劉樂樂， 欒思楠， 周佳圓， 王伏林， 樸春蘭， 崔敏龍

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院， 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué)園藝科學(xué)學(xué)院， 杭州 311300；3.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)所， 杭州 310021)

MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族在植物的生殖發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，該轉(zhuǎn)錄因子家族名稱由釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子MINICHROMOSOMEMAINTENANCECE1(MCM1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的AGAMOUS(AG)基因、金魚草(Antirrhinummajus)中的DEFICIENS(DEF)基因和人血清應(yīng)答因子SERUMRESPONSEFACTOR(SRF)的首字母所構(gòu)成[1-4]。在植物中MADS-box基因編碼的MIKC型蛋白以其特殊的MIKC結(jié)構(gòu)域而得名，包含MADS(M-)、Intervening(I-)、Keratin-like(K-)以及 C-terminal(C-) 共四個(gè)結(jié)構(gòu)域[5-6]。AG類基因作為MADS-box基因家族中的一員，其在花和果實(shí)的發(fā)育過程中均會(huì)發(fā)揮作用[7-8]。AG基因由Yanofsky等[2]于1990年首次在擬南芥中被克隆，通過研究發(fā)現(xiàn)，ag突變體植株的雄蕊被花瓣所替代，心皮被萼片所替代，這表明AG基因?qū)ㄆ鞴侔l(fā)育具有重要的作用。

在茄科(Solanaceae)植物中，AG類基因的功能更為復(fù)雜，例如在煙草(Nicotianatabacum)中異源表達(dá)陸地棉(Gossypiumhirsutum)的GhMADS3基因會(huì)導(dǎo)致萼片向心皮、花瓣向雄蕊的轉(zhuǎn)變，同時(shí)花器官會(huì)表現(xiàn)出白化現(xiàn)象[9]。矮牽牛(Petuniahybrida)中的FLORALBINDINGPROTEIN7(FBP7)、FBP11共抑制突變體胚珠會(huì)形成“意大利面狀”結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其無法正常發(fā)育；在過表達(dá)植株中則會(huì)在萼片上產(chǎn)生類似胚珠狀的組織[10-11]。番茄(Solanumlycopersicum)中過表達(dá)TOMATOAGAMOUS1(TAG1)、TOMATOAGAMOUS-Like1(TAGL1)、TAGL11均會(huì)導(dǎo)致萼片膨大，轉(zhuǎn)變?yōu)槿赓|(zhì)化果實(shí)狀器官，同時(shí)會(huì)形成類似果實(shí)中的代謝過程[12]，這些研究結(jié)果都表明AG類基因?qū)η芽浦参锘ê凸麑?shí)發(fā)育都具有重要的作用。

茄科植物作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，前人的研究主要集中于番茄、矮牽牛等模式植物中，在其他茄科植物中，由于轉(zhuǎn)化體系不成熟、栽培空間限制等原因?qū)е卵芯坎怀浞?，同時(shí)AG類基因的相關(guān)研究主要集中于花器官發(fā)育，對(duì)果實(shí)發(fā)育的影響研究較少。龍葵(S.nigrum)作為茄科植物中的一員，主要分布于歐洲、亞洲、美洲的溫帶及熱帶地區(qū)，具有重要的食用及藥用價(jià)值[13]，相較于其他茄科植物，龍葵具有轉(zhuǎn)化體系成熟，栽培空間較小，肉質(zhì)果實(shí)明顯等優(yōu)點(diǎn)，可以作為優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)材料。為了進(jìn)一步研究AG類基因?qū)η芽乒麑?shí)發(fā)育的影響，本研究以龍葵為材料，通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選獲得一個(gè)AG類基因SnAGL47，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，不同部位組織特異性表達(dá)分析，并通過在龍葵中超表達(dá)SnAGL47分析其表型變化，初步驗(yàn)證SnAGL47的生物學(xué)功能，這些結(jié)果為深入了解茄科植物中AG類基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以實(shí)驗(yàn)室的龍葵種子為材料，溫度為25 ℃、光周期為18 h/6 h種植于人工氣候室。分別取野生型龍葵盛花期的不同組織(根、莖、葉、花)以及不同的花器官(萼片、花瓣、雄蕊、心皮)，在液氮中速凍，于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2 SnAGL47基因的克隆及生物信息學(xué)分析

