲，羅華蓉

（1.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.飛鶴（泰來)乳品有限公司，黑龍江齊齊哈爾 161000）

0 引 言

亞硝酸鹽（nitrite），是含有亞硝酸根陰離子（NO2-）的鹽。食用亞硝酸鹽濃度高的食品可使嬰兒患上“高鐵血紅蛋白癥”[1-2]。因此GB 2762《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中對嬰幼兒配方食品中亞硝酸鹽的限量為2 mg/kg[3]。食品中亞硝酸鹽的檢測方法主要有分光光度法和離子色譜法、極譜法及液相色譜法[4]。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.33-2016 第二法為分光光度法，修改采用IDF 標(biāo)準(zhǔn)，但該方法中的前處理方式不能有效消除嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)干擾，存在回收率偏低、重復(fù)性不好的問題[5-8]。本研究嘗試采用固相萃取技術(shù)及活性炭吸附方式，除去樣品中的對顯色反應(yīng)產(chǎn)生干擾的物質(zhì)，并優(yōu)化顯色反應(yīng)實驗條件。建立準(zhǔn)確度好、操作簡便的分光光度法，為嬰幼兒配方乳粉中亞硝酸鹽的日常檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與材料

亞硝酸鈉（≥99%），天津科密歐公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、鹽酸、四硼酸鈉、鹽酸萘乙二胺，天津科密歐公司；對氨基苯磺酸、酸性活性炭，阿拉丁公司；Bond Elut C18 固相萃取柱6 cc/150 mg，美國安捷倫公司；Oasis HLB 固相萃取柱6 cc/150 mg，美國沃特世公司；Oasis MAX 固相萃取柱6 cc/150 mg，美國沃特世公司。以上試劑除標(biāo)注的均為分析純，水為GB/T 6682 規(guī)定的一級水。

嬰幼兒配方乳粉，分別購買2 個品牌的嬰兒配方乳粉、較大嬰兒配方乳粉和幼兒配方乳粉，市售。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-1780 紫外-可見分光光度計，日本島津公司；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；純水儀，密里博公司；移液器，德國Effendorf。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液：亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度200 μg/mL，以亞硝酸鈉計）：準(zhǔn)確稱取0.100 g于110 ～120 ℃干燥恒重的亞硝酸鈉，加水溶解，移入500 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（質(zhì)量濃度5.0 μg/mL）：吸取2.50 mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于100 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，臨用前配制。

1.2.2 試劑配制

亞鐵氰化鉀溶液（質(zhì)量濃度106g/L）：稱取106.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解，并稀釋至1 000 mL；乙酸鋅溶液（質(zhì)量濃度220 g/L）：稱取220.0 g 乙酸鋅，先加30 mL 冰乙酸溶解，用水稀釋至1 000 mL；飽和硼砂溶液（質(zhì)量濃度50 g/L）：稱取5.0 g 硼酸鈉，溶于100 mL熱水中，冷卻后備用；鹽酸（濃度為0.1 mol/L）：量取8.3 mL 鹽酸，用水稀釋至1 000 mL；鹽酸（濃度2 mol/L）：量取167 mL 鹽酸，用水稀釋至1 000 mL；鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%）：量取20 mL 鹽酸，用水稀釋至100 mL；對氨基苯磺酸溶液（質(zhì)量濃度4 g/L）：稱取0.4 g 對氨基苯磺酸，溶于100 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%鹽酸中，混勻，置棕色瓶中，避光保存；鹽酸萘乙二胺溶液（質(zhì)量濃度2 g/L）：稱取0.2 g 鹽酸萘乙二胺，溶于100 mL 水中，混勻，置棕色瓶中，避光保存。

1.2.3 樣品處理

稱取試樣5 g（精確至0.001 g），置于150 mL 具塞錐形瓶中，加7 mL 50g/L 飽和硼砂溶液，加入70 ℃左右的水約60 mL，混勻，于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫。轉(zhuǎn)移上述提取液至100 mL 容量瓶中，分別加入3 mL 亞鐵氰化鉀溶液和和乙酸鋅溶液沉淀蛋白質(zhì)（濾液渾濁時可適當(dāng)增加亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液的用量，同時做試劑空白），搖勻。加水至刻度，搖勻，放置30 min，除去上層脂肪，濾紙過濾后濾液備用，同時做試劑空白。

