李晶，林彩容，黃艷，鄧旭銘，王藝清，孫威江*

茶多酚對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響

李晶1,3,4，林彩容1,3,4，黃艷2,3,4，鄧旭銘1,3,4，王藝清1,3,4，孫威江1,3,4*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；3. 福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；4. 海峽兩岸特色作物安全生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002

為研究在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳體系中，茶多酚對農(nóng)桿菌侵染效率的影響，以LBA4404、EHA105、ATCC15834和K599 4個農(nóng)桿菌菌株為研究對象，分析其在不同濃度茶多酚處理下的耐酚能力、被膜完整率、吸附性、和基因表達，以及遺傳轉(zhuǎn)化差異。結(jié)果顯示，4個菌株的耐酚能力依次為LBA4404＞K599＞EHA105＞ATCC15834，其中EHA105和ATCC15834菌株對茶多酚較為敏感；ATCC15834菌株被膜完整率與茶多酚的濃度、靜置時間呈負相關(guān)，EHA105在600?mg·L-1茶多酚處理48?h后，其被膜完整率最低；ATCC15834和EHA105對煙草葉肉細胞的吸附能力隨著茶多酚濃度的升高而降低，在經(jīng)茶多酚處理24?h后，ATCC15834中和EHA105中的表達受到顯著抑制，表達量與低濃度酚類的敏感性呈正相關(guān)性；煙草經(jīng)農(nóng)桿菌菌液（含茶多酚）侵染后，瞬時轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率均受到不同程度的抑制，發(fā)狀根誘導(dǎo)率大大降低。1?000?mg·L-1茶多酚處理后，ATCC15834的發(fā)根誘導(dǎo)率最低，僅為13.85%，壞死率高達33.85%。綜上所述，茶多酚會降低農(nóng)桿菌活力和被膜完整率，基因通過降低表達量影響其吸附性，最終導(dǎo)致煙草轉(zhuǎn)化體系中瞬時轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率均受到不同程度的抑制。

茶多酚；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；吸附性；和基因；遺傳轉(zhuǎn)化

茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，其主要成分包括黃烷醇類（以兒茶素類化合物為主）、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等[1-2]。茶多酚作為一種廣譜、強效、低毒的抗菌藥物，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有明顯抑制作用[3-4]。有研究報道，茶多酚對12個細菌類群近百種細菌具有抑制作用，其抑菌能力與濃度呈正相關(guān)[5-9]。

農(nóng)桿菌（）為根瘤菌科農(nóng)桿菌屬革蘭氏陰性細菌，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，多酚類物質(zhì)在植物遺傳轉(zhuǎn)化中具有重要的作用。低濃度多酚類物質(zhì)可作為化學(xué)趨化劑，吸引農(nóng)桿菌向植物細胞移動，并激活農(nóng)桿菌基因表達系統(tǒng)[10-12]，提高如小麥[13]，水稻[14]等作物遺傳轉(zhuǎn)化率。在特定濃度范圍內(nèi)，多酚類物質(zhì)在茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系中扮演抑菌劑的作用，主要有3個原因：（1）多酚會在一定范圍內(nèi)抑制農(nóng)桿菌的趨化作用，阻止農(nóng)桿菌進入植物傷口，影響農(nóng)桿菌與植物細胞之間的吸附性[15-22]；（2）多酚會抑制農(nóng)桿菌的生長活力，并使基因表達受到抑制、vir蛋白被沉淀等；（3）多酚類物質(zhì)的氧化作用會產(chǎn)生一種深褐色的聚合物，導(dǎo)致組織培養(yǎng)中外植體褐化、壞死[23]。以上可能是茶多酚影響茶樹轉(zhuǎn)化效率低的主要原因。

在茶樹的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，前人對農(nóng)桿菌菌株展開了相關(guān)研究。宋大鵬[24]研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌在愈傷組織提取液中能正常生長；在茶鮮葉提取液中，根癌農(nóng)桿菌GV3101和發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834活力受到影響，使得、和基因表達受到明顯抑制，這種抑制作用來自于鮮葉中的兒茶素類物質(zhì)。毛清黎等[25]研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素對發(fā)根農(nóng)桿菌R1000有抑制作用。倉梅芹等[26]通過研究A4和R12556等4個農(nóng)桿菌菌株的茶多酚耐受性，發(fā)現(xiàn)它們在未添加茶多酚的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36?h內(nèi)均呈現(xiàn)對數(shù)生長，而不同濃度茶多酚對農(nóng)桿菌的生長抑制效果存在顯著性差異。

