張曉妍，沙沈菲，郭麗丹，賈 爽，周婉婷，陳雨瀅，汪立平,2,3,

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

隨著當(dāng)今高密度集約化養(yǎng)殖模式的推進(jìn)，水產(chǎn)動物病害頻發(fā)，感染性疾病特別是細(xì)菌感染嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。實驗室前期從陜西漢中某大鯢養(yǎng)殖場的病鯢體內(nèi)分離出了一株嗜水氣單胞菌（）。嗜水氣單胞菌是我國流行最廣泛的一種典型人-畜-水生動物共患致病菌，它不僅是引起魚類運(yùn)動性氣單胞菌敗血癥的主要病原，也是兩棲類、爬行類以及哺乳類動物的重要病原。抗生素類藥物因高耐藥性、藥物殘留和破壞養(yǎng)殖微生態(tài)平衡等局限，已無法滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治愈來愈高的需求。因此，當(dāng)前迫切需要尋找可替代抗生素的治療藥物來應(yīng)對嗜水氣單胞菌引起的疾病感染。

近三十年來，飼料添加劑作為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的抗生素替代物引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。益生菌、益生元及后生元作為最有前景的飼料添加劑之一，可用于防治水產(chǎn)動物的細(xì)菌性、病毒性及寄生蟲性疾病。然而，益生菌作為一種活菌制劑，對體內(nèi)環(huán)境要求較為苛刻，如遇高溫、胃酸等環(huán)境便會失活，這成為了擴(kuò)大其應(yīng)用的障礙。研究指出，益生菌對機(jī)體的作用不一定與活菌有直接關(guān)系，起關(guān)鍵作用的極有可能是菌株代謝產(chǎn)物或菌體成分，這些活效因子正式被國際益生菌組織命名為后生元（Postbiotic）。后生元又稱滅活益生菌，是益生菌經(jīng)加工處理后的菌體及其代謝產(chǎn)物的統(tǒng)稱。經(jīng)過篩選的后生元，即便經(jīng)過高溫或腸胃消化液處理仍可保有高度功能活性，且比活性益生菌具有更好的安全性、吸收性和機(jī)體分布性，有利于促進(jìn)宿主健康。

可產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌被認(rèn)為是應(yīng)用于食品、醫(yī)療等領(lǐng)域的潛在后生元，如日本的熱滅活植物乳植物桿菌L-137（L-137）。細(xì)菌素是細(xì)菌代謝過程中產(chǎn)生的一類具有生物活性的多肽或蛋白質(zhì)。天然來源的細(xì)菌素因其無毒副作用、不易產(chǎn)生耐藥性、無殘留和無污染等特點，符合水產(chǎn)品安全生產(chǎn)的需要，有望成為人類擺脫“耐藥菌危機(jī)”的新手段。用它來對付大鯢感染的特定病原，對于減少其疾病感染、耐藥菌的產(chǎn)生和傳播都具有重要意義，是極具潛力和創(chuàng)新的替代選擇。基于此，本文篩選了一株對中國大鯢病原嗜水氣單胞菌有拮抗作用的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌株，并對其進(jìn)行了抑菌特性的研究和細(xì)菌素基因簇的挖掘，以評估其作為后生元菌株的潛在應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

