王喜英 趙輝譚智勇 盧志宏 宋希娟

（銅仁學(xué)院，貴州銅仁 554300）

汞（Hg）是一種廣泛存在的金屬污染物，可在大氣中長(zhǎng)距離傳輸，并在環(huán)境中持續(xù)存在或在食物鏈中積累（Lima et al.，2019）。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，汞化合物已被用作殺蟲劑、除草劑和殺菌劑，導(dǎo)致土壤產(chǎn)生嚴(yán)重的局部汞污染（Bryan &Langston，1992）；部分農(nóng)業(yè)措施，如施用化肥、石灰、污泥和肥料等，也是土壤中汞的重要來源（Azevedo &Rodriguez，2012）。汞通過降低植物光合作用、呼吸速率，減少水分、養(yǎng)分吸收以及改變抗氧化酶活性等影響植物代謝（Azevedo &Rodriguez，2012）。在土壤微生物方面，汞會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞膜破壞、細(xì)胞分裂和酶活性抑制等（Wang et al.，2020a）。研究表明，土壤微生物對(duì)重金屬脅迫的反應(yīng)比植物更敏感（Shuaib et al.，2021）。然而，由于汞的形態(tài)不同會(huì)導(dǎo)致其溶解性、毒性及生物可利用性發(fā)生變化，因此其對(duì)土壤微生物群落的影響尚未形成共識(shí)（Frossard et al.，2017），有必要開展深入的研究。

相關(guān)研究認(rèn)為，土壤重金屬污染往往伴隨氮元素的匱乏（劉晨 等，2018；孔天樂 等，2020）。生物固氮是指將大氣中的N在固氮微生物的固氮酶作用下轉(zhuǎn)化為可被植物吸收利用的含氮化合物的過程，是許多陸地和水生生境中氮元素輸入的重要來源（Bellenger et al.，2014）。生物固氮的挖掘和利用，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和影響土壤重金屬活性方面發(fā)揮著重要作用（劉晨 等，2018）。固氮酶主要由、和基因編碼（Gaby et al.，2018）。由于序列高度保守，因此被廣泛應(yīng)用于土壤固氮微生物群落組成及其多樣性研究（楊亞東 等，2017）。由于固氮微生物能夠快速對(duì)重金屬污染做出響應(yīng)，可用作重金屬污染的監(jiān)測(cè)和評(píng)估指標(biāo)（孔天樂 等，2020）。

當(dāng)前，汞已成為菜地污染最嚴(yán)重的重金屬之一（崔曉峰 等，2012）。蔬菜作物中，葉菜類蔬菜吸收重金屬的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)其他種類蔬菜更大（Wang et al.，2020b）。普通白菜在我國(guó)各地廣泛種植，其對(duì)汞的富集作用較強(qiáng)，易對(duì)人類健康造成危害（高藝 等，2018）。目前，關(guān)于汞的危害研究主要集中在植物生長(zhǎng)（劉振京，2019）、酶活性（Zheng et al.，2019）、汞積累（劉忠闖，2016）、土壤養(yǎng)分（Lima et al.，2019）、土壤細(xì)菌（Frossard et al.，2017）和真菌（Durand et al.，2020）等方面，而汞對(duì)菜地土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)采用盆栽方式，應(yīng)用熒光定量PCR和高通量測(cè)序（Illumina MiSeq）技術(shù)對(duì)汞脅迫下普通白菜生長(zhǎng)及土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性和基因豐度進(jìn)行研究，以期揭示固氮微生物對(duì)汞脅迫的響應(yīng)特征，從固氮微生物角度為汞污染土壤監(jiān)測(cè)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021 年1—5 月在銅仁學(xué)院塑料大棚內(nèi)進(jìn)行。供試土壤采集于貴州省銅仁市碧江區(qū)（109°13′12″E，27°47′30″N）的典型菜地黃壤土。從表層0～20 cm 收集新鮮土壤，去除植物殘?bào)w、礫石等，風(fēng)干后過2 mm 篩。土壤基本理化性質(zhì)：有機(jī)碳（SOC）含量17.05 g·kg，全氮（TN）含量1.63 g·kg，速效鉀（AK）含量46.59 mg ·kg，速效磷（AP）含量16.92 mg·kg，全 汞（THg）含量0.331 mg·kg，pH 值6.56。