通過對(duì)龍葵轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(翰宇生物科技有限公司，上海)數(shù)據(jù)分析，篩選獲得一個(gè)AG類SnAGL47。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物(表 1)，以龍葵花cDNA為模板，克隆SnAGL47基因目的片段并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。經(jīng)ProtParam[14]對(duì)SnAGL47基因的蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。將SnAGL47基因序列在National Coalition Building Institute(NCBI)網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行Blastx檢索，下載各物種的AG類基因的氨基酸FASTA格式文件；運(yùn)用Clustal X 2.1[15]軟件和MEGA-X 10.0.5[16]軟件，使用最大似然法(Maximum likelihood method)進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，Bootstrap 值取1 000 次，GeneDoc 2.7.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)結(jié)果修飾，iTOL[17]軟件進(jìn)化樹在線美化工具對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

1.3 SnAGL47基因的組織特異性表達(dá)分析

使用Eastep?Super總RNA提取試劑盒(普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司，上海)提取盛花期生長(zhǎng)狀況良好的野生型龍葵不同部位(根、莖、葉、花、萼片、花瓣、雄蕊、心皮)的RNA，利用超微量紫外可見分光光度計(jì)(Nanodrop-2000)測(cè)定RNA的純度及質(zhì)量，并使用cDNA合成試劑盒EasyScript?First-strand cDNA Synthesis SuperMix(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)合成cDNA。以龍葵Sn18s基因?yàn)閮?nèi)參基因(表 1)，使用EasyTaq?DNA Polymerase for PAGE(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)。

表1 基因克隆及表達(dá)分析所用引物Table 1 Primer sequences used in gene cloning and expression analysis

1.4 SnAGL47轉(zhuǎn)基因植株的鑒定及表達(dá)量分析

將超表達(dá)載體PBI 121-35 S∷SnAGL47(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)對(duì)龍葵進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)基因植株T0代，利用SDS法提取轉(zhuǎn)基因植株頂端幼嫩葉片DNA，經(jīng)卡那霉素引物(NPT-Ⅱ)及特異性引物PCR(表 1)鑒定篩選陽性植株。反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 總延伸10 min。收獲T0代種子進(jìn)行子代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因陽性植株后，提取轉(zhuǎn)基因陽性植株與野生型植株幼嫩葉片的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR分析SnAGL47表達(dá)量。

1.5 SnAGL47轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

對(duì)轉(zhuǎn)基因植株與野生型進(jìn)行形態(tài)學(xué)比對(duì)觀察，使用尼康相機(jī)(P 7100)分別對(duì)營養(yǎng)生長(zhǎng)階段及生殖生長(zhǎng)階段的整體株型進(jìn)行拍照。取相同位置完全盛開時(shí)期的花和成熟期果實(shí)在萊卡體式顯微鏡(M 165 FC)下進(jìn)行拍照，并將不同的花器官進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6 SnAGL47轉(zhuǎn)基因植株花青素含量測(cè)定

取完全成熟期果實(shí)及轉(zhuǎn)基因植株紫色果萼，重復(fù)取樣3次，使用液氮速凍研磨后取0.1 g樣品，加入1 mL 2%鹽酸-甲醇溶液，置于4 ℃冰箱24 h，12 000 r/min離心1 min，取200 μL上清液加入1.5 mL 2%鹽酸-甲醇溶液中。使用島津紫外可見分光光度計(jì)(UV-2600)分別測(cè)定530 nm和657 nm波長(zhǎng)下的OD值?；ㄇ嗨睾恳?OD530-0.25×OD657)/0.1計(jì)算，使用SPSS Statistics 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SnAGL47基因的克隆及生物信息學(xué)分析