本研究選取根癌農(nóng)桿菌（EHA105、LBA4404）和發(fā)根農(nóng)桿菌（K599、ATCC15834），檢測茶多酚對農(nóng)桿菌生長活力的影響，并從中選取敏感度高的菌株進一步研究茶多酚對其被膜完整性、吸附性以及相關(guān)基因表達量的影響，探討茶多酚對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的作用機制。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系中，本研究旨在為茶樹品種（適宜的茶多酚含量）、菌株的選擇提供理論依據(jù)，為茶樹分子生物學(xué)育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶多酚（純度≥99%），購于上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。煙草種子來源于福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組中心，采用氯氣消毒法，播種至1/2 MS培養(yǎng)基，25℃，每天光照12?h，培養(yǎng)至長出6～8片真葉。

農(nóng)桿菌菌株采用根癌農(nóng)桿菌EHA105、LBA4404，發(fā)根農(nóng)桿菌K599、ATCC15834；其中菌株EHA105、LBA4404、K599、大腸桿菌DH5為本實驗室保存，菌株ATCC15834由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)趙劍教授提供。雙元表達載體pBI121，攜帶GUS基因，為本實驗室保存；原核廣宿主表達載體為pBBR1MCS2-Tac-EGFP，攜帶eGFP標記基因，抗生素類型均為卡那霉素，購買于湖南豐暉生物科技有限公司。

YP固體培養(yǎng)基：酵母提取物5?mg·L-1，蛋白胨10?mg·L-1，NaCl 10?mg·L-1，瓊脂12?mg·L-1，pH 7.0，121℃滅菌20?min。

YMB培養(yǎng)基：酵母提取物1?mg·L-1，甘露醇10?mg·L-1，K2HPO40.5?mg·L-1，MgSO4·7H2O 0.2?mg·L-1，NaCl 0.1?mg·L-1，pH 7.0，121℃滅菌20?min。

1.2 試驗方法

1.2.1 農(nóng)桿菌的活化與菌液制備

農(nóng)桿菌活化：將相應(yīng)農(nóng)桿菌劃線于含抗生素的YP固體培養(yǎng)基中，利福平（Rifampicin，Rif）質(zhì)量濃度為25?mg·L-1，加入對應(yīng)的抗生素質(zhì)量濃度均為50?mg·L-1，28℃恒溫箱中暗培養(yǎng)2?d，用無菌接種環(huán)挑取單克隆于YP液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫搖床，200?r·min-1振蕩培養(yǎng)再次活化至菌液渾濁，用移液槍取出1?000?μL菌液，加入100?mL YP液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8。

菌液的制備：將活化好的農(nóng)桿菌菌液，于10?000離心15?min，去除上清液后用侵染液（1/2 MS+0.20?g·L-1酸水解酪蛋白+10?g·L-1蔗糖+0.5?g·L-1MES）重懸，分別加入質(zhì)量濃度為200、400、600、800?mg·L-1和1?000?mg·L-1的茶多酚，對照1加入等體積無菌水，對照2用含相應(yīng)茶多酚的侵染液代替（不含農(nóng)桿菌），總體積為50?mL，室溫靜置1?h，用于侵染煙草葉盤。

1.2.2 農(nóng)桿菌抑制率的測定

在含有不同濃度茶多酚的YMB培養(yǎng)基中加入活化好的農(nóng)桿菌菌液，起始濃度的OD600=0.05，分別在3、6、9、12、18、24、30、36、48、60?h取1?mL菌液，以含對應(yīng)濃度茶多酚的YMB培養(yǎng)基為參比，測定600?nm處吸光值，光程為1?cm。處理設(shè)3個重復(fù)。記錄其生長曲線，并根據(jù)生長曲線計算茶多酚對農(nóng)桿菌的抑菌率，公式如下：

茶多酚對農(nóng)桿菌的抑制率=（1－處理組OD600/對照組OD600）×100%

1.2.3 pBBR1MCS2-Tac-mCherry原核表達載體構(gòu)建

將pBBR1MCS2-Tac-EGFP載體用EcoRⅠ和PvuⅠ核酸酶進行酶切回收；再根據(jù)相關(guān)片段設(shè)計引物將Tac啟動子和mCherry片段進行PCR擴增，最后用Infusion試劑盒連接pBBR1MCS2骨架、tac啟動子和mCherry片段。采用凍融法將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中，通過菌落PCR鑒定陽性菌落，雙酶切驗證后，再挑取陽性菌落進行測序驗證。