指示菌嗜水氣單胞菌Ah2 陜西漢中某大鯢養(yǎng)殖場病鯢體內(nèi)腹水分離所得；鯉魚上皮瘤細(xì)胞EPC上海海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院病原庫贈予；篩選用泡菜、豆豉、腐乳、酸奶和奶酪樣品 上海、武漢和青島市售食品；LB 和MRS 肉湯干粉培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；無菌脫纖維羊血平板 青島海博生物技術(shù)有限公司；抗菌藥物藥敏紙片 杭州微生物試劑有限公司；乙酸乙酯 分析純，上海泰坦科技股份有限公司；Ezup 柱式基因組DNA 抽提試劑盒（細(xì)菌）、改良Bradford 法蛋白濃度測定試劑盒、過氧化氫酶（3000 U/mg）、木瓜蛋白酶（≥15 U/mg）、胃蛋白酶（≥2500 U/mg）、胰蛋白酶（≥180 U/mg）、蛋白酶K（≥20 U/mg）、Triton X-100 生工生物工程（上海）股份有限公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；M199 培養(yǎng)基、0.25%胰酶消化液美國Gibco 公司；雙抗 北京蘭杰柯科技有限公司；T培養(yǎng)瓶 無錫耐思生命科技股份有限公司；超低分子量3.3～20.1 kD 蛋白質(zhì)Marker 北京索萊寶科技有限公司；Tricine-SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒上海萬生昊天生物技術(shù)有限公司；SDS、Tris BBI（上海）生命科學(xué)有限公司；2×Tricine loading buffer中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。

SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；7200 型紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；A200 型梯度PCR 儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；H2050R 臺式真空冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RV8V 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國IKA；JY-SCZ2+電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；FE28 酸度計 瑞士METTLER TOLEDO；IX71 光學(xué)倒置顯微鏡 日本OLYMPUS；Gel Doc 凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD；SU5000 掃描電子顯微鏡 株式會社日立制作所。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌株的篩選

1.2.1.1 指示菌Ah2 菌液的制備 將甘油管凍存的指示菌Ah2 劃線接種至固體培養(yǎng)基，28 ℃靜置孵育24 h；挑取單菌落接種至10 mL LB 肉湯，28 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)8 h 后得種子液，將種子液以1%的接種量接入LB 肉湯，上述條件培養(yǎng)后即得指示菌Ah2 菌液。

1.2.1.2 乳酸菌無細(xì)胞上清液的制備 從市售泡菜、豆豉、腐乳、酸奶和奶酪共20 份樣品中各取1 g 加入含9 mL 的0.85%無菌生理鹽水均質(zhì)袋中，均質(zhì)15 min。10 倍稀釋至10，取各濃度稀釋液100 μL均勻涂布在含CaCO的MRS 固體平板上，30 ℃孵育24～48 h。挑取產(chǎn)生溶鈣圈的菌落劃線純化3 次。將長好的單菌落接種至10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)24 h 得種子液，將種子液以2%接種量接入液體培養(yǎng)基，上述條件培養(yǎng)后得發(fā)酵液。取適量體積發(fā)酵液于4 ℃、10000 r/min 離心15 min 后收集上清液。將上清液用磷酸鈉緩沖液（pH7.0）調(diào)節(jié)至pH6.0，以此消除有機(jī)酸的干擾。0.22 μm 濾膜過濾后，加入適量過氧化氫酶使之終濃度為1 mg/mL，以此消除過氧化氫的作用。以上處理后即得無細(xì)胞上清液（Cell free supernatant，CFS）。

1.2.1.3 產(chǎn)細(xì)菌素優(yōu)良乳酸菌的篩選 基于多肽抗菌性測定法改良，采用穩(wěn)定性優(yōu)于紙片擴(kuò)散法和牛津杯法的打孔法結(jié)合雙層平板法篩選具有優(yōu)良抑菌活性的產(chǎn)細(xì)菌素菌株。于10 mm 平皿中預(yù)先倒一層含2%（w/v）瓊脂的素瓊脂培養(yǎng)基，將1‰（v/v）上述制得的指示菌Ah2 菌液與冷卻至50 ℃的LB半固體培養(yǎng)基（1%瓊脂含量）預(yù)先混合后傾注平板，使板內(nèi)菌濃度約為10CFU/mL，制備成雙層平板。凝固1 h 后，用直徑6 mm 的無菌槍頭垂直打孔，槍頭尖端挑出孔內(nèi)瓊脂。吸取50 μL 待測菌CFS 加至孔內(nèi)，4 ℃擴(kuò)散2 h，28 ℃正置培養(yǎng)6～8 h 觀察結(jié)果，每個待測菌株設(shè)置三個重復(fù)。游標(biāo)卡尺測量并記錄抑菌直徑。通過抑菌直徑評價各菌株的抑菌活性，后續(xù)研究選擇抑菌活性最佳的菌株進(jìn)行。