供試普通白菜品種為四季小白菜，購(gòu)自天津市宏豐蔬菜研究有限公司。

以HgCl為汞源，購(gòu)自銅仁科儀化玻有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置4 個(gè)汞濃度處理：對(duì)照（CK），0 mg ·kg；T1，低濃度，1 mg·kg；T2，中濃度，10 mg ·kg；T3，高濃度，50 mg·kg。每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)1 盆。

分別按比例將汞和過篩土壤混合均勻，裝入高21 cm、上口直徑21 cm 的塑料盆中，每盆裝土5 kg。為保持添加的汞趨于均勻穩(wěn)定且被土壤充分吸附，土壤老化時(shí)間為90 d，期間保持土壤含水量在60%。然后播種普通白菜種子，每盆10 粒，幼苗2片真葉時(shí)定苗，每盆留4 株。之后采取常規(guī)管理措施，不施用肥料和農(nóng)藥；為避免水中汞進(jìn)入，均采用蒸餾水澆灌，土壤含水量保持60%。

普通白菜生長(zhǎng)60 d 后采收，所有植株均用去離子水沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分，用于測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)。然后，在普通白菜根系附近選擇3 點(diǎn)進(jìn)行土壤取樣，混合成1 個(gè)土樣，取樣量為0.5 kg，去除植物根系并過2 mm 篩后分成2 份，1 份用于銨態(tài)氮（NH-N）和硝態(tài)氮（NO-N）含量測(cè)定，余下部分室內(nèi)風(fēng)干后用于土壤全汞含量和基礎(chǔ)理化指標(biāo)測(cè)定；1 份保存于-20 ℃冰箱，用于土壤微生物DNA 提取。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1 普通白菜生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 使用去離子水將植株根系附著的土壤清洗干凈，然后用濾紙吸干水分，利用卷尺和電子天平測(cè)定植株的株高、根長(zhǎng)、單株鮮質(zhì)量，取平均值。

1.3.2 土壤全汞含量和基礎(chǔ)理化指標(biāo)測(cè)定 全汞含量測(cè)定采用王水水浴消解-冷原子吸收光譜法（李仲根 等，2005）；pH 測(cè)定采用電位法，有機(jī)碳含量測(cè)定采用重鉻酸鉀氧化法，全氮含量測(cè)定采用凱氏定氮法，速效磷含量測(cè)定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法，速效鉀含量測(cè)定采用乙酸銨提取-火焰光度法，銨態(tài)氮含量測(cè)定采用靛酚藍(lán)比色法，硝態(tài)氮含量測(cè)定采用酚二磺酸比色法（鮑士旦，2000）。

1.3.3 土壤微生物DNA 提取及基因豐度測(cè)定采用DNA提取試劑盒（Omega，GA，USA）提取土壤微生物DNA。利用核酸定量?jī)x（NanoDrop ND-2000）對(duì)DNA 濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。熒光定量PCR 在ABI7500 熒光定量PCR 儀（ABI，CA，USA）上進(jìn)行，擴(kuò)增引物為-F：5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′和-R：5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCAT CAT-3′（R?sch et al.，2002）。反應(yīng)體系為：2× SYBR real-time PCR premixture（Bioteke，Beijing）10 μL，上、下游引物（10 μmol·L）各0.8 μL，DNA模板2 μL（1～10 ng），ddHO 補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。利用Poly 等（2001）的方法，獲得含有基因的重組質(zhì)粒，分別以10 倍梯度稀釋基因重組質(zhì)粒得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算基因豐度。

1.3.4 固氮微生物高通量測(cè)序 采用引物-F與-R 對(duì)固氮微生物基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：5× ExTaq 緩沖液5.0 μL，dNPT（2.5 μmol·L）2.0 μL，上、下游引物（10 μmol·L）各1.0 μL，DNA 模板2.0 μL（1～10 ng），ExTaq（5 U·μL）0.25 μL，ddHO 補(bǔ)至25 μL。反 應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR 產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技股份有限公司，運(yùn)用Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