1.2.4 農(nóng)桿菌細胞被膜完整性的測定

按1.2.1章節(jié)方法活化并用茶多酚處理ATCC15834和EHA105農(nóng)桿菌，于室溫靜置1、24?h和48?h后分別取樣。用LIVE/DEAD BacLight試劑盒測定農(nóng)桿菌細胞被膜完整性，用多功能酶標儀測定紅熒光值：激發(fā)波長為485?nm，測定發(fā)射波長為530?nm處熒光強度（Emission 1，綠色）；保持激發(fā)波長為485?nm不變，測定激發(fā)波長為630?nm處熒光強度（Emission 2，紅色）。并繪制標準曲線，計算出菌液中農(nóng)桿菌的被膜完整率。

1.2.5 農(nóng)桿菌與煙草葉肉細胞之間吸附性的測定

共培養(yǎng)方法：將煙草置于不同菌液中侵染10?min，然后取出并用無菌濾紙吸干多余菌液，背面朝上平鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)一定時間后取出，置于杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS）中，洗去游離農(nóng)桿菌，隨機選取3個葉盤制備臨時裝片。

處理1：將煙草葉片置于含有EHA105-pBBR1MCS2-Tac-EGFP和ATCC15834-pBB R1MCS2-Tac-EGFP的菌液，按照上述方法暗培養(yǎng)48?h。

處理2：將煙草葉片置于含有EHA105-pBBR1MCS2-Tac-mCherry和ATCC15834-pBBR1MCS2-Tac-mCherry的菌液（菌液含茶多酚），按照上述方法暗培養(yǎng)24?h后取出，用侵染液清洗兩遍；再分別用含EHA105-pBBR1M CS2-Tac-EGFP和ATCC15834-pBBR1MCS2-Tac-EGFP的菌液再次侵染。

使用激光共聚焦顯微鏡分別觀察處理1和處理2的紅綠色熒光農(nóng)桿菌在煙草細胞外圍分布情況。

1.2.6 農(nóng)桿菌DNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

菌株采用EHA105-pBI121和ATCC15834-pBI121。將煙草葉片置于菌液中侵染10?min，取5?mL菌液，用于農(nóng)桿菌RNA提取。將煙草按照1.2.5章節(jié)的方法進行共培養(yǎng)后，加入新的D-PBS，加入數(shù)滴吐溫-20并劇烈渦旋，將附著在煙草葉肉細胞上的農(nóng)桿菌洗脫；收集上清液，用于農(nóng)桿菌RNA提取。

每個處理重復(fù)3次。采用trizol-up法進行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄采用全式金生物有限公司TransScript?II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）試劑盒完成，cDNA保存于–20℃，稀釋50倍使用。

1.2.7 農(nóng)桿菌基因及基因表達檢測

以農(nóng)桿菌cDNA為模板，農(nóng)桿菌基因組為內(nèi)參基因，采用全式金生物有限公司PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒對部分基因進行實時熒光定量PCR檢測，測定EHA105和ATCC15834部分基因和基因表達情況，數(shù)據(jù)結(jié)果取3次技術(shù)重復(fù)平均值。

1.2.8 不同農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時轉(zhuǎn)化和煙草遺傳轉(zhuǎn)化

將煙草葉片分別放入含有EHA105-pBI121和ATCC15834-pBI121菌液中，對照1用無菌水，對照2用含茶多酚的侵染液，侵染5?min后，22℃暗培養(yǎng)2?d。

將經(jīng)過EHA105-pBI121菌液培養(yǎng)的煙草用無菌水清洗兩遍，加入GUS染液，37℃黑暗過夜孵育，用75%乙醇脫葉綠素，葉綠素脫去后拍照。

將經(jīng)過ATCC15834-pBI121菌液培養(yǎng)的煙草用含500?mg·L-1頭孢噻肟鈉的MS液體培養(yǎng)基浸泡20?min，無菌水清洗2遍，無菌濾紙吸干后置于1/2MS+300?mg·L-1特美汀+300?mg·L-1頭孢噻肟鈉固體培養(yǎng)基上進行脫菌培養(yǎng)，每7?d轉(zhuǎn)接1次，直至無明顯菌落形成，2周后統(tǒng)計外植體發(fā)狀根和壞死率。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚濃度對菌株抑制率的影響

