＊周飛躍 肖珊珊 徐哲峰 程佩琪 謝鋒 郭成文 曾偉民*

（1.楚天科技股份有限公司 湖南 410001 2.中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院 湖南 410083 3.中南大學(xué)生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南 410083）

汽化過氧化氫（Vaporized Hydrogen Peroxide，VHP）滅菌技術(shù)是通過改變過氧化氫的狀態(tài)，使其由液態(tài)迅速汽化為氣態(tài)，來達(dá)到滅菌消毒目的的一種技術(shù)[1]。研究表明，汽化狀態(tài)下的過氧化氫生物殺滅量可達(dá)1.0×106，且殺滅細(xì)胞芽孢的能力比液態(tài)過氧化氫強(qiáng)200倍[2]。不同于傳統(tǒng)的消毒滅菌方式，如甲醛熏蒸、臭氧熏蒸、二氧化氯熏蒸等，VHP滅菌技術(shù)滅菌條件溫和，滅菌效果理想，滅菌物質(zhì)對人體和環(huán)境無毒，且基本無殘留，設(shè)備安裝和操作簡單及全自動化控制，已經(jīng)得到了歐盟、WHO和國內(nèi)眾多GMP認(rèn)證專家普遍認(rèn)可[3-4]。

汽化的過氧化氫產(chǎn)生的氧自由基具有很強(qiáng)的氧化性，可能會使細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等發(fā)生氧化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡從而達(dá)到滅菌目的[5]。將羥基自由基溶于船舶壓載水中，當(dāng)羥基自由基濃度達(dá)到0.65mg·L-1時，水中浮游生物和細(xì)菌的致死率100%，對處理后的藻細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生變形、細(xì)胞壁破裂，大量內(nèi)容物溢出[6]。另外羥基自由基可以氧化破壞小新月菱形藻的蛋白質(zhì)、多糖、葉綠素等，并使其無法再生[7]。

目前國內(nèi)外對于VHP滅菌技術(shù)的研究，主要集中在過氧化氫的注入速度、滅菌過程的溫度、相對濕度、過氧化氫蒸汽濃度、過氧化氫蒸汽分布、滅菌材料等參數(shù)[8-12]。但這些滅菌參數(shù)通?；谝恍﹥?yōu)化實(shí)驗(yàn)及行業(yè)經(jīng)驗(yàn)，受環(huán)境的影響較大，在不同的地區(qū)、氣候等條件下，滅菌效果不一致