陳 果 孔樅樅 馬洪雪 鄧四平 季家磊， 王 勇， 莊 木， 張揚勇， 楊麗梅， 關(guān)慧明 方智遠， 呂紅豪，*

（1 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京 100081；2 湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育教育部工程研究中心，蔬菜生物學湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；3 烏蘭察布冷涼蔬菜院士工作站，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

結(jié)球甘藍（L.var.L.）簡稱甘藍，是一種重要的蕓薹屬蔬菜作物，在我國各地廣泛種植（方智遠，2008）。由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種（pv.，）引起的黑腐病屬于細菌性病害，是目前危害甘藍及其他蕓薹屬蔬菜生產(chǎn)的主要病害之一。

甘藍黑腐病最早發(fā)生于美國（Garman，1892），隨后逐漸蔓延至世界各地，尤其是對亞洲、歐洲和北美的甘藍類作物生產(chǎn)造成了重大危害（Williams，1980；Jensen et al.，2010；Singh et al.，2016）。我國黑腐病最早發(fā)生于20 世紀50 年代末的華北地區(qū)（樊護民，1989），80 年代普遍流行于全國各地。近年來，由于不合理的耕作方式以及頻發(fā)的極端天氣等因素，黑腐病對我國蕓薹屬蔬菜作物的危害逐漸加重，嚴重時可減產(chǎn)70%以上（張揚 等，2011）。在黑腐病防治方面，傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)、化學方法耗時、耗力且效果有限，目前最理想的減輕黑腐病發(fā)生的方法是培育和應(yīng)用抗病品種。

挖掘和篩選抗源材料是開展抗黑腐病育種工作的基礎(chǔ)。自20 世紀50 年代以來，國內(nèi)外學者不斷開展甘藍抗源篩選工作。例如，Bain（1952）采用種子浸染法篩選出2 個抗黑腐病甘藍品種Early Fuji和Hugenot；劉佳等（1988）采用剪葉法篩選出2份高抗黑腐病的甘藍材料8286-1 和20-2-5-2；簡元才和釘貫靖久（1994）采用離體剪葉法篩選出3份對黑腐病表現(xiàn)出一定抗性的甘藍材料91-306、91-304 和91-316；Griesbach 等（2003）采用黑腐病生理小種混合接種法篩選出高抗黑腐病甘藍材料AU4518；張恩慧等（2005）對815 份甘藍自交系進行抗性鑒定，獲得4 份抗黑腐病、兼抗蕪菁花葉病毒病和黃瓜花葉病毒病的材料；Lema 等（2012）對256 份甘藍類蔬菜材料進行黑腐病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)甘藍材料Balón、Quintal de Alsacia 和芥藍材料MBG-BRS0070 表現(xiàn)出一定的抗性；張云霞（2014）采用室內(nèi)苗期人工接種的方法篩選出對黑腐病具有穩(wěn)定抗性的甘藍材料C7；孔樅樅等（2018）鑒定了99 份甘藍材料的黑腐病抗性，篩選出2 份高抗材料99-192 和20-2-5。以上研究結(jié)果表明，國內(nèi)外育種工作者在甘藍黑腐病抗源篩選上取得了一定進展，但甘藍類蔬菜黑腐病抗源依然匱乏，限制了抗病育種工作的開展。

為了更好地推進抗黑腐病甘藍育種工作，一方面需要不斷挖掘和篩選抗黑腐病種質(zhì)資源，另一方面需建立與抗病育種工作配套的高效、準確的鑒定方法及評價標準。目前，國內(nèi)尚無統(tǒng)一的田間黑腐病抗性分級標準，因此，梳理和建立一套關(guān)于評價甘藍黑腐病田間發(fā)病情況及抗性水平的標準尤為重要。

本試驗通過對種植在內(nèi)蒙古烏蘭察布市的55份甘藍材料進行田間黑腐病鑒定和篩選，建立了一套結(jié)球期甘藍田間黑腐病病害分級標準；同時對部分甘藍材料進行室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定，驗證擬定的黑腐病田間病害分級標準，旨在為甘藍抗黑腐病育種工作的開展提供抗性種質(zhì)資源，進而為抗黑腐病甘藍品種的選育以及蕓薹屬蔬菜黑腐病的科學合理防治提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試55 份甘藍種質(zhì)均由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甘藍青花菜課題組提供，包括26 份自交系（自交6 代以上的純合材料）、19 份雜交組合和10 份商品種（表1）；其中，抗病對照為自交系21-3，感病對照為自交系BJ（孔樅樅，2019）。室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定使用的黑腐病菌菌株由英國華威大學Joana Vicente 教授提供，菌株編號HRIW3811，屬于主流1 號生理小種，保存于完全培養(yǎng)基（complete medium，CM）中；培養(yǎng)基配方為：酵母提取物6 g·L，酶水解酪蛋白3 g·L，酸水解酪蛋白3 g·L，蔗糖10 g·L，瓊脂15 g·L。