農(nóng)桿菌的活性與茶多酚的濃度和培養(yǎng)時間有關(guān)。由表1可知，茶多酚對根癌農(nóng)桿菌LBA4404和EHA105的抑制率總體呈現(xiàn)隨茶多酚濃度的升高而上升的趨勢，隨培養(yǎng)時間延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。LBA4404在培養(yǎng)3?h時，抑制率均為負值，且抑制率隨著茶多酚濃度的升高而升高，說明此時茶多酚對LBA4404起促進作用。但隨著茶多酚濃度的升高，促進作用逐漸減小。在3～9?h時間段，茶多酚對EHA105的抑制率明顯大于對LBA4404的抑制率；EHA105在3～6?h的抑制率與茶多酚濃度和培養(yǎng)時間呈正相關(guān)，在9?h時出現(xiàn)了抑制率下降的情況；在12?h時，相同濃度的茶多酚對LBA4404的抑制率大于EHA105。

對發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834和K599抑制率總體隨著茶多酚濃度的升高而升高；隨著培養(yǎng)時間的延長先升高后降低，對ATCC15834的抑制率在培養(yǎng)9?h后開始下降，遲于K599。培養(yǎng)6?h后，對ATCC15834的抑制率均大于對K599的抑制率。

表1 茶多酚對農(nóng)桿菌抑制率的影響

注：同一菌株在相同時間下的比較，不同小寫字母表示0.05差異顯著

Note: Comparison of the same strain at same time, different lowercase letters indicate significant difference (<0.05)

2.2 不同農(nóng)桿菌對茶多酚耐受性比較

前期試驗發(fā)現(xiàn)，本研究中的4種農(nóng)桿菌在不同濃度的茶多酚培養(yǎng)基中培養(yǎng)60?h時基本處于平臺期，細胞增長個數(shù)已趨于穩(wěn)定，因此選取培養(yǎng)時間為60?h的農(nóng)桿菌測定其在茶多酚不同濃度下的耐受性。由圖1可知，在不同濃度茶多酚處理下，不同菌株的生長差異顯著。LBA4404菌液濃度隨茶多酚濃度的升高，整體變化相對較小，對茶多酚耐受性最強。ATCC15834在200?mg·L-1茶多酚處理下，菌液濃度顯著高于其他處理組；茶多酚質(zhì)量濃度為400～800?mg·L-1時，菌液濃度變化差異不顯著；K599和EHA105在1?000?mg·L-1茶多酚處理下菌液濃度顯著高于對照組和其他處理組。以上結(jié)果表明，LBA4404和K599對茶多酚有較強的耐受能力，EHA105和ATCC15834對茶多酚較為敏感。因此，選取ATCC15834和EHA105進行后續(xù)試驗。

2.3 茶多酚對農(nóng)桿菌細胞被膜完整性的影響

測定ATCC15834和EHA105菌株的綠、紅色熒光值，計算農(nóng)桿菌的被膜完整率，結(jié)果表明，農(nóng)桿菌細胞被膜的完整性與茶多酚濃度和靜置時間高度相關(guān)。

如圖2所示，靜置1?h時，ATCC15834的被膜完整率與對照組無顯著差異；EHA105被膜完整率在200、400?mg·L-1和600?mg·L-1處理組與對照組存在顯著差異。靜置24?h，ATCC15834和EHA105的對照組被膜完整率顯著高于處理組，且ATCC15834的被膜完整率隨茶多酚濃度升高而降低，EHA105則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。靜置48?h時，ATCC15834的對照組和處理組被膜完整率均大幅降低；對照組高于處理組且處理組的被膜完整率隨茶多酚濃度升高而降低，差異顯著；EHA105的對照組與處理組被膜完整率也大幅下降，對照組顯著高于處理組。

注：同一菌株在不同茶多酚濃度之間的比較，不同小寫字母表示P<0.05差異顯著

注：同一時間不同小寫字母表示P<0.05差異顯著。下同

2.4 茶多酚對農(nóng)桿菌與煙草葉肉細胞吸附性的影響

激光共聚焦結(jié)果表明（圖3），茶多酚濃度對農(nóng)桿菌煙草葉肉細胞的吸附量影響顯著。共培養(yǎng)48?h時（處理1），ATCC15834與EHA105相比，綠色熒光更多，說明其在煙草細胞壁外附著量更高；ATCC15834和EHA105的綠色熒光隨著茶多酚濃度的升高而減少，說明其吸附能力隨著茶多酚濃度的升高而降低。