1.2.4 樣液凈化

活性炭凈化方式：取上述濾液約50 mL 于150 mL錐形瓶中，加入活性炭1～1.5 g，震蕩1 min。用濾紙過濾，棄去初濾液約3 mL，濾液備用，同樣方式處理試劑空白濾液。

固相萃取凈化方式：固相萃取柱的活化：依次用10 mL 甲醇、15 mL 水通過，靜置30 min，備用。取上述濾液約10 mL，依次通過0.45 μm 水性濾膜針頭濾器、Bond Elut C18 柱，棄去前面2 mL，收集流出液待測，同時做試劑空白。

1.2.5 亞硝酸鹽測定

吸取0.00、40、80、120、160 μL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液分別置于10 mL 容量瓶中，分別加水至4.0 mL。取4.0 mL 上述樣品凈化液于10 mL 容量瓶中。樣液與各標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入0.4 mL 4g/L 對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min 后各加入0.2 mL 質(zhì)量濃度為2 g/L 鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，標(biāo)準(zhǔn)曲 線 各 點 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為：0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL。靜置20 min，用1 cm 比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點，于波長541 nm 處測吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制線性回歸曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中亞硝酸鹽的濃度?；钚蕴績艋绞剑喝∩鲜鰹V液約50 mL 于150 mL 錐形瓶中，加入活性炭1～1.5 g，震蕩1 min。用濾紙過濾，棄去初濾液約3 mL，濾液備用，同樣方式處理試劑空白濾液。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇和優(yōu)化

由于亞硝酸酸鹽在堿性條件下易溶解且穩(wěn)定性好，而嬰幼兒配方乳粉樣品體系呈酸性，用水溶解時呈弱酸性。采用飽和硼砂溶液溶解樣品同時中和樣品酸性，避免亞硝酸鹽在酸性環(huán)境下及加熱提取時造成損失。硼砂是硼酸鈉的俗稱，分子式為Na2B4O7·10H2O，為強堿弱酸鹽，水溶液呈堿性，是含有多種硼酸根陰離子及聚硼酸根離子的體系，可將視為由2 分子硼酸和2 分子偏硼酸鈉組成的緩沖體系。加入硼砂可維持提取液的堿性，有利于亞硝酸根離子的穩(wěn)定存在[9]。通過水浴方式充分提取樣品中的亞硝酸鹽，選取溫度為70、80、90、100 ℃水浴；分別提取10、15、20、30 min；考察水浴時間、溫度對提取率的影響，從而選擇出最佳實驗條件，如圖1 所示。實驗結(jié)果表明在100 ℃和15 min時提取率最高，為98 %。用乙酸鋅及亞鐵氰化鉀沉淀樣液中的蛋白質(zhì)[10-11]。定容過濾后，濾液采用活性炭或固相萃取技術(shù)凈化，消除干擾。

圖1 溫度、時間對提取率的影響

2.2 活性炭凈化方式實驗條件的選擇

嬰幼兒配方乳粉經(jīng)提取步驟得到的樣液，由于存在有機物雜質(zhì)干擾，影響亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后再與N-1-萘基乙二胺偶合形成紫紅色染料的顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果與實際含量比偏低，回收率低。采用活性炭對樣液進行處理能夠得到良好的改善效果。活性炭的多孔結(jié)構(gòu)提供了大量的表面積，通過物理吸附將介質(zhì)中的雜質(zhì)吸引到微孔上?；钚蕴砍刑迹疫€含有少量的化學(xué)結(jié)合、官能團形式的氧和氫，如羧基、羥基、脂類、醌類等[12-14]?；钚蕴康奶砑恿坑绊憙艋Ч闹匾蛩?，選取3 種嬰幼兒配方乳粉測試回收率考察活性炭的加入量對檢測準(zhǔn)確度的影響。樣品經(jīng)稱樣、加標(biāo)、提取、沉淀、過濾后得到樣液，吸取其中50 mL，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0 g 活性炭，實驗結(jié)果表明在添加量達到1.5 g 時回收率達到最高并趨于穩(wěn)定，平均回收率為96.2%，結(jié)果如圖2所示。