利用FLASH 軟件對(duì)通過質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進(jìn)行配對(duì)連接，從而獲得每個(gè)樣本的有效序列。通過QIIME 軟件調(diào)用USEARCH 檢查并剔除嵌合體序列。將優(yōu)質(zhì)序列聚類成操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），閾值設(shè)置為97%，并選取每個(gè)OTU 中豐度最高的序列作為該OTU 的代表序列。應(yīng)用RDP-classifier 在GenBank中對(duì)OTU 進(jìn)行分類注釋，統(tǒng)計(jì)各樣本在門和屬水平上的群落組成；使用QIIME 軟件，對(duì)固氮微生物α 多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)（＜0.05）。利用R 軟件進(jìn)行土壤固氮微生物群落主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）和冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 汞脅迫對(duì)普通白菜生長(zhǎng)的影響

從表1 可以看出，隨著汞濃度的增加，普通白菜株高、根長(zhǎng)、單株鮮質(zhì)量均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)。其中，T1 處理的株高、根長(zhǎng)、單株鮮質(zhì)量均最高，但與T2 處理及對(duì)照間差異不顯著；而T3 處理的各指標(biāo)均顯著低于T1、T2 處理及對(duì)照。表明，低濃度汞對(duì)普通白菜生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，中、高濃度汞表現(xiàn)抑制作用，且汞濃度越高抑制作用越強(qiáng)。

表1 不同汞濃度對(duì)普通白菜生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.2 汞脅迫對(duì)土壤理化性質(zhì)和全汞含量的影響

從表2 可以看出，隨著汞濃度的增加，土壤中全汞含量呈上升趨勢(shì)，T2、T3 處理與T1 處理及對(duì)照間差異顯著；全氮和銨態(tài)氮含量也呈遞增趨勢(shì)，而硝態(tài)氮含量呈遞減趨勢(shì)，T2、T3 處理與對(duì)照間差異顯著；pH 值先降低后升高，且趨于中性，T3處理顯著高于T1、T2 處理及對(duì)照。汞脅迫下，速效磷、速效鉀含量及C/N 值均降低，各濃度汞處理均低于對(duì)照。T3 處理的有機(jī)碳含量顯著高于T1、T2 處理及對(duì)照。

表2 不同汞濃度對(duì)土壤理化指標(biāo)和全汞含量的影響

2.3 汞脅迫對(duì)固氮微生物nifH 基因豐度的影響

由圖1 可知，不同汞濃度處理的固氮微生物基因豐度變化范圍為4.40 × 10～7.91 × 10個(gè)·g（干土），表現(xiàn)為T1 ＞ CK ＞ T2 ＞ T3，T3 處理顯著低于T1、T2 處理及對(duì)照，分別降低了44.33%、40.09%、43.76%?？梢?，高濃度汞脅迫對(duì)固氮微生物基因豐度有顯著抑制作用。

圖1 不同汞濃度對(duì)固氮微生物nifH 基因豐度的影響

為明確汞脅迫下固氮微生物基因豐度的影響因素，將其與土壤理化指標(biāo)、全汞含量及普通白菜生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明（圖2），基因豐度與pH、銨態(tài)氮含量、全汞含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與有機(jī)碳含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與硝態(tài)氮含量、單株鮮質(zhì)量、株高、根長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系?？芍胀ò撞松L(zhǎng)對(duì)固氮微生物數(shù)量有極顯著的促進(jìn)作用。

圖2 固氮微生物群落α 多樣性指數(shù)、nifH 基因豐度與土壤理化指標(biāo)、全汞含量及普通白菜生長(zhǎng)指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 汞脅迫對(duì)固氮微生物高通量測(cè)序結(jié)果及其多樣性指數(shù)的影響