1.2.1.4 產(chǎn)細(xì)菌素優(yōu)良乳酸菌的鑒定 將篩選得到的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌株接種到MRS 肉湯中，30 ℃、150 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)24 h 后，于4 ℃、12000 r/min離心1 min，棄上清。采用Ezup 柱式基因組DNA抽提試劑盒（細(xì)菌）提取菌株基因組DNA，用細(xì)菌16S rDNA 通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTA CGA CTT-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 ℃ 3 min，94 ℃1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司測序，經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫同源性比對后，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定到種。

1.2.1.5 產(chǎn)細(xì)菌素優(yōu)良乳酸菌的生長曲線與細(xì)菌素產(chǎn)量動態(tài)分析 挑取優(yōu)良菌株單菌落接種至10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min 搖床培養(yǎng)18 h得種子液，種子液以2%的接種量接入500 mL 液體培養(yǎng)基，上述條件培養(yǎng)至48 h。每間隔4 h 取樣測定菌株發(fā)酵液的細(xì)胞密度OD、pH 及菌株CFS 的抑菌活性，繪制生長動態(tài)圖。CFS 根據(jù)1.2.1.2 方法制備，抑菌活性參照1.2.1.3 方法測定，每個測定數(shù)據(jù)設(shè)置三個重復(fù)。

1.2.1.6 產(chǎn)細(xì)菌素優(yōu)良乳酸菌株的藥敏特性分析參照1.2.1.3 方法制備雙層平板。表面待干后貼上標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片，置30 ℃生化培養(yǎng)箱24 h。游標(biāo)卡尺測量并記錄抑菌圈直徑。菌株對10 種抗生素的藥敏特性檢測參照國標(biāo)進(jìn)行。

1.2.2 乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌特性探究

1.2.2.1 細(xì)菌素的初步純化 取上述制得的CFS 與乙酸乙酯以1:1（v/v）萃取。萃取3 次，每次萃取2 h。CFS 一次全部加入，乙酸乙酯體積3 等分依次加入，每次加入后均需振蕩混勻。待分層清晰后，將上層萃取液轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶，40 ℃、80 r/min 旋蒸除去乙酸乙酯，即得細(xì)菌素粗提物。冷凍干燥后用適量超純水懸浮，即得細(xì)菌素粗提液（Crude extract of bacteriocin，CEB）。適當(dāng)稀釋CEB 用于考馬斯亮藍(lán)法蛋白測定試劑盒測定細(xì)菌素粗提液的蛋白濃度。

1.2.2.2 細(xì)菌素的穩(wěn)定性分析 將適量稀釋的CEB（蛋白濃度約6.47 mg/mL）分別按以下處理進(jìn)行細(xì)菌素的酸堿耐受性、熱穩(wěn)定性、酶敏感性和貯藏穩(wěn)定性測定：a.用對應(yīng)緩沖液調(diào)節(jié)CEB 的pH 至2.0～10.0，37 ℃水浴4 h 后調(diào)回pH6.0，使用不含CEB 的對應(yīng)pH 緩沖液作為對照。緩沖液種類如下：甘氨酸鹽酸鹽緩沖液（pH2.0），檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH3.0～6.0），磷酸鈉緩沖液（pH7.0），Tris 鹽酸鹽緩沖液（pH8.0～9.0）和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH10）；b.-20、60、80、100 和121 ℃分別處理各30 min，冷卻至室溫，以未處理的CEB 為對照；c.加入終濃度為1 mg/mL 木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K 溶液，37 ℃溫浴2 h 后，80 ℃加熱 15 min使蛋白酶失活，以未處理的CEB 為對照；d.4 ℃下分別儲存1、3、6 和9 個月，以未處理的新鮮CEB 為對照。以上參照1.2.1.3 測定抑菌活性，每個處理組設(shè)置三個重復(fù)。

