呂勃川，趙鋼，張百亮，侯繼野

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 齊齊哈爾和平醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

下肢動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans，ASO）是除冠狀動脈及腦動脈外最為常見的周圍血管疾病，由多種危險因素共同作用引起下肢動脈血管發(fā)生粥樣硬化病變，繼發(fā)血管管腔狹窄或阻塞所致的慢性動脈閉塞性疾病。臨床采用大黃?蟲丸治療血栓閉塞性脈管炎效果顯著［1］。中醫(yī)學認為，脈絡血瘀是此類動脈缺血性疾病的病機核心，因此化瘀通脈是治療此類疾病的基本原則，應大量應用蟲類藥物［2］。大黃?蟲丸為久病血瘀之緩劑，其主藥?蟲、水蛭等具有破血逐癖、搜剔走竄、消癥瘕、通血脈的功效，且破而不峻、能和能行［3］。前期研究發(fā)現［4］，大黃?蟲丸能夠降低血清中ET，升高血清中6－Keto－PGF1α 的含量，治療下肢深靜脈血栓形成（DVT）效果顯著。為進一步探討大黃?蟲丸對下肢動脈硬化閉塞癥的機制，本研究復制ASO 模型大鼠，探討其對ASO 模型大鼠血脂、ET－1、IL－6 及PAF/LP/PLA2 信號通路的影響，為大黃?蟲丸的進一步臨床應用提供可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由齊齊哈爾醫(yī)學院神經藥理研究室提供健康SD大鼠，體質量200～250 g，90只，8周齡，雄性。生產許可證號：SCXK（黑）2013－004。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為（23 ±3）℃，濕度為40%～70%，每天12 h光照。

1.2 主要試劑與儀器

高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；全自動多功能酶標儀（美國Bio－TEK 公司）；實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

Anti－PAF Receptor Antibody（Abcam 公 司）；IP3 Receptor、LP－PLA2 Antibody（Affinity 公司）；VD3注射（腹腔注射，大連美侖生物技術有限公司）；ET－1、IL－6、TG、TC、LDL－C、HDL－C ELISA 試劑盒（南京建成生物研究所）；SYBR?Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）Kit（日本TaKaRa公司）；TaKaRa PrimeScript?RTPCR Kit（中國大連寶生物工程有限公司）；大黃?蟲丸（北京同仁堂，批號：Z11020002）；通塞脈片（江蘇南星藥業(yè)有限責任公司，批號：Z32020535）。

1.3 模型建立

取健康雄性SD 大鼠，采用復合方法制作動脈（髂－股動脈）粥樣硬化模型大鼠，高脂飼料配制：20%豬大油、5%白糖、3%膽固醇、0.15%膽酸鈉、2%蛋黃粉及69.85%的基礎飼料，共飼養(yǎng)8 周。第1 周適應性喂養(yǎng)。第2周用高脂飼料喂養(yǎng)，第4周沿腹部至膝下縱向切開皮膚，分離并暴露髂、股動脈，動脈夾阻斷髂、股動脈遠、近端約1.5～2.0 cm，取22 g自制穿刺針，穿刺入股動脈，緩慢注射0.2～0.3 mL 無菌蒸餾水進入阻斷部位血管，至血管充盈為止。4～5 min 后取下針頭和動脈夾，壓迫止血，縫合切口，觀察大鼠造模前后一般狀態(tài)及血清學變化。第5～8周用高脂飼料喂養(yǎng)。

1.4 分組與給藥

造模成功后，按照臨床等效劑量為低劑量組，大鼠與人用量的換算關系計算得出，灌胃等效劑量為0.54 g/（kg·d）?？瞻讓φ战M和模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，每日1 次。陽性對照組給予通塞脈片生理鹽水溶液（380 mg/kg）灌胃，每日1 次。高劑量組相當于臨床等效劑量的4 倍，給予大黃?蟲丸生理鹽水溶液（2.16 g/kg）灌胃，每日1次。中劑量組相當于臨床等效劑量的2倍，給予大黃?蟲丸生理鹽水溶液（1.08 g/kg）灌胃，每日1次。低劑量組相當于臨床等效劑量，給予大黃?蟲丸生理鹽水溶液（0.54 g/kg）灌胃，每日1 次。各組灌胃時間均為4周。