利用Illumina MiSeq 平臺(tái)對(duì)土壤固氮微生物測(cè)序分析可知（表3），土壤固氮微生物覆蓋率均在99%以上，說明該測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)地反映土壤樣品中固氮微生物群落特征。T1、T2 處理的有效序列數(shù)目顯著高于T3 處理，但均與對(duì)照差異不顯著。隨著汞濃度的增加，土壤固氮微生物OTU 數(shù)量表現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)，T3 處理顯著低于T1 處理及對(duì)照。說明，高濃度的汞脅迫顯著改變了固氮微生物OTU 水平上的物種組成。

表3 不同汞濃度對(duì)固氮微生物高通量測(cè)序結(jié)果及α 多樣性指數(shù)的影響

Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)變化趨勢(shì)一致，均為T1 處理最大，分別為2 020.66 和1 589.80，且均顯著高于T2、T3 處理。隨著汞濃度的增加，Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)均呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，T3 處理顯著低于T1、T2 處理及對(duì)照，分別下降了7.8%和2.9%、6.9%和2.6%、8.1%和3.1%。說明，低濃度汞脅迫對(duì)土壤固氮微生物群落豐富度有促進(jìn)作用，而高濃度汞脅迫對(duì)固氮微生物群落豐富度和多樣性有明顯的抑制作用。

由圖2 可知，土壤固氮微生物ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)分別與pH、銨態(tài)氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與硝態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)分別與有機(jī)碳含量、全汞含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與速效鉀含量、株高、根長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；Shannon指數(shù)與單株鮮質(zhì)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系；Simpson 指數(shù)與單株鮮質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；ACE 指數(shù)與全汞含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與根長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)關(guān)系；Chao1 指數(shù)與pH、銨態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與硝態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

2.5 汞脅迫對(duì)固氮微生物群落組成的影響

通過對(duì)汞脅迫下土壤樣品OTUs 進(jìn)行歸類，得到8 個(gè)門、16 個(gè)綱、26 個(gè)目、48 個(gè)科和59 個(gè)屬。在門水平上，將平均相對(duì)豐度＜ 0.1%的類群歸類為其他，得到4 個(gè)類群（圖3-a），分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其中變形菌門和厚壁菌門不同汞濃度處理間差異極顯著，藍(lán)藻門和放線菌門相對(duì)豐度可忽略不計(jì)。變形菌門（90.71%～93.21%）和厚壁菌門（3.26%～4.64%）為優(yōu)勢(shì)菌門，占固氮微生物總類群相對(duì)豐度的95.35%～96.50%。變形菌門的相對(duì)豐度隨汞濃度的增加呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，T3 處理最低，與T1、T2 處理及對(duì)照間差異顯著；而厚壁菌門的相對(duì)豐度表現(xiàn)為隨汞濃度的增加而增加，T3 處理最高，分別比T1、T2 處理增加了1.38和1.22 百分點(diǎn)。

在屬水平上，得到相對(duì)豐度在1% 以上的12 個(gè)類群（圖3-b），分別為慢生根瘤菌屬（）、固氮螺菌屬（）、地桿菌屬（）、根瘤菌屬（）、外紅硫螺菌屬（）、甲基單胞菌屬（）、甲基孢囊菌屬（）、、甲基彎曲菌屬（）、、和脫硫弧菌屬（）。其中慢生根瘤菌屬、固氮螺菌屬、地桿菌屬和根瘤菌屬為優(yōu)勢(shì)類群，相對(duì)豐度分別為29.12%～43.16%、6.76%～10.24%、6.20%～7.40%和4.44%～7.49%。慢生根瘤菌屬的相對(duì)豐度隨汞濃度的增加而逐漸遞增，T3 處理最高（43.16%），極顯著高于T1、T2 處理及對(duì)照，分別是T1、T2處理及對(duì)照的1.45、1.21、1.48 倍；汞脅迫對(duì)固氮螺菌屬的相對(duì)豐度表現(xiàn)為抑制作用，隨汞濃度的增加其相對(duì)豐度逐漸降低，T3 處理最低（6.76%），顯著低于T1、T2 處理及對(duì)照；地桿菌屬和根瘤菌屬的相對(duì)豐度均以T1 處理最高（7.41%和7.49%），而后隨汞濃度的增加而降低，且T2、T3處理間差異顯著。說明，汞脅迫對(duì)慢生根瘤菌屬有促進(jìn)作用，而對(duì)固氮螺菌屬表現(xiàn)抑制作用；低濃度汞對(duì)地桿菌屬和根瘤菌屬有促進(jìn)作用，而高濃度汞則表現(xiàn)為顯著抑制作用。