1.2.2.3 細(xì)菌素的抑菌譜檢測 基于1.2.1.3 所述雙層平板法結(jié)合打孔法測試細(xì)菌素對16 種指示菌的抑制效果。每孔加入50 μL 適量稀釋的CEB（蛋白濃度約6.47 mg/mL），每種指示菌設(shè)置三個重復(fù)。

1.2.3 優(yōu)良乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素對嗜水氣單胞菌Ah2 的抑菌效果評估

1.2.3.1 抑菌強(qiáng)度測定與溶血反應(yīng) 參考國標(biāo)和陽離子抗菌肽方法測定細(xì)菌素對Ah2 的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）。于96 孔板中等比稀釋CEB（起始蛋白濃度約為1.08 mg/mL），共10 個濃度梯度。將10 μL 不同濃度稀釋液與90 μL 含Ah2 菌懸液（約10CFU/mL）混合，分別以Ah2 菌懸液和CEB 為陽性有菌對照和陰性無菌對照，28 ℃孵育12 h。肉眼觀察是否有細(xì)菌沉淀，肉眼無可見細(xì)菌沉淀對應(yīng)最小濃度數(shù)值即為MIC。從MIC 起向高濃度選4 個濃度梯度，每個濃度梯度取50 μL 加至血平板中28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察溶血反應(yīng)，無Ah2 溶血圈對應(yīng)最小濃度數(shù)值即為MBC。每個梯度設(shè)置三個重復(fù)。

1.2.3.2 細(xì)胞毒性變化分析 將復(fù)蘇后的EPC 細(xì)胞置于含有培養(yǎng)液（M199 培養(yǎng)基、10%（v/v）FBS 和1%（v/v）雙抗）的T瓶中25 ℃孵育至80%的細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×10/mL。取0.1 mL 加入24 孔板中，將1.2.3.1 測得的MIC 和MBC 對應(yīng)孔溶液各10 μL 分別加入含有細(xì)胞的孔中，作用12 h。分別以Ah2 菌液和CEB 為陽性有菌對照和陰性無菌對照。光學(xué)倒置顯微鏡觀察Ah2 引起的細(xì)胞形態(tài)變化，確定細(xì)菌素對Ah2 的抑菌效果。每個濃度設(shè)置三個重復(fù)。

1.2.3.3 顯微結(jié)構(gòu)變化分析 參考辛維崗等的方法制備樣本，掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）觀察經(jīng)LP01 處理后指示菌Ah2超微結(jié)構(gòu)的變化，初步探究細(xì)菌素LP01 的作用機(jī)制。

1.2.4 細(xì)菌素的分子量測定與凝膠原位抑菌活性檢測

1.2.4.1 細(xì)菌素分子量的測定 將CEB 適當(dāng)稀釋用于紫外全波長掃描定性，驗證其是否為肽或蛋白類物質(zhì)。其次，采用Tricine-SDS-PAGE 電泳測定分子量。首先預(yù)電泳，即不加樣品于30 V 電壓下運(yùn)行約30 min；將樣品按說明書變性處理后，于凝膠兩側(cè)平行上樣，每孔10 μL，80 V 運(yùn)行30 min，以樣品條帶尾部跑至濃縮膠前沿為準(zhǔn)；最后100 V 運(yùn)行4～5 h，當(dāng)條帶距離凝膠底部約0.5～1 cm 時，停止電泳。將其中一半凝膠用于考馬司亮藍(lán)R250 凝膠染色1 h 后脫色處理，根據(jù)marker 條帶判斷細(xì)菌素分子量范圍。