1.5 采血與取材

乙醚吸入麻醉，毛細玻璃管沿大鼠目內眥斜刺眼底靜脈叢，留取靜脈血，4 ℃3 000～5 000 r/min 離心10 min，分離血清，置冰箱備用。戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，在不同時間點取材，大鼠取仰臥位固定于無菌手術臺上，碘伏消毒手術區(qū)皮膚，開腹，剪取髂－股動脈，一部分投入10%福爾馬林固定液中；其余部分放入液氮中保存，以備用于Western blot和PCR檢測。

1.6 血清生化指標測定

應用雙抗體夾心ABC－ELISA 法檢測大鼠血清中血脂（TC、TG、LDL、HDL）、ET－1 及IL－6 的含量。操作根據試劑盒說明進行。

1.7 Western blot法檢測PAF、LP－PLA2

取出0.1 g 組織，放入2 mL 的EP 管中倒入研磨珠和Western細胞裂解液，用組織研磨機將組織碾碎致勻漿，4 ℃靜置30 min 后，4 ℃13 000 rpm 離心10 min，取上清液。用BCA試劑盒測蛋白的濃度，加入5×SDSPAGE蛋白上樣緩沖液95 ℃水浴10 min，恢復室溫。

1.8 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 24.0 軟件進行數據分析。實驗數據用均數±標準差（±s）表示。采用方差同質性（卡方）檢驗方差是否齊性，當方差齊性時，使用單因素方差檢驗；當方差不齊時，使用Welch 方法進行比較，并將LSD 用于多重比較事后檢驗。P<0.05 為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清ET－1、IL－6含量比較

與空白對照組比較，模型大鼠血清ET－1、IL－6含量明顯升高（P< 0.01）。與模型組比較，陽性對照組和大黃?蟲丸各劑量組大鼠血清ET－1、IL－6含量明顯降低（P< 0.01）。與陽性對照組比較，高劑量組大鼠血清ET－1、IL－6含量降低（P<0.01），低劑量組大鼠血清ET－1、IL－6 含量升高（P< 0.05）。中劑量組大鼠血清ET－1、IL－6 含量與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠血清ET－1、IL－6含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清ET－1、IL－6含量比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，ΔP<0.01；與陽性對照組比較，##P<0.01，#P<0.05。

組別空白對照組模型組陽性對照組高劑量組中劑量組低劑量組n 15 15 15 15 15 15 IL－6（ng/L）0.67±0.11 4.73±0.56*1.81±0.19*Δ 1.28±0.15*Δ##1.83±0.14*Δ 3.70±0.30*Δ#ET－1（pg/mL）2.17±0.25 4.76±0.43*3.19±0.33*Δ 2.65±0.26*Δ##3.23±0.31*Δ 3.87±0.38*Δ#

2.2 各組大鼠血清TG、TC、LDL－C 和HDL－C 含量比較

與空白對照組比較，模型大鼠血清TG、TC、LDLC 含量明顯升高，HDL－C 含量明顯降低（P< 0.01）。與模型組比較，陽性對照組和大黃?蟲丸各劑量組TG、TC、LDL－C 水平升高，HDL－C 水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與陽性對照組比較，高劑量組TG、TC、LDL－C 含量降低，HDL－C 含量升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低劑量組TG、TC、LDL－C含量升高，HDL－C 含量降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。中劑量組TG、TC、LDL－C、HDL－C 的含量與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠TG、TC、LDL－C、HDL－C含量的比較（±s，mmol/L）

表2 各組大鼠TG、TC、LDL－C、HDL－C含量的比較（±s，mmol/L）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，ΔP<0.01；與陽性對照組比較，##P<0.01，#P<0.05。

組別空白對照組模型組陽性對照組高劑量組中劑量組低劑量組n 15 15 15 15 15 15 TG 0.46±0.11 1.22±0.18*0.75±0.14*Δ 0.59±0.10*Δ##0.73±0.13*Δ 0.97±0.15*Δ#TC 1.45±0.16 3.65±0.36*2.51±0.24*Δ 1.84±0.21*Δ##2.53±0.23*Δ 3.01±0.28*Δ#LDL－C 0.31±0.11 1.68±0.33*0.56±0.12*Δ 0.42±0.11*Δ##0.53±0.11*Δ 1.03±0.24*Δ#HDL－C 1.12±0.14 0.34±0.06*0.76±0.11*Δ 0.93±0.15*Δ##0.77±0.13*Δ 0.46±0.08*Δ#