圖3 不同汞濃度下固氮微生物門（a）和屬（b）水平群落組成

2.6 固氮微生物群落結(jié)構(gòu)及其影響因子分析

通過層次聚類分析可知（圖4-a），不同濃度汞處理的固氮微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯，T1 和T3處理3 次重復(fù)聚類較好；其中，T3 處理與對(duì)照、T1 處理與T3 處理間距離較遠(yuǎn)。PCoA 分析進(jìn)一步證實(shí)了汞脅迫下土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的明顯差異（圖4-b）。PCoA1 和PCoA2 對(duì)土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)變異的解釋量分別為33.2%和12.6%。對(duì)照、T1 和T2 處理的距離較近，說明這3 個(gè)處理之間固氮微生物群落結(jié)構(gòu)相似度較高；T3 處理與其他處理間距離較遠(yuǎn)，說明高濃度汞處理對(duì)固氮微生物群落結(jié)構(gòu)影響較大。

圖4 不同汞濃度下固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的層次聚類樹（a）和PCoA 分析結(jié)果（b）

屬水平上固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化指標(biāo)的冗余分析（RDA）結(jié)果表明（圖5），RDA1和RDA2 分別解釋了固氮微生物群落結(jié)構(gòu)變異的63.40%和14.68%，共解釋了總變異的78.08%。土壤pH、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量和全汞含量對(duì)土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)有極顯著影響，有機(jī)碳含量和速效鉀含量對(duì)固氮微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。

圖5 屬水平上固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化指標(biāo)的冗余分析結(jié)果