1.2.4.2 細(xì)菌素抑菌活性的驗證 將電泳后的另一半凝膠參照鄧曉娟等所述方法用于凝膠原位檢測，即將凝膠轉(zhuǎn)移至無菌平皿中，加入1% Triton X-100（v/v）溫和搖動20 min，使細(xì)菌素在凝膠原位復(fù)性；棄去Triton X-100 并用無菌水漂洗2 次后，加入0.1 mol/L、pH7.2 的磷酸緩沖液溫和搖動30 min，棄去緩沖液。將凝膠置于按1.2.1.3 方法制備的含指示菌Ah2 雙層平板上，28 ℃培養(yǎng)過夜，觀察有無抑菌透明帶。

1.2.5 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌株的全基因組測序及細(xì)菌素基因簇的挖掘 通過Illumina Hiseq×10 平臺（2×150 bp）進(jìn)行雙端測序（PE150），利用組裝軟件SOAPdenovo2 局部組裝及優(yōu)化形成多條基因組scaffolds，得到菌株的全基因組序列。通過在線軟件BAGEL4，挖掘菌株的抗菌物質(zhì)相關(guān)基因簇，預(yù)測植物乳植物桿菌M4L1 可能產(chǎn)生的細(xì)菌素種類。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上所測數(shù)據(jù)均包含3 次生物學(xué)重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式呈現(xiàn)。利用Origin 9.0 和IBM SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件分別對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌株的篩選

2.1.1 產(chǎn)細(xì)菌素優(yōu)良乳酸菌的篩選與鑒定 分別從泡菜、豆豉、酸奶、干酪和腐乳的20 份樣品中共分離出近80 株乳酸菌。篩選得到4 株對Ah2 具有較好拮抗作用的菌株（圖1、表1），CFS 抑菌直徑范圍在（16.85±0.14）mm 至（25.13±0.27）mm 之間，存在顯著差異（＜0.05），最終確定抑菌活力最佳菌株M4L1進(jìn)行后續(xù)研究。菌株M4L1 在MRS 瓊脂平板上形成乳白色、凸起、表面光滑且圓潤的菌落，革蘭氏染色結(jié)果顯示為一株革蘭氏陽性菌，呈直或彎的桿狀，單個、有時成對或成鏈狀（圖2）。16S rDNA 序列（Genbank 登錄號：MZ753464.1）結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定M4L1 為植物乳植物桿菌（）。

圖1 四株乳酸菌對Ah2 的抑菌效果對比Fig.1 Comparison of inhibition effect on four strains of lactic acid bacteria against Ah2

表1 四株乳酸菌的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activity of four strains of lactic acid bacteria

圖2 菌株M4L1 的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)圖Fig.2 Colony and microscopic morphology of M4L1

2.1.2 植物乳植物桿菌M4L1 的生長動態(tài)及抑菌活性規(guī)律 如圖3 所示，M4L1 從4 h 起進(jìn)入對數(shù)生長期，在24 h 時達(dá)到最大生物量，24～44 h 間處于穩(wěn)定期，44 h 后進(jìn)入衰亡期；同時，CFS 的抑菌直徑也從4 h 起明顯增加，在穩(wěn)定期（24 h）達(dá)到最大，而抑菌圈直徑的變化反映了細(xì)菌素的抑菌活性即細(xì)菌素產(chǎn)量的變化，由此說明細(xì)菌素從M4L1 對數(shù)生長期起開始分泌至穩(wěn)定期達(dá)到最大產(chǎn)量，與M4L1 的生長規(guī)律相符合。該規(guī)律體現(xiàn)了植物乳植物桿菌M4L1 產(chǎn)生的細(xì)菌素為次級代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量與M4L1 的生物量有關(guān)，因此選定24 h 為植物乳植物桿菌M4L1發(fā)酵培養(yǎng)的最佳時間。

圖3 植物乳植物桿菌M4L1 的生長動態(tài)及抑菌活性規(guī)律Fig.3 Growth dynamics and antimicrobial regularity of L.plantarum M4L1

2.1.3 植物乳植物桿菌M4L1 的藥敏特性 拮抗菌株對10 種抗生素的藥敏特性見表2。該菌對復(fù)方新諾明、頭孢曲松、氨芐西林、氯霉素和四環(huán)素等5 種抗生素高度敏感，對紅霉素中度敏感，對其余4 種藥物耐藥。該結(jié)果與許多報道的相近，說明不同來源的植物乳植物桿菌存在一些類似的藥敏特性。