2.3 Western blot 法檢測PAF、LP－PLA2 蛋白表達水平比較

與空白對照組比較模型大鼠PAF、LP－PLA2蛋白表達明顯增多（P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組和大黃?蟲丸各劑量組大鼠PAF、LP－PLA2 蛋白表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與陽性對照組比較，高劑量組PAF、LP－PLA2蛋白表達減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P< 0.01）；低劑量組PAF、LPPLA2蛋白表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。中劑量組PAF、LP－PLA2蛋白表達與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表3和圖1。

表3 各組大鼠PAF、LP－PLA2蛋白表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠PAF、LP－PLA2蛋白表達水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，ΔP<0.01；與陽性對照組比較，##P<0.01，#P<0.05。

組別空白對照組模型組陽性對照組高劑量組中劑量組低劑量組n 15 15 15 15 15 15 PAF 0.22±0.10 1.26±0.23*0.46±0.13*Δ 0.30±0.11*Δ##0.47±0.12*Δ 0.87±0.18*Δ#LP－PLA2 0.47±0.13 3.55±0.49*1.10±0.21*Δ 0.82±0.20*Δ##1.02±0.23*Δ 2.48±0.28*Δ#

圖1 各組大鼠Western blot圖

3 討論

ASO由多種危險因素共同作用引起下肢動脈血管發(fā)生粥樣硬化病變，隨著血管內粥樣硬化斑塊的增大，會出現管腔完全閉塞，造成嚴重肢體缺血，甚至截肢。目前，關于動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)病機制主要有脂質滲入學說、內膜損傷學說及血栓形成學說等，當脂質損傷血管內皮后，激活中性粒細胞、單核細胞及平滑肌細胞，黏附并侵入內膜下，刺激分泌各種炎癥因子和血管生長因子，引起血管平滑肌細胞增殖及遷移，繼而血管內膜病理性增生，導致管腔狹窄甚至閉塞。據統(tǒng)計［5］，全球范圍內55～75 歲人群ASO 的患病率約為17%，60 歲以上人群患病率可達20%。目前，全球老年人口約占人口總數的13%，估計至2030 年，該比例預計將達到25%［6］。ASO 作為一種全身性動脈硬化疾病的局部表現，其形成原因復雜，治療難度較大，具有預后差，致殘率及病死率高等特點，已成為世界范圍內威脅人類健康的主要疾病之一。

根據該病的發(fā)病特點及臨床表現，將其歸為“脫疽”范疇。脫疽的中醫(yī)治法，最早見于《靈樞?癰疽》，載：“不衰，急斬之，不則死矣”，以“急斬之”及時切除壞死組織為主要治療方法?！端貑枴吩唬骸懊}道不遠，氣不往來，脈道以遠，氣血乃行”，指明了治療該病當以活血化瘀為主。隨著對本病認識的逐漸深入，陸續(xù)出現了四妙勇安湯、陽和湯、補陽還五湯等治療脫疽病的經典方劑，并通過大量臨床及基礎試驗研究明確了中藥治療本病的療效及可能的作用機制［7－8］。

大黃?蟲丸出自漢代張仲景著《金匱要略?血痹虛勞病脈癥并治第六》中，本條因虛致瘀，瘀久成勞，瘀血不去，新血不生，肌膚失養(yǎng)，故治宜祛瘀生新。方中大黃、?蟲、水蛭、桃仁、虻蟲、干漆、蠐螬活血搜絡化瘀，熟地黃、芍藥養(yǎng)血潤燥，杏仁理氣潤腸，黃芩清解郁熱，甘草白蜜益氣和中。諸藥相合，為久病血瘀之緩劑。因其潤以滋干，攻中寓補，峻劑丸服，意在緩攻，達到扶正不留瘀，祛邪不傷正的目的，為扶正祛瘀之方［9］。