3 討論

3.1 汞脅迫對(duì)土壤固氮微生物豐度和多樣性的影響

前人研究表明，土壤養(yǎng)分、重金屬和植物類型等都會(huì)影響固氮微生物豐度和群落多樣性（王磊 等，2020；Yu et al.，2020）。本試驗(yàn)中，土壤pH、有機(jī)碳含量、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量和全汞含量對(duì)固氮微生物基因豐度和群落多樣性有顯著影響；其中，pH 與基因豐度和群落多樣性指數(shù)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Wang 等（2017a）的研究結(jié)果一致。Lin 等（2018）研究認(rèn)為，酸性土壤pH 增加會(huì)抑制固氮微生物生長(zhǎng)，導(dǎo)致基因豐度和群落多樣性指數(shù)降低。低濃度汞處理的普通白菜生長(zhǎng)較好，可能是根系分泌的化感物質(zhì)在土壤中積累，使土壤pH 值降低導(dǎo)致的。鐵是固氮過程中許多蛋白質(zhì)合成所需的重要輔助因子，在酸性土壤中鐵的利用率隨土壤pH 值的增加而降低（Shuman，1998）。因此，在重金屬汞脅迫下土壤pH 值增加可能間接對(duì)固氮微生物生長(zhǎng)有抑制作用，導(dǎo)致固氮微生物群落α 多樣性指數(shù)（T1 處理除外）隨汞濃度增加而減少。高濃度汞處理的土壤有機(jī)碳含量和銨態(tài)氮含量顯著增加，進(jìn)而導(dǎo)致固氮微生物豐度和多樣性顯著降低，這可能是由于汞脅迫造成土壤固氮微生物死亡或群落減少，植株生長(zhǎng)緩慢，對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收利用較少。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，全汞含量與固氮微生物基因豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)，重金屬可能嚴(yán)重影響稀有和敏感物種以降低其競(jìng)爭(zhēng)能力，同時(shí)重金屬脅迫也誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生，抑制固氮微生物生長(zhǎng)（Volkov et al.，2006）。Gans 等（2005）研究表明，在重金屬作用下固氮微生物中某些敏感物種競(jìng)爭(zhēng)能力下降，導(dǎo)致固氮微生物豐度下降。Yin 等（2018）也認(rèn)為，重金屬與固氮微生物基因豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，重金屬濃度過高會(huì)抑制固氮微生物生長(zhǎng)。而本試驗(yàn)中，低濃度汞處理的固氮微生物基因豐度高于中、高濃度汞處理及對(duì)照，這可能與一些固氮微生物存在汞抗性有關(guān)。微生物可以耐受低濃度的重金屬，這主要是因?yàn)橹亟饘匐x子從細(xì)胞中流出（Nies，1999），能夠適應(yīng)重金屬脅迫的微生物占據(jù)重要的生態(tài)位。因此，在低濃度汞處理時(shí)某些耐汞固氮微生物的豐度可能增加。高濃度汞處理的固氮微生物基因豐度顯著下降，表明營(yíng)養(yǎng)限制和汞毒性對(duì)固氮微生物產(chǎn)生了影響。Chodak等（2013）研究認(rèn)為，重金屬含量對(duì)土壤固氮微生物群落α 多樣性指數(shù)有顯著影響。本試驗(yàn)中，低濃度汞對(duì)固氮微生物群落豐富度有促進(jìn)作用，高濃度汞對(duì)固氮微生物群落豐富度和多樣性均表現(xiàn)抑制作用。其中，汞對(duì)固氮微生物群落豐富度的影響較明顯，汞濃度越高影響越大，與Zhu 等（2021）的研究結(jié)果一致。在低濃度汞脅迫下，通過競(jìng)爭(zhēng)性釋放次級(jí)微生物類群增加了微生物群落豐富度（Liu et al.，2018）。Sun 等（2020）研究認(rèn)為，在重金屬高度污染的地區(qū)，缺乏氮等養(yǎng)分會(huì)導(dǎo)致固氮微生物富集。Das 等（2013）研究認(rèn)為，重金屬濃度較高會(huì)顯著抑制植物生長(zhǎng)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。植物生長(zhǎng)旺盛，根系分泌物多，有利于固氮微生物生長(zhǎng)和群落多樣性增加（楊亞東 等，2017）。本試驗(yàn)中，低濃度汞處理的普通白菜生長(zhǎng)較快，根系長(zhǎng)，原因可能是其根系分泌物較多，對(duì)固氮微生物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，改善了固氮微生物群落多樣性。

3.2 土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)及其與土壤理化指標(biāo)的關(guān)系

土壤生態(tài)系統(tǒng)中高濃度重金屬污染對(duì)微生物群落有顯著影響（Zhang et al.，2016）。不同濃度重金屬脅迫可能對(duì)固氮微生物類群施加不同的壓力，導(dǎo)致固氮微生物群落組成的相對(duì)豐度顯著下降（金屬敏感物種）或上升（金屬抗性物種）（Liu et al.，2014）。

本試驗(yàn)中，門水平上固氮微生物優(yōu)勢(shì)類群以變形菌門和厚壁菌門為主，其次是藍(lán)藻門和放線菌門，與Yin 等（2018）的研究結(jié)果相似。變形菌門能夠?qū)⒋髿庵械牡潭橐子讷@得的形式，以供植物生長(zhǎng)，其廣泛存在于各種環(huán)境中，且高度多樣化（Chen et al.，2019）。前人研究表明，在加拿大安大略省北部的鎳、銅礦區(qū)，斯洛伐克西南部的鎳、鈷和鋅礦區(qū)，變形菌門均為主要微生物類 群（Karelová et al.，2011；Narendrula-Kotha &Nkongolo，2017）。本試驗(yàn)中，變形菌門的相對(duì)豐度在對(duì)照、低和中濃度汞處理間差異不顯著，但均顯著高于高濃度汞處理。說明變形菌門對(duì)重金屬汞脅迫具有一定的耐受性，但超出適應(yīng)的閾值則導(dǎo)致其數(shù)量減少或者死亡。關(guān)于變形菌門對(duì)汞的耐受能力，相關(guān)研究認(rèn)為變形菌門含有抗性基因，可將汞離子還原為元素汞（M?ller et al.，2014）；微生物的活細(xì)胞或死細(xì)胞可以吸附汞，降低汞毒害（Fran?ois et al.，2012）；通過外排系統(tǒng)擠出重金屬離子，通過含硫醇分子進(jìn)行分離以及將其還原為低毒性的氧化狀態(tài)（Harichová et al.，2012）。厚壁菌門可生活在極端環(huán)境中，可修復(fù)廣譜重金屬污染，通過分泌有害物質(zhì)干擾植物氮代謝，抑制植物正常生長(zhǎng)（Karelová et al.，2011）。高濃度汞處理的厚壁菌門相對(duì)豐度顯著高于低、中濃度汞處理及對(duì)照，這可能也是致使普通白菜生長(zhǎng)緩慢的一個(gè)因素。