表2 植物乳植物桿菌M4L1 的藥敏特性Table 2 Antibiotic susceptbility of L. plantarum M4L1

2.2 植物乳植物桿菌產(chǎn)細(xì)菌素LP01 的抑菌特性

2.2.1 細(xì)菌素LP01 的穩(wěn)定性 采用有機(jī)溶劑萃取法對M4L1 產(chǎn)細(xì)菌素進(jìn)行初步純化，得到細(xì)菌素半純化產(chǎn)物并命名為LP01。根據(jù)以下公式計算抑菌活性的變化：抑菌活性變化率（%）=（處理組CEB 的抑菌圈直徑-對照組CEB 的抑菌圈直徑）/對照組CEB 的抑菌圈直徑×100。酸堿耐受性測試中（圖4A），LP01 在過酸（pH2）和過堿（pH10）處理后仍保持較高的抑菌活性，在pH7 時抑菌活性達(dá)到最大，與對照組相比顯著增加了6.22%（＜0.05）。pH8～10時抑菌活性發(fā)生了顯著下降（＜0.05），但最低仍保持了80.02%±0.94%的抑菌活性，與食品工業(yè)已商用的拮抗添加劑Nisin A 相比，LP01 可耐受更廣泛的酸堿環(huán)境；經(jīng)-20～121 ℃處理30 min 后（圖4B），其抑菌活性無顯著變化（＞0.05）；經(jīng)9 個月貯藏期后（圖4C），抑菌活性僅下降了9.19%；LP01 經(jīng)4 種蛋白酶處理后（圖4D），抑菌活性發(fā)生了不同程度的顯著下降（＜0.05），表明其具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)。而經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后抑菌活性仍有70.95%±1.11%和67.45%±0.91%，體現(xiàn)出其良好的消化酶耐受性。綜上，細(xì)菌素LP01 不僅在廣泛的pH 和溫度下具有良好的穩(wěn)定性，且具備良好的消化酶耐受性和貯藏穩(wěn)定性。

圖4 細(xì)菌素LP01 的耐受性Fig.4 Tolerance of bacteriocin LP01

2.2.2 細(xì)菌素LP01 的抑菌譜 細(xì)菌素LP01 對測試中的14 株菌均有不同程度的抑制效果（表3）。其中，有8 株革蘭氏陰性菌，除腐敗希瓦氏菌外抑菌直徑均大于25 mm，尤其是我國最重要的人畜共患“超級細(xì)菌”鮑曼不動桿菌，其抑菌直徑高達(dá)（32.53±0.22）mm；另有6 株革蘭氏陽性菌，尤其是冷藏食品中常見腐敗菌單增李斯特氏菌和口腔疾病齲齒病原變形鏈球菌，其抑菌直徑高達(dá)（36.67±0.29）和（28.90±0.36）mm。然而LP01 對腐生葡萄球菌抑制作用低，對真菌如德巴利漢遜酵母和釀酒酵母幾乎無抑制。綜上，LP01 能夠抑制一些人畜共患致病菌、水產(chǎn)病原菌及食品腐敗菌等，體現(xiàn)出細(xì)菌素LP01 具有較廣的抑菌譜。

表3 細(xì)菌素LP01 的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectrum of bacteriocin LP01