現代藥理學研究發(fā)現，大黃?蟲丸能通過抗聚之能而發(fā)揮抗栓作用［10］。能改善血液黏滯度，增強血漿纖溶酶原活性，而發(fā)揮抗栓作用［11］?？山档蚑C、TG、LDL，升高HDL，說明其可調節(jié)血脂異常，改善內皮細胞功能，保護血管內皮，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用［12］。使血清中IGF－1含量升高，抑制平滑肌細胞的凋亡，從而阻止AS 的形成，起到防止心腦血管疾病發(fā)生的作用［13］。能夠明顯提升AS 模型大鼠腹主動脈中NO 的含量，有效降低腹主動脈中血漿內皮素（endothelin，ET）的含量［14］。ET 具有調節(jié)代謝和內分泌的生理機能，可以促進血管平滑肌細胞的增殖，有著強有力的生物學效應，可以強力收縮氣管、血管，有著較強的縮血管的能力。當血管被損傷后，內皮細胞受到刺激從而合成ET，同時也能釋放大量使血管收縮的物質，常見的有血漿內皮－1（Eenothelin－1，ET－1），ET－1 與相應受體在特定情況下結合，就會收縮血管平滑肌，引起血流緩慢，使細胞處于失氧狀態(tài)，同時隨著毛細血管通透性的增加，產生大量自由基，激活血小板的生理作用，動脈硬化加重，導致抗凝作用降低，纖溶能力也隨之降低，最終導致血栓形成。

動脈粥樣硬化的發(fā)生和脂質沉積有著密不可分的關系。血脂中的高密度脂蛋白（HDL－C）有著對抗動脈粥樣硬化形成的作用，當HDL－C 減少時，低密度脂蛋白被分解滲入至動脈內膜層，如果不能被吸收、吞噬和代謝，最終就會形成粥樣硬化物質沉積在動脈內膜上。持續(xù)高濃度的LDL、TC、TG 在組織細胞中作用繁多，錯綜復雜，易導致動脈粥樣斑塊的發(fā)生和發(fā)展，甚至導致血栓的形成。IL－6通過刺激肝臟，產生大量的纖溶酶原激活劑的抑制物質（PAI），結合后纖溶酶原激活劑的活性明顯降低，從而導致血小板的聚集，促進血栓形成。本研究通過測定血脂（TG、TC、LDL－C、HDL－C）、ET－1 及IL－6 的含量，發(fā)現大黃?蟲丸能降低ET－1、IL－6、TG、TC 和LDL－C 的含量，升高HDL－C的含量，從而有效治療下肢動脈硬化閉塞癥。

血小板在血液的凝固過程中發(fā)揮著重要生理作用，是主要接受信號的效應器。血小板受到刺激后，可以釋放一系列產物，引起血管收縮，損傷內皮細胞，引起血流流速減慢，從而聚集在血管內膜，導致血液凝固，最終導致形成血栓。

血小板形態(tài)的變化、聚集的程度及血小板有效成分能否被激活，都取決于血小板能否被活化［15］，血小板只有被活化后，才能參與動脈粥樣硬化、血栓形成，在心腦血管、外周動脈血栓性疾病的形成過程中起著重要作用。相關研究發(fā)現，在形成血栓前，其體內的血小板已經開始逐漸活化，此時的血小板是導致血栓的主要誘因［16］，也是誘發(fā)和促使血管壁收縮，引起炎癥反應的始動因素［17］。