ATCC15834和EHA105共培養(yǎng)24?h，清除茶多酚后再培養(yǎng)24?h（處理2），如圖3所示，農(nóng)桿菌可重新吸附到煙草細胞壁上（綠色熒光）；隨著茶多酚濃度升高，紅色熒光減少，而去除茶多酚后，農(nóng)桿菌可重新吸附到煙草細胞壁外，且農(nóng)桿菌吸附量（綠色熒光）與對照相比呈現(xiàn)出更高的吸附能力。

2.5 茶多酚對chv基因表達的影響

如圖4所示，ATCC15834經(jīng)茶多酚處理1?h后，隨茶多酚濃度的升高表達量升高，、、和表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，表達量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；、、、和在800?mg·L-1茶多酚處理中出現(xiàn)最高的表達量，且顯著高于對照組；在所有處理組中的表達量均高于對照組，且在茶多酚質(zhì)量濃度為400?mg·L-1時表達量最高；而在所有處理組中的表達量顯著低于對照組。共培養(yǎng)24?h后，在200?mg·L-1茶多酚處理下的、、和表達量顯著高于對照組和其他處理組，400、600?mg·L-1和800?mg·L-1茶多酚處理下的、、和表達量差異不顯著；表達量在茶多酚質(zhì)量濃度為800?mg·L-1時達到最高，600?mg·L-1和1?000?mg·L-1茶多酚處理組顯著低于其他組；基因在1?000?mg·L-1茶多酚處理組表達量顯著高于對照組，而對照組表達量顯著高于其他處理組。

EHA105經(jīng)茶多酚處理1?h后，和的表達量低于對照組；在400?mg·L-1茶多酚處理下，基因表達量顯著高于對照組和其他處理組；在200?mg·L-1和400?mg·L-1茶多酚處理下，基因表達量也顯著高于對照組和其他處理組。共培養(yǎng)24?h后，隨茶多酚濃度升高，和等7個基因表達量先升高后降低，和在200?mg·L-1茶多酚處理下，表達量達到最高值，則在400?mg·L-1茶多酚處理下表達量達到最高值；800?mg·L-1和1?000?mg·L-1茶多酚處理下，基因與對照組差異不顯著，而和基因的表達量顯著低于對照組。

上述結(jié)果表明，不同菌株同一基因?qū)Σ瓒喾拥姆磻?yīng)不同，同一菌株不同基因?qū)Σ瓒喾拥姆磻?yīng)也不同，且表達變化與時間和茶多酚濃度呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性。

圖3 茶多酚對EHA105、ATCC15834與煙草葉片細胞之間吸附性的影響

圖4 茶多酚對農(nóng)桿菌EHA105和ATCC15834 chv基因表達量的影響

2.6 茶多酚對vir基因表達的影響

如圖5所示，EHA105經(jīng)茶多酚處理1?h后，隨茶多酚濃度升高，、和所有處理組的表達量均顯著低于對照組，與對照組表達量差異不顯著；、、、、和呈現(xiàn)先升后降的趨勢，均顯著高于對照組。共培養(yǎng)24?h后，在所有茶多酚處理組中，和表達量均顯著高于對照組，均顯著低于對照組。

ATCC15834中，菌液經(jīng)茶多酚處理1?h后，茶多酚處理組、、、、、、和基因表達量高于對照組，和表達量顯著低于對照組。共培養(yǎng)24?h后，茶多酚處理組中、、、、、、、和表達量低于對照組，表達量高于對照組；在200?mg·L-1茶多酚處理組中，其表達量顯著低于其他組；在800?mg·L-1茶多酚處理組中表達量顯著高于對照組，其他處理組顯著低于對照組；在800?mg·L-1處理組表達量顯著高于對照組，而在其他處理組中的表達量均低于對照組（圖6）。