2.3 細(xì)菌素LP01 對嗜水氣單胞菌Ah2 的抑菌效果

2.3.1 溶血與細(xì)胞毒性變化 將CEB 等比稀釋后，測得LP01 對Ah2 的MIC 約為12.94 μg/mL，該數(shù)值低于大多數(shù)抑制嗜水氣單胞菌的細(xì)菌源抗菌肽和經(jīng)典人源抗菌肽LL-37 的MIC 值，MBC 約為25.88 μg/mL，LP01 具有良好的抑菌強(qiáng)度。將MIC、MBC 組用于溶血檢測和細(xì)胞毒性試驗觀察LP01作用Ah2 前后的溶血與細(xì)胞毒性變化。結(jié)果顯示（圖5A、B）：MIC 組觀察到-溶血圈、EPC 細(xì)胞裂解死亡現(xiàn)象，與陽性對照相比Ah2 溶血性和毒性均有降低，MIC 有效抑制了Ah2 的生長，使之維持在較低的細(xì)菌濃度；MBC 組未觀察到溶血圈、EPC 細(xì)胞大小均勻且形態(tài)完好，與陰性對照幾近一致，MBC 完全殺滅了Ah2。以上表明Ah2 具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，但經(jīng)LP01 處理后，其引起的溶血和細(xì)胞毒性均有所減緩，細(xì)菌素LP01 對Ah2 具有明顯的抑制效果。

圖5 細(xì)菌素LP01 對Ah2 引起的溶血活性和細(xì)胞毒性的影響Fig.5 Effect of bacteriocin LP01 on hemolysis and cytotoxicity caused by Ah2

2.3.2 顯微結(jié)構(gòu)變化 通過SEM 觀察LP01 作用Ah2前后菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。圖像顯示，經(jīng)MIC 處理后（圖6B1），Ah2 菌體細(xì)胞發(fā)生扭曲，表面出現(xiàn)褶皺，細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁之間形成了電子透明區(qū)，與未處理的Ah2 相比（圖6A1）有輕微質(zhì)壁分離的現(xiàn)象；經(jīng)MBC 處理后（圖6C1、C2），細(xì)胞因相互擠壓而收縮變形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物溶出，細(xì)胞幾乎完全破裂?？梢娂?xì)菌素LP01 對Ah2 的細(xì)胞壁造成了一定程度的破壞，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物的溶解推測或許是膜通透性轉(zhuǎn)變的結(jié)果。

圖6 指示菌Ah2 的SEM 圖Fig.6 SEM images of indicator Ah2

2.4 細(xì)菌素LP01 的分子量與原位抑菌活性

紫外全波長掃描分析顯示，LP01 在肽和蛋白對應(yīng)吸收波長處均有吸收峰，而前者吸收峰更顯著（圖7），說明LP01 為肽類細(xì)菌素。Tricine-SDS-PAGE電泳顯示LP01 在染色凝膠上呈現(xiàn)出清晰良好的譜帶，判斷細(xì)菌素LP01 分子量范圍在3.3～4.0 kDa 內(nèi)。凝膠原位活性檢測顯示，指示菌平板的凝膠上只出現(xiàn)了一條抑菌透明帶（圖8），和染色凝膠的譜帶相吻合，直觀說明該條帶即為LP01 的譜帶，以此確定LP01為小分子肽類細(xì)菌素。