PAF 是最為有效的血小板激活劑，可以使血小板的形態(tài)發(fā)生變化、進一步引起聚集、釋放，是血小板聚集誘導劑和炎癥因子，增強炎性反應和血小板聚集，收縮血管，釋放氧自由基用等，在血栓形成的病理、生理過程中起重要作用［18］。也是最強的血小板聚集劑，在體內有著類似于激素的廣泛生物學活性，在啟動和擴大血栓形成中具有重要意義。與健康人血小板相比，在心、腦、外周血管血栓類疾病中，起關鍵作用是血小板的活化，一旦血小板活化后便可以激活血液中的中性粒細胞，使之發(fā)生聚集，釋放大量氧自由基（ROS）［19］。在血栓形成、動脈粥樣硬化形成之初，PAF 起了重要的始動作用，使血小板與粒細胞的交互作用［20］。VARGAFITG 等提出，在腺苷二磷酸、血栓素A2 途徑導致血小板的聚集之后，PAF 是導致血小板聚集的第三條途徑的重要介質［21］。脂蛋白相關磷脂酶A2 是全新的炎癥標志物，它們和冠狀動脈粥樣硬化有著密切的關系［22］。炎癥介質及反應在動脈粥樣斑塊的形成、發(fā)生和發(fā)展，甚至最后破裂階段無處不在。研究表明，細胞表面PAF 與其受體結合后，導致G 蛋白與GTP 結合，產生二酰甘油和三磷酸肌醇，脂蛋白相關磷脂酶A2 從細胞膜上釋放花生四烯酸轉變?yōu)檠ㄋ谹2，從而引起動脈粥樣硬化、血栓形成。

隨著動脈硬化的加重，內膜的不斷增生，平滑肌纖維排列紊亂加重，內皮細胞脫落增加，炎細胞浸潤的增加，平滑肌結構的紊亂，大量泡沫細胞形成，PAF 的含量也隨之增加，提示PAF 蛋白的增多與下肢動脈硬化閉塞癥密切相關，PAF參與了ASO的發(fā)生、發(fā)展。本研究中采用Western blot 分析法檢測各組下肢動脈硬化閉塞癥大鼠血管細胞中PAF 蛋白的表達水平，結果大黃?蟲丸各劑量組治療后PAF 表達明顯減少，提示PAF蛋白的含量可反映出ASO的嚴重程度及轉歸。

脂蛋白相關磷脂酶A2是一種炎癥標志物，代表脂類物質的代謝程度和炎癥反應程度，與血小板的不穩(wěn)定性關系密切。在心血管疾病中，被認為是獨立的危險因子，越來越受到關注。LP－PLA2是一種新型炎性標志物，由巨噬細胞、泡沫細胞等炎癥細胞產生、分泌［23］，可體現出血管壁周圍炎癥狀態(tài)。LP－PLA2在穩(wěn)定型和易損型斑塊中都可以存在，相比之下，在不穩(wěn)定斑塊中LP－PLA2 濃度異常增高，主要分布于斑塊的壞死核心、薄纖維帽的內膜間隙［24］。在AS 的形成、發(fā)展過程中，LP－PLA2 起著不可替代的作用，血液中LP－PLA2 的水平能夠直接或間接反映出炎性的嚴重程度，所以在AS相性疾病的評估中可以起到預防和監(jiān)測的作用［25］。LP－PLA2 可以通過載脂蛋白（Apo）B與脂蛋白結合，生成溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸等脂類促炎物質。從而引起血管內皮細胞凋亡和內皮屏障功能降低，產生各類黏附因子，在趨化炎癥細胞的作用下，生成更多促炎物質，促進動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展，最終導致動脈粥樣硬化的形成。隨著動脈硬化的加重，LP－PLA2 的含量也隨之增加，提示LPPLA2 蛋白的增多與下肢動脈硬化閉塞癥密切相關LP－PLA2 參與了ASO 的發(fā)生、發(fā)展。本研究中，采用Western blot 分析法檢測各組下肢動脈硬化閉塞癥大鼠血管細胞中LP－PLA2 蛋白的表達水平，結果大黃?蟲丸各劑量組治療后LP－PLA2 表達明顯減少，提示LP－PLA2 蛋白的含量可反映出ASO 的嚴重程度及轉歸。

總之，大黃?蟲丸不但能夠抑制血栓形成和血小板聚集，并且能夠降低血液的黏稠度，抑制膽固醇和甘油三酯的合成，具有抗動脈硬化、改善微循環(huán)的作用，對下肢動脈硬化閉塞癥有很好的治療效果。PAF可能通過激活LP－PLA2 通路，從而釋放大量促炎物質，導致下肢動脈硬化閉塞癥的發(fā)生和發(fā)展。大黃?蟲丸在早期通過抑制PAF/LP/PLA2 通路的激活，從而抑制各類炎癥因子的激活，減輕血管壁損傷，減輕動脈粥樣硬化，減輕血栓的形成，可以有效治療ASO。