圖5 茶多酚對EHA105 vir基因表達量的影響

2.7 EHA105和ATCC15834介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化

為探明茶多酚對農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化效率是否有影響，通過GUS染色檢驗煙草葉片瞬時轉(zhuǎn)化效果。如圖7所示，在共培養(yǎng)3?d后，茶多酚處理組的煙草葉盤切口處出現(xiàn)褐變，且隨茶多酚濃度升高，褐變程度加重，并在1?000?mg·L-1茶多酚處理下出現(xiàn)壞死，而對照組葉盤保持綠色，無黃化或褐變產(chǎn)生；本研究發(fā)現(xiàn)含不同濃度茶多酚的菌懸液均可侵染煙草，GUS染色均呈現(xiàn)陽性。與對照組相比，處理組隨茶多酚濃度升高，染色程度變淺。

采用含不同濃度茶多酚的菌懸液侵染煙草葉盤，共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至無激素的1/2 MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)發(fā)狀根，并統(tǒng)計2周后的發(fā)狀根誘導(dǎo)率和壞死率。結(jié)果如表2所示，ATCC15834發(fā)狀根誘導(dǎo)率隨茶多酚濃度升高而降低，而壞死率隨茶多酚濃度升高而增加；在1?000?mg·L-1茶多酚處理后，發(fā)根誘導(dǎo)率僅為13.85%、壞死率達33.85%。

圖7 茶多酚對農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的煙草瞬時轉(zhuǎn)化GUS染色的影響

3 討論

本研究分析了不同茶多酚濃度對4個菌株的抑菌率，挑選出兩個對茶多酚較為敏感的菌株ATCC15834和EHA105，并對茶多酚濃度影響兩個菌株的機理進行了深入的探討。前人研究表明，低濃度多酚類物質(zhì)可作為化學(xué)趨化劑，吸引農(nóng)桿菌向植物細胞移動，并激活農(nóng)桿菌基因表達系統(tǒng)。本研究發(fā)現(xiàn)，EHA105和K599在茶多酚質(zhì)量濃度為0～200?mg·L-1時生長受到抑制，在200?mg·L-1以上時出現(xiàn)耐酚性增長。低濃度茶多酚的界值是一個相對模糊的概念，不同菌株對茶多酚的敏感度不同，產(chǎn)生偏差是正常的。此外，在不同茶多酚濃度下細胞生長速率會受到不同程度的抑制，細胞的死亡速率也有所差異，OD值也會受到這兩方面因素的影響。

通過茶多酚對ATCC15834和EHA105菌株被膜完整性的研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌的被膜完整性與茶多酚的濃度和培養(yǎng)時間有關(guān)，與前人研究結(jié)果一致[27-29]。不同濃度茶多酚處理下，EHA105變化規(guī)律不明顯，ATCC15834較為敏感，在培養(yǎng)1?h時就與對照組出現(xiàn)了顯著的差異。生物被膜的反應(yīng)機制較為復(fù)雜，涉及多種信號因子的調(diào)控。多酚類物質(zhì)可以通過與細菌外膜螯合，釋放脂多糖從而破壞細菌膜結(jié)構(gòu)的完整性[28]，本研究中ATCC15834和EHA105菌株的被膜完整性表現(xiàn)出對茶多酚不同的響應(yīng)，推測是不同菌株的胞外多糖差異的原因所造成的。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化效率受vir蛋白的影響。vir蛋白參與T-DNA的加工、轉(zhuǎn)移和整合等過程，而吸附過程與基因有關(guān)。Sharma等[30]用兒茶素類提取物進行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)兒茶素會抑制表皮葡萄球菌、黃體微球菌、短桿菌、熒光假單胞菌和枯草芽孢桿菌的生長，且最小抑菌濃度會顯著抑制細菌與綠猴腎上皮細胞之間的吸附性。本研究證實了茶多酚能顯著抑制農(nóng)桿菌對煙草細胞的吸附作用，抑制效率與茶多酚濃度呈正相關(guān)。農(nóng)桿菌附著植物細胞時，起關(guān)鍵作用的是細胞表面的多聚糖，等基因均會影響農(nóng)桿菌對植物細胞的附著與識別，茶多酚處理24?h后，ATCC15834中和EHA105中的表達量受到顯著抑制，因此可能是由于的編碼產(chǎn)物-1,2葡聚糖合成受到阻礙，導(dǎo)致農(nóng)桿菌的吸附能力降低。一方面，在不同農(nóng)桿菌菌株之間的表達模式不盡相同，會導(dǎo)致不同菌株對酚類物質(zhì)和受體細胞感知的敏感差異性；另一方面，糖類物質(zhì)的含量與對低濃度酚類的敏感性呈正相關(guān)性[31]，經(jīng)茶多酚處理后，不同菌株在糖類物質(zhì)含量上的差異，也是影響農(nóng)桿菌對茶多酚敏感性差異的原因之一。