圖7 細(xì)菌素LP01 的紫外全波長掃描圖Fig.7 UV full-wavelength scanning of bacteriocin LP01

圖8 細(xì)菌素LP01 的Tricine-SDS-PAGE 電泳圖Fig.8 Tricine-SDS-PAGE of bacteriocin LP01

2.5 植物乳植物桿菌M4L1 的潛在細(xì)菌素基因簇

根據(jù)M4L1 的全基因組序列信息（登錄號：SA MN26138624）可知，其總基因組大小為3273432 bp，其中，鳥嘌呤和胞嘧啶（G+C）占總DNA 的平均含量的44.37%；將基因片段經(jīng)過組裝優(yōu)化形成了251 條基因組scaffolds；CDS（蛋白質(zhì)編碼區(qū)）共3215 個，基因平均長度為852.10 bp；非編碼區(qū)rRNA、sRNA和tRNA 的數(shù)量分別為2、48 和57。另外，利用BAGEL4 挖掘菌株M4L1 可能產(chǎn)生的細(xì)菌素。結(jié)果顯示，M4L1 細(xì)菌基因組中存在2 個潛在熱點區(qū)域（Areas of Interest, AOI），檢測到有三種蛋白質(zhì)與來自植物乳植物桿菌的II 類細(xì)菌素序列達(dá)100%一致，分別為Plantaricin K、Plantaricin E 和Plantaricin F。其中Plantaricin F 為其雙甘氨酸前導(dǎo)肽。Plantaricin K 所在生物合成基因簇中（圖9A），有一個ORF（Open reading frame）編碼具有輸出細(xì)菌素功能的特定免疫蛋白；Plantaricin E 所在生物合成基因簇中（圖9B），大多數(shù)ORFs 與plnD、plnI、plnH 和plnS 具有同源性，表明它們同屬于pln 操縱子，參與植物乳植物桿菌細(xì)菌素的產(chǎn)生。另外，位于同一操縱子的Plantaricin E 基因上游有一個lanT 基因編碼ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、ATP 結(jié)合蛋白和滲透酶蛋白PlnG。其中結(jié)構(gòu)保守的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是細(xì)菌素合成核心蛋白，含有該蛋白的細(xì)菌素通常具有抗菌活性。綜上推測，植物乳植物桿菌M4L1 或產(chǎn)生不止一種細(xì)菌素，即上述關(guān)于細(xì)菌素LP01 的抑菌特性研究結(jié)果可能涉及多種細(xì)菌素。

圖9 植物乳植物桿菌M4L1 的細(xì)菌素基因簇圖譜Fig.9 Genetic organization map of bacteriocin gene clusters of L. plantarum M4L1

3 結(jié)論

本研究從發(fā)酵腐乳中篩出一株可抑制Ah2 的優(yōu)良M4L1。首先，菌株的酸堿、熱、消化酶耐受性等是決定其能否應(yīng)用為后生元的關(guān)鍵。細(xì)菌素LP01 的耐受性分析結(jié)果表明：經(jīng)酸堿處理后的LP01 對Ah2 的抑菌活性最低仍保持在80.02%±0.94%；經(jīng)多種消化酶處理后，抑菌活性最低仍保留了67.45%±0.91%；在-21～121 ℃幾乎無抑菌活性的喪失。細(xì)菌素LP01 不僅分子量小，還表現(xiàn)出優(yōu)良的酸堿、熱、消化酶耐受性及貯藏穩(wěn)定性。其次，作為一種抑菌物質(zhì)，抑菌活力的范圍和強(qiáng)度是評價其抑菌效果的重要指標(biāo)。抑菌譜檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌素LP01 具有廣譜抑菌特性，能夠有效抑制包括水產(chǎn)致病菌、食品腐敗菌及人畜共患致病菌在內(nèi)的多種病原菌；通過研究其抑菌效果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LP01 處理后Ah2 的溶血性和細(xì)胞毒性明顯降低；經(jīng)進(jìn)一步的SEM 觀察推測，LP01 的抑菌或殺菌作用或許是細(xì)胞膜通透性改變的結(jié)果；另外，基因預(yù)測到M4L1 包含2 個潛在的細(xì)菌素合成基因簇。由此可見，作為一株生物安全菌株，植物乳植物桿菌M4L1 具備良好的產(chǎn)細(xì)菌素能力。因此，細(xì)菌素LP01 不僅有望作為生物防腐劑用于控制食品中存在的多藥耐藥菌株，還為水產(chǎn)動物病害與人類疾病防治藥物的篩選提供了新方向。

后生元作為一種滅活益生菌，通過其代謝產(chǎn)物發(fā)揮益生功效。既不需要以活菌形式存在，也無需在動物胃腸道內(nèi)定殖，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)益生菌的不足。本文研究的M4L1 及其細(xì)菌素LP01 具有作為保護(hù)劑拮抗多種病原體的能力，是水產(chǎn)病害防治潛在的后生元菌株，對促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要的意義。后續(xù)還須對其高度純化以深入探討其抑菌效果、結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制等，以期得到乳酸菌更豐富的細(xì)菌素資源庫。