對(duì)SnAGL47基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，其開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)長(zhǎng)度為681 bp，編碼226個(gè)氨基酸。將SnAGL47與擬南芥、金魚草、矮牽牛、番茄以及辣椒(Capsicumannuum)的AG類基因進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)分析，結(jié)果(圖 1)顯示，SnAGL47具有MADS-box家族蛋白中高度保守的M結(jié)構(gòu)域以及相對(duì)保守的K結(jié)構(gòu)域，C末端具有AG亞家族基因所特有的AG-motif 1和AG-motif 2兩個(gè)識(shí)別基序，是典型的AG類MADS-box基因。在SnAGL47的M結(jié)構(gòu)域前端，其缺少了一段氨基酸序列(圖1紅框標(biāo)注)，這也是AG亞家族基因在進(jìn)化過程中，D功能類基因所形成的獨(dú)特結(jié)構(gòu)[18]。

通過構(gòu)建不同物種間AG類基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析SnAGL47的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果(圖 2)顯示，SnAGL47屬于AG亞家族中的STK(SEEDSTICK)進(jìn)化分支，與番茄的TAGL11親緣關(guān)系最近，其次是番茄的MADS-boxPROTEIN3(MBP3)、矮牽牛的FBP7與FBP11，而這一進(jìn)化分支與心皮的發(fā)育密切相關(guān)[7,19]。

2.2 SnAGL47的組織特異性表達(dá)分析

通過RT-PCR分析SnAGL47在野生型龍葵的根、莖、葉、花中的表達(dá)情況，結(jié)果(圖 3)顯示，在根、莖、葉中沒有檢測(cè)到SnAGL47的表達(dá)，SnAGL47只在花中表達(dá)；進(jìn)一步對(duì)不同的花器官(萼片、花瓣、雄蕊、心皮)中SnAGL47的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其只在心皮組織中表達(dá)。

2.3 SnAGL47轉(zhuǎn)基因龍葵的鑒定及表型分析

為了驗(yàn)證SnAGL47在龍葵發(fā)育過程中的功能，通過組織培養(yǎng)獲得6株獨(dú)立的T0代株系，并通過DNA鑒定篩選出4株轉(zhuǎn)基因陽性株系，收獲種子并進(jìn)行子代培育，獲得3株表型明顯的T1代株系， RT-PCR分析顯示，SnAGL47在轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量明顯增加(圖 4)。

將轉(zhuǎn)基因株系與野生型進(jìn)行形態(tài)學(xué)比對(duì)觀察，在同樣的生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因株系花的萼片發(fā)生明顯的變化。將轉(zhuǎn)基因植株的萼片、花瓣、雄蕊、心皮分別在體視顯微鏡下進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因SnAGL47植株的萼片顏色由野生型的深綠色變?yōu)榈S色，較野生型有明顯增大，花瓣、雄蕊及心皮無明顯差異(圖5)。

注：方框?yàn)镹末端延伸。圖1 SnAGL47氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Amino acid sequence alignment of SnAGL47

圖2 SnAGL47系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of SnAGL47

圖3 野生型龍葵不同部位中SnAGL47的RT-PCR分析Fig.3 RT-PCR analysis of SnAGL47 in different tissues of wild-type S. nigrum