煙草轉(zhuǎn)化體系的侵染液加入茶多酚，不同程度的抑制瞬時轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率，發(fā)狀根誘導(dǎo)率大大降低，煙草葉片出現(xiàn)了發(fā)黃、褐變的癥狀。隨茶多酚濃度升高，整個外植體黃化，壞死率不斷上升，外植體再生性受到抑制，導(dǎo)致煙草遺傳轉(zhuǎn)化效率下降。有研究表明，植物細胞受到的傷害主要包括侵染前需人為制造的機械損傷和后續(xù)來自農(nóng)桿菌的傷害，而植物受到傷害后，抗氧化酶系統(tǒng)被激活，促進酚類物質(zhì)的合成和積累，提高抵抗力，但多酚類物質(zhì)易被多酚氧化酶氧化成醌類物質(zhì)，進而抑制細胞的生命活動，造成組織褐變、壞死[32]。

本研究通過分析農(nóng)桿菌對茶多酚耐受性、茶多酚對農(nóng)桿菌細胞被膜完整性和細胞吸附性、基因和基因表達的影響以及茶多酚對根癌農(nóng)桿菌EHA105和發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化效率的影響，為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系提供了一定的理論基礎(chǔ)，為進一步提高茶樹遺傳轉(zhuǎn)化效率做了深入的探討。

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Effects of Tea Polyphenols on-mediated Plant Genetic Transformation System

LI Jing1,3,4,LIN Cairong1,3,4,HUANG Yan2,3,4,DENG Xuming1,3,4,WANG Yiqing1,3,4,SUN Weijang1,3,4*

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Anxi College of Tea Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Quanzhou 362400, China; 3. Fujian Tea Industry Engineering Technology Research Center, Fuzhou 350002, China; 4. Ministerial and Provincial Joint Innovation Centre for Safety Production of Cross-Strait Crops, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

In order to study the effect of tea polyphenols on the infection efficiency ofin tea plant genetic system mediated by, fourstrains LBA4404, EHA105, ATCC15834 and K599 were used as research objects. The phenolic resistance, membrane integrity, adsorption,gene andgene expression and genetic transformation ofunder different concentrations of tea polyphenols were analyzed. The results show that: (1) the phenolic resistance of the four strains followed the order of LBA4404>K599>EHA105>ATCC15834, and EHA105 and ATCC15834 were more sensitive to tea polyphenols. (2) The ratio of ATCC15834 with intact membrane was negatively correlated with the concentration of tea polyphenols and the standing time, and the lowest intact membrane rate of EHA105 appeared 48?h after treatment with 600?mg·L-1tea polyphenols. (3) The adsorption capacities of ATCC15834 and EHA105 on tobacco mesophyll cells decreased with the increase of tea polyphenol concentrations. After treatment with tea polyphenols for 24?h, the expressions ofandin ATCC15834 and EHA105 were significantly inhibited. The expression ofwas positively correlated with the sensitivity to low concentration phenols. (4) After infecting tobacco by thesolution (containing tea polyphenols), the transient and stable transformation efficiencies were inhibited to varying degrees, and the induction rate of hairy roots was greatly reduced. When the concentration of tea polyphenols was 1?000?mg·L-1, ATCC15834 achieved the lowest root induction rate of 13.85% and the highest necrosis rate of 33.85%. In conclusion, tea polyphenols could reduce the activity and membrane integrity rate of, and reduce the expression ofgene to affect its adsorption, which finally suppress the instantaneous conversion efficiency and the stable conversion efficiency in tobacco conversion system to varying degrees.

tea polyphenol,-mediated, adsorbability,andgene, genetic transformation

S571.1

A

1000-369X(2022)04-477-14

2021-12-30

2022-03-29

國家自然科學(xué)基金（31770732）、福建省高校產(chǎn)學(xué)合作項目（2019N5007）、福建主要茶類原產(chǎn)地溯源與標準體系研究（K1520005A04）、福建張?zhí)旄２枞~發(fā)展基金會科技創(chuàng)新基金（FJZTF01）

李晶，女，碩士研究生，主要從事茶樹栽培育種與生物技術(shù)研究。*通信作者：swj8103@126.com