表1 參試55 份甘藍材料的來源及品種特征特性

續(xù)表

1.2 試驗方法

1.2.1 甘藍黑腐病田間抗性鑒定 所有參試材料均種植于內(nèi)蒙古烏蘭察布市集寧區(qū)冷涼蔬菜院士工作站試驗基地，2020 年和2021 年5 月播種育苗，待幼苗長至5～6 片葉時移入黑腐病病圃田，8 月對結(jié)球期甘藍進行田間發(fā)病情況調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括發(fā)病甘藍外葉上病斑的大小、數(shù)量、深度、寬度、壞死程度以及是否蔓延至球葉，綜合評估發(fā)病情況。每份材料3 次重復，每重復10 株，病情指數(shù)取兩年調(diào)查結(jié)果的平均值。

1.2.2 甘藍黑腐病室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定 2021 年9 月在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所南區(qū)試驗基地溫室內(nèi)進行，采用苗期噴霧法對23份甘藍材料（包括13 份自交系、8 份雜交組合和2份商品種）進行接種，病情分級標準和抗性水平的劃分參考孔樅樅等（2018）的方法；另外，有5 份自交系的人工接種鑒定結(jié)果采用孔樅樅等（2018）和Kong 等（2021）的鑒定結(jié)果。

育苗、接種過程：將參試甘藍材料種子播于21 孔穴盤（62 mm × 62 mm × 65 mm）中，每份材料播種1 盤，每孔播種1 粒；溫室內(nèi)常規(guī)育苗，幼苗4～6 片真葉時，選擇生長健壯、長勢一致的幼苗進行接種。先將黑腐病菌菌株HRIW3811 轉(zhuǎn)接至液體CM 培養(yǎng)基，在28 ℃、200 r·min的條件下過夜培養(yǎng)至菌株對數(shù)生長期；用無菌水調(diào)節(jié)菌液濃度至1 × 10CFU·mL（OD=0.2）。接種前1 d甘藍幼苗充分澆水并覆膜低溫保濕24 h（溫度低于15 ℃，濕度大于70%）；接種當天早上使用噴霧器將菌液均勻噴灑到全部葉片上，以葉片無液滴滴落為度，接種后溫度升至25 ℃并持續(xù)覆膜保濕24 h；然后去除薄膜，于25 ℃條件下常規(guī)管理，12～14 d 后調(diào)查黑腐病發(fā)病情況，計算病情指數(shù)。

病情指數(shù)（DI）=Σ（各級病株數(shù)×該病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）× 100

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Off ice 2019 軟件進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍結(jié)球期黑腐病田間發(fā)病癥狀

黑腐病主要危害甘藍葉片，幼苗和成株期均可發(fā)病。在甘藍結(jié)球期，黑腐病菌主要從外葉葉緣侵入，首先造成葉緣多處泛黃，形成黃色或黃褐色大斑；之后病菌進一步沿維管束擴展到葉柄，形成較大的“V”字形壞死區(qū)并造成葉片干腐或脫落（圖1）；嚴重時可造成球葉干枯壞死，甚至整株萎蔫、死亡。黑腐病發(fā)生的嚴重程度與環(huán)境濕度關(guān)聯(lián)很大，靠近潮濕地面或者略有積水地方的外葉發(fā)病較嚴重，而中、上層外葉幾乎沒有或者僅有較少病斑。

圖1 甘藍黑腐病田間發(fā)病癥狀

2.2 甘藍結(jié)球期黑腐病田間病害分級標準的制定

依據(jù)甘藍結(jié)球期黑腐病田間發(fā)病情況制定0、1、3、5、7、9 級病情分級標準，具體要求見表2和圖2。

圖2 甘藍結(jié)球期黑腐病田間病情分級標準

表2 甘藍結(jié)球期黑腐病田間病情分級標準

隨后基于田間調(diào)查結(jié)果計算甘藍結(jié)球期黑腐病病情指數(shù)（DI），進而劃分材料抗性水平：免疫（I），DI=0；高抗（HR），0 ＜DI ≤ 10；抗病（R），10 ＜DI ≤ 30；中抗（MR），30 ＜DI ≤ 50；感?。⊿），50 ＜DI ≤ 70；高感（HS），DI ＞ 70。

2.3 甘藍黑腐病田間抗病性鑒定結(jié)果

從表3 可以看出，參試26 份甘藍自交系中，05-574 和20-2-5 表現(xiàn)高抗，病情指數(shù)分別為8.52和8.89；MD202 表現(xiàn)抗病，病情指數(shù)為16.30；21-3、721、YF 旺旺、多抗福星和HN82 表現(xiàn)中抗，病情指數(shù)在38.62～46.03 之間。19 份雜交組合中，05-574 × 207、05-574 × 20-2-5、05-574 × MD202表現(xiàn)抗病，病情指數(shù)分別為11.11、24.44、28.15。10 份商品種中，中甘107 和中甘108 表現(xiàn)抗病，病情指數(shù)分別為21.48 和25.93。