注：A為野生型植株；B為轉(zhuǎn)基因SnAGL47-1株系；C為轉(zhuǎn)基因SnAGL47-3株系；D為轉(zhuǎn)基因SnAGL47-6株系；E為野生型花；F為轉(zhuǎn)基因SnAGL47-1花；G為轉(zhuǎn)基因SnAGL47-3花；H為轉(zhuǎn)基因SnAGL47-6花；I為野生型果實(shí)；J為轉(zhuǎn)基因SnAGL47-1果實(shí)；K為轉(zhuǎn)基因SnAGL47-3果實(shí)；L為轉(zhuǎn)基因SnAGL47-6果實(shí)；箭頭標(biāo)注為各組織器官；黑色三角形為紫色沉淀；A～D標(biāo)尺：1 cm，E～L標(biāo)尺：1 mm。圖5 野生型及轉(zhuǎn)基因龍葵對(duì)比Fig.5 Comparison of wild-type and transgenic lines of S. nigrum

圖4 轉(zhuǎn)基因SnAGL47株系的RT-PCR分析Fig.4 RT-PCR analysis of transgenic S. nigrum of SnAGL47

在果實(shí)發(fā)育階段，隨著果實(shí)的膨大，超表達(dá)SnAGL47植株萼片的肉質(zhì)化程度增加，并且在果實(shí)成熟時(shí)期，轉(zhuǎn)基因SnAGL47龍葵的萼片逐漸變?yōu)樽仙邶埧?，這種紫色的色素積累只有在成熟果實(shí)中才會(huì)出現(xiàn)，這表明超表達(dá)SnAGL47植株的萼片發(fā)生了向心皮的轉(zhuǎn)變，形成果實(shí)狀的結(jié)構(gòu)(圖5)。

2.4 超表達(dá)SnAGL47促進(jìn)花青素積累

為了進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因植株紫色萼片中花青素含量的變化，分別對(duì)野生型、轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)及萼片中的花青素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株的萼片中花青素含量遠(yuǎn)高于野生型，果實(shí)中的花青素含量差異不顯著(圖6)，這也從側(cè)面印證了轉(zhuǎn)基因植株的萼片轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃乒麑?shí)狀的器官，其代謝過程也發(fā)生了相應(yīng)的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)了花青素的積累。

注：A為野生型及轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)中花青素含量；B為野生型及轉(zhuǎn)基因果實(shí)萼片中的花青素含量；不同字母表示不同組別間差異顯著(p<0.05)。圖6 野生型及轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)及果萼中花青素含量Fig.6 Changes of anthocyanin content in fruit and sepals of wild-type and transgenic lines

3 討 論

AG亞家族基因在進(jìn)化過程中形成多個(gè)分支，其中主要包含兩個(gè)功能分化，即AG和STK兩條進(jìn)化分支，雖然分化為兩個(gè)進(jìn)化分支，但其基因結(jié)構(gòu)具有高度保守性；同時(shí)AG亞家族基因也是形成花最內(nèi)側(cè)的雄蕊、心皮所必需的，而茄科植物花器官的正常發(fā)育是確保其果實(shí)形成的關(guān)鍵，因此研究AG類基因可以進(jìn)一步了解茄科植物生殖發(fā)育的過程[20-23]。本研究經(jīng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選獲得了一個(gè)SnAGL47基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，其屬于AG類MADS-box家族基因，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，SnAGL47與TAGL11親緣關(guān)系最近且處于同一進(jìn)化分支。作為D功能基因，TAGL11過表達(dá)會(huì)使得萼片肉質(zhì)化，糖積累增加，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致萼片形成類似果實(shí)成熟的過程[23]，推測(cè)SnAGL47具有與其相似的功能。