慢生根瘤菌屬是分布廣泛的固氮微生物類群，為寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌，在營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下也能存活，具有較高的耐汞性（Salmi &Boulila，2021）。隨著汞濃度的增加，慢生根瘤菌屬相對(duì)豐度逐漸增加，這可能是由于慢生根瘤菌屬可以產(chǎn)生高水平的胞外多糖，能夠捕獲重金屬離子和阻止它們進(jìn)入細(xì)胞（Dhakephalkar &Chopade，1994）。固氮螺菌屬對(duì)植物的生長(zhǎng)有積極影響，可促進(jìn)新根形成，增加植株干質(zhì)量，但對(duì)汞污染敏感（Widawati &Suliasih，2019）。隨著汞濃度的增加，固氮螺菌屬相對(duì)豐度逐漸降低，說明汞脅迫對(duì)固氮螺菌屬生長(zhǎng)具有抑制作用。其中，T3 處理固氮螺菌屬相對(duì)豐度最低，可能是由于普通白菜生長(zhǎng)緩慢，通過根系釋放的分泌物較少，不利于固氮螺菌屬生長(zhǎng)。根瘤菌屬是高濃度汞污染土壤中的生物標(biāo)志物，可以耐受一定濃度的汞脅迫（6 mg·kg），對(duì)鎳和鋅等潛在的有毒重金屬也具有一定的抗性和解毒能力（Zhu et al.，2021）。低濃度汞處理的根瘤菌屬相對(duì)豐度高于中、高濃度汞處理，這可能是因?yàn)橹?、高汞濃度超出了該類群的生態(tài)閾值。

Zhan 和Sun（2012）研究表明，重金屬污染土壤氮含量對(duì)固氮微生物群落有重要影響，其中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量是影響土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的最主要因素（Wang et al.，2017b），與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，土壤pH 是固氮微生物群落發(fā)生變化的主要因素之一。因?yàn)橥寥纏H 與固氮微生物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收和利用密切相關(guān)，故可通過調(diào)節(jié)土壤酸堿度來影響固氮微生物群落（Wang et al.，2010）。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，汞污染不僅影響植物生長(zhǎng)，還影響參與固氮的微生物類群。低濃度汞對(duì)普通白菜株高、根長(zhǎng)、單株鮮質(zhì)量均表現(xiàn)促進(jìn)作用，而中、高濃度汞則表現(xiàn)抑制作用。隨著汞濃度增加，固氮微生物基因豐度、物種豐富度和多樣性指數(shù)均呈先增加后下降的變化趨勢(shì)。在門水平上，變形菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)類群；在屬水平上，慢生根瘤菌屬、固氮螺菌屬、地桿菌屬和根瘤菌屬為優(yōu)勢(shì)類群。高濃度汞對(duì)變形菌門及固氮螺菌屬、地桿菌屬、根瘤菌屬的相對(duì)豐度有抑制作用，對(duì)厚壁菌門及慢生根瘤菌屬相對(duì)豐度有促進(jìn)作用。土壤pH、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量及全汞含量對(duì)土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)均有極顯著影響，有機(jī)碳含量和速效鉀含量對(duì)固氮微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。汞脅迫通過影響普通白菜生長(zhǎng)、土壤pH 及銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有機(jī)碳、速效鉀含量變化，導(dǎo)致固氮微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。