圖2 活性炭添加量對回收率的影響

2.3 固相萃取柱的選擇

亞硝酸根離子化學(xué)式為NO2-，其在酸性條件下不穩(wěn)定，易分解，具有一定氧化性，也具有還原性，能被強氧化劑氧化。提取凈化過程宜在堿性環(huán)境下進行，避免使用強氧化劑和還原劑。分別采用聚合二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮固相萃取柱（HLB 柱）、混合陰離子交換固相萃取柱（MAX 柱）、和Bond Elut C18 固相萃取柱進行凈化。HLB 柱和MAX 柱檢測結(jié)果回收率均偏低，與不凈化相比沒有改善。通過Bond Elut C18 固相萃取柱凈化后檢測結(jié)果回收率得到顯著的改善。Bond Elut C18 固相萃取柱具有C18 官能團的反向硅膠基SPE，具有疏水作用。反向填料是非極性吸附劑，可從極性基質(zhì)中保留非極性化合物，鍵合硅膠吸附劑，增強了對非極性的組分有吸附作用，對水相基質(zhì)中大部分有機物都能產(chǎn)生保留，如芳香油、脂溶性維生素、食品添加劑、碳水化合物、鄰苯二甲酸酯、類固醇、水溶性維生素等，而鹽能毫無保留地通過吸附劑[15]。Bond Elut C18 固相萃取柱使用前需進行活化，先使用強溶劑潤濕小柱固定相，再用弱溶劑平衡、活化小柱。其過程為：依次用10 mL 甲醇、15 mL 水通過，靜置30 min。取上述提取、沉淀后濾液約10 mL，依次通過0.45 μm 水性濾膜針頭濾器、Bond Elut C18 柱，棄去前面2 mL，收集流出液待測，同時做試劑空白。如果樣品流速太快，影響干擾成分在吸附劑中的保留，所以小柱流速控制在2～3 mL/min。

2.4 顯色反應(yīng)實驗條件的確定

乳制品中亞硝酸鹽的含量測定采用鹽酸萘乙二胺分光光度法，其原理為：在酸性條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，可與鹽酸萘乙二胺偶合生成紫紅色物質(zhì)，在波長541 nm 處吸光度（Abs）為最大值，見圖5，由校準(zhǔn)曲線計算得出其含量。重氮化反應(yīng)是芳香族伯胺和亞硝酸作用（在強酸介質(zhì)下）生成重氮鹽的反應(yīng)，脂肪族重氮鹽不穩(wěn)定，容易自發(fā)分解；芳香族重氮鹽較為穩(wěn)定。在重氮化反應(yīng)中，系統(tǒng)中的鹽酸首先使芳香胺溶解，二是和亞硝酸鈉生成亞硝酸，最后與芳胺作用生成重氮鹽。重氮鹽容易分解，只有在過量的酸液中才比較穩(wěn)定。偶氮化是重氮鹽與酚類、芳香胺作用生成偶氮化合物的反應(yīng)，其中與酚類反應(yīng)需要在堿性條件下，與芳胺反應(yīng)則應(yīng)在中性或弱酸性條件進行，反應(yīng)原理如圖3、圖4 所示。影響重氮化和偶氮化反應(yīng)的主要因素為反應(yīng)時間[16-17]。樣品凈化后，依次加入對氨基苯磺酸溶液和鹽酸萘乙二胺溶液，分別靜止10、15、20、30、40、50 min 進行測試，實驗結(jié)果表明，顯色時間為20 min 時達到最大吸光度值，到40 min 內(nèi)結(jié)果結(jié)果穩(wěn)定，因此，實驗條件確定為加入鹽酸萘乙二胺并混勻后20～40 min 內(nèi)用紫外分光光度計進行測試。

圖3 重氮化反應(yīng)

圖4 偶氮化反應(yīng)