表3 55 份甘藍材料黑腐病的田間及室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定結(jié)果

2.4 甘藍黑腐病室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定結(jié)果

室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定結(jié)果表明（表3），自交系材料中，20-2-5 和05-574 表現(xiàn)高抗（圖3），MD202 表現(xiàn)抗病，21-3、721、YF 旺旺、多抗福星和HN82 表現(xiàn)中抗；雜交組合中，05-574 ×MD202 和05-574 × 207 表現(xiàn)抗病，05-574 × 20-2-5表現(xiàn)中抗；商品種中，中甘107 和中甘108 表現(xiàn)中抗。本次試驗中抗病對照21-3 的病情指數(shù)為30.33，抗性水平為中抗，感病對照BJ 的病情指數(shù)為79.60，抗性水平為高感，與孔樅樅（2019）的鑒定結(jié)果相符合，說明本次人工接種鑒定結(jié)果具有可靠性。

圖3 部分甘藍材料黑腐病田間和室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定表現(xiàn)

在本次人工接種鑒定中，大多數(shù)材料的抗性水平和田間抗性水平一致，但有6 份材料：自交系似柳生288 和CB521、雜交組合05-574 × 20-2-5 和721 × LY355、商品種中甘107 和中甘108 的抗性水平比田間抗性水平低，推測可能與田間溫度、濕度和黑腐病菌田間分布情況等因素有關(guān)。

從本試驗的總體結(jié)果來看，絕大多數(shù)材料的室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定結(jié)果與田間抗性鑒定結(jié)果一致，說明此次甘藍黑腐病田間抗性調(diào)查準確度較高，所制定的分級標準可用來反映甘藍結(jié)球期黑腐病田間發(fā)病狀況。

3 結(jié)論與討論

黑腐病是嚴重危害十字花科蕓薹屬作物的細菌性病害之一，由于抗源材料的缺乏，對甘藍類蔬菜作物的危害尤為嚴重。目前，國內(nèi)外報道了極少數(shù)高抗黑腐病的甘藍材料，但大多由于材料抗性不穩(wěn)定或者遺傳機制復雜而未能在育種研究中廣泛利用。

為了篩選甘藍黑腐病抗源材料和制定一套甘藍黑腐病田間病害分級標準，本試驗對種植在內(nèi)蒙古烏蘭察布市的55 份甘藍材料進行田間抗病性調(diào)查，制定出一套適用于田間黑腐病抗性鑒定的分級標準，同時篩選出2 份高抗黑腐病的甘藍自交系材料05-574 和20-2-5。采用噴霧法對23 份甘藍材料進行室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定，驗證了該標準的可靠性。

本試驗中，選用了世界范圍內(nèi)的黑腐病主流1號小種作為接種菌株來篩選材料，篩選出的甘藍材料抗病性強，應(yīng)用范圍廣泛。在對55 份甘藍材料進行黑腐病田間抗病性調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，材料的總體發(fā)病較均勻，材料間重復性整體較好；但同時發(fā)現(xiàn)，葉片的發(fā)病程度與土壤濕度有關(guān)，靠近土壤的葉片發(fā)病情況比上部葉片更為嚴重。甘藍結(jié)球期的田間抗性鑒定結(jié)果與室內(nèi)苗期人工接種抗病性鑒定結(jié)果較符合，除個別材料抗性水平有差異外，大多數(shù)材料結(jié)果一致，說明本試驗調(diào)查結(jié)果及數(shù)據(jù)的準確度較高。

由于國內(nèi)尚無統(tǒng)一的甘藍黑腐病田間病害分級標準，本試驗根據(jù)烏蘭察布地區(qū)55 份甘藍材料的發(fā)病整體情況初步制定了結(jié)球期甘藍黑腐病田間病級劃分標準，計算結(jié)果也相對符合材料發(fā)病情況，但是該標準是否適用于國內(nèi)其他地區(qū)，今后還需進一步調(diào)查、反復比較和完善分級標準，使該標準適用于大多數(shù)地區(qū)。

根據(jù)本次抗病性鑒定結(jié)果可知，表現(xiàn)中抗或者抗病的多為扁球型材料。然而隨著我國蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，早熟性好、葉質(zhì)脆嫩、球形較好的圓球型甘藍品種的市場逐漸增加，因此培育抗病且品質(zhì)優(yōu)良的圓球型品種成為我國甘藍育種的重要目標。本試驗中，圓球型甘藍雜交組合05-574 × 207 的田間抗性水平和室內(nèi)苗期人工接種鑒定抗性水平均達到抗病，對后續(xù)的抗黑腐病甘藍育種工作具有一定的借鑒意義。