AG類基因在干果及肉質(zhì)果中的表達(dá)模式存在明顯差異，而基因的表達(dá)模式與其功能具有密切的聯(lián)系，例如在矮牽牛這類干果類植物中，AG類基因只作用于胚珠的發(fā)育，影響種子的形成，而在番茄中的TAGL11及MBP3在心皮、胚珠及果實(shí)的內(nèi)部組織(胎座和隔膜)等多個(gè)部位表達(dá)，影響心皮向果實(shí)的發(fā)育[23]。本研究表明，SnAGL47在花的心皮組織中表達(dá)，而龍葵同樣作為肉質(zhì)果實(shí)，推測(cè)在龍葵花發(fā)育過程中SnAGL47可能不僅僅參與了花器官的發(fā)育，還可能在心皮膨大形成果實(shí)的過程中也發(fā)揮重要的作用。為了驗(yàn)證其功能，通過在龍葵中超表達(dá)SnAGL47可以發(fā)現(xiàn)，在生殖生長(zhǎng)階段，轉(zhuǎn)基因植株的花萼發(fā)生明顯的膨大；成熟期果實(shí)的萼片產(chǎn)生花青素的積累，使得萼片顏色轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙?，形成類似于果?shí)的器官。這一表型也與番茄中的AG類基因過表達(dá)相類似，在番茄中的4個(gè)AG類基因TAGL11、MBP3、TAG1、TAGL1，它們?cè)谳嗥械漠愇槐磉_(dá)均會(huì)導(dǎo)致萼片形成類似心皮的表型，同時(shí)萼片產(chǎn)生類似果實(shí)的生理轉(zhuǎn)變，其顏色由于番茄紅素的積累變?yōu)榧t色[23-26]。因此，在本研究中超表達(dá)SnAGL47導(dǎo)致萼片向心皮狀器官的轉(zhuǎn)變，從而造成發(fā)育后期萼片內(nèi)部形成類似果實(shí)的代謝變化，例如在龍葵成熟果實(shí)中才會(huì)出現(xiàn)的花青素的積累[27]，這最終使得轉(zhuǎn)基因SnAGL47龍葵在發(fā)育后期萼片形成紫色果實(shí)狀的表型，而SnAGL47是否直接影響花青素相關(guān)基因的變化也可以作進(jìn)一步的研究。

在典型ABCDE模型中，超表達(dá)AG類基因會(huì)導(dǎo)致萼片向心皮、花瓣向雄蕊的轉(zhuǎn)變，而在本研究中轉(zhuǎn)基因SnAGL47的花瓣變化并不明顯。通過對(duì)不同物種中AG類基因分析后發(fā)現(xiàn)，AG類基因之間既有一定的功能差異，又可以通過一定的方式相互冗余互補(bǔ)，共同參與植物的生殖過程[28-30]。例如在番茄中的TAGL11與MBP3的功能相互冗余，其可以與TAGL1/TAG1等相互作用直接調(diào)控下游的乙烯、脫落酸以及赤霉素等相關(guān)基因，影響花器官的發(fā)育[31-32]。在矮牽牛中，F(xiàn)BP7和FBP11作為一對(duì)D類基因，其單個(gè)基因的表達(dá)量降低并未導(dǎo)致果實(shí)無核化表型，但同時(shí)下調(diào)FBP7和FBP11的表達(dá)量時(shí)可以明顯的觀察到胚珠無法正常發(fā)育，這表明FBP7與FBP11可以相互冗余地調(diào)控胚珠的發(fā)育[9-10]。在擬南芥中，STK、AG、SHATTERPROOF1(SHP1)和SHP2作為4個(gè)AG亞家族基因，其在進(jìn)化過程中分別進(jìn)化出了特定的功能，例如AG基因促進(jìn)生殖器官的分化，SHP基因促進(jìn)擬南芥果實(shí)開裂，STK基因控制著胚柄發(fā)育和種子分離等[30]。作為重要的D功能基因，STK的突變體同樣會(huì)影響心皮的發(fā)育，導(dǎo)致果實(shí)和種子體積減小，并且可以調(diào)控種皮中類黃酮和原花青素的積累；同時(shí)STK、SHP基因和AG基因之間又可以相互冗余地作用于胚珠的發(fā)育[33-35]。因此，SnAGL47在龍葵中是否也受到其他基因的冗余調(diào)控，從而影響轉(zhuǎn)基因植株的表型變化可以作為后期的研究方向。