圖5 反應(yīng)液紫外吸收圖譜

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

吸取0、40、80、120、160 μL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液分別置于10 mL 容量瓶中。于標(biāo)準(zhǔn)管與試樣管中分別加入0.4 mL 質(zhì)量濃度為4 g/L 對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min 后各加入0.2 mL 質(zhì)量濃度為2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，標(biāo)準(zhǔn)曲線各點質(zhì)量濃度分別為：0，4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL。靜置20 min，用1 cm 比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點，于波長541 nm 處測吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制線性回歸曲線，如圖6 所示。其線性方程為：y=0.0043x+0.0006，相關(guān)系數(shù)R=0.999，線性范圍0.00～20.0 μg/mL。采用測定方法考察方法檢出限，由于對嬰幼兒配方乳粉中的亞硝酸鹽含量有限量要求，選取空白樣品基質(zhì)25 個平行樣，分別添加預(yù)估檢出限質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4 mg/kg，該預(yù)估檢出限濃度水平的檢出概率為96%，定為檢出限[18]。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.33-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》第二法分光光度法中乳粉檢出限為0.5 mg/kg。優(yōu)化的比色法與國標(biāo)方法比較靈敏度更高。

圖6 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 回收率和精密度

以不含亞硝酸鹽的嬰幼兒配方乳粉為實驗材料，分別采用活性碳凈化方式和固相萃取凈化方式處理樣品，進行3 個濃度水平的加標(biāo)實驗，每個水平平行測定6 次，計算亞硝酸鹽的加標(biāo)回收率以及精密度（RSD），如表1 所示?；厥章试?1%～102%，RSD 在2.1%～3.4%。實驗結(jié)果表明，兩種優(yōu)化的前處理方式均能得到良好的回收率和精密度，能夠滿足產(chǎn)品質(zhì)量控制要求。

表1 嬰幼兒配方乳粉回收率和精密度

2.7 不同處理方法檢測結(jié)果比較

選擇不同種類嬰幼兒配方乳粉的空白樣品分別采用活性炭和固相萃取凈化方式處理樣液后進行測試，同時與不經(jīng)凈化的樣液進行比較，結(jié)果如表2 所示。實驗結(jié)果表明，未經(jīng)凈化的樣品檢測結(jié)果與實際含量相比偏低，且不同種類樣品檢測結(jié)果存在較大差異。樣液經(jīng)活性炭和固相萃取凈化方式處理后，能夠有效消除基質(zhì)干擾，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好。加標(biāo)0.4 mg/kg 時，國標(biāo)比色法（樣液不凈化檢測結(jié)果）無檢測信號，然而優(yōu)化的比色法能夠正常的檢測其含量，因此顯示出優(yōu)化比色法的優(yōu)勢。加標(biāo)1.0 mg/kg時，國標(biāo)比色法（樣液不凈化檢測結(jié)果）回收率為48%～75%，優(yōu)化的比色法回收率為92%～102%，因此優(yōu)化的比色法具有更好的準(zhǔn)確度。

表2 不同處理方法嬰幼兒配方乳粉檢測結(jié)果

（續(xù)表2）

3 結(jié) 論

嬰幼兒配方乳粉中亞硝酸鹽的檢測方法，目前主要有離子色譜法、分光光度法、流動注射法，其中離子色譜法用于檢測嬰幼兒配方乳粉，基質(zhì)干擾大，難以得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，且試劑耗材成本高；流動注射法需要購買專用儀器設(shè)備，檢測成本高；分光光度法作為一種經(jīng)典的檢測方法應(yīng)用范圍廣，但嬰幼兒配方乳粉由于基質(zhì)復(fù)雜，影響檢測準(zhǔn)確性，本文重點探討了采用活性炭和固相萃取兩種凈化方式消除嬰幼兒配方乳粉的基質(zhì)干擾，并對實驗條件如水浴溫度、提取時間等進行了優(yōu)化，通過實驗確定了最佳顯色反應(yīng)實驗條件，并對顯色反應(yīng)穩(wěn)定性進行了考察。兩種優(yōu)化方法均能得到科學(xué)、準(zhǔn)確、可靠的檢測結(jié)果。與國標(biāo)實驗方法比較，具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適合用于嬰幼兒配方乳粉中亞硝酸鹽含量的監(jiān)測。兩種凈化方式操作簡單，實驗成本低，適用性強，容易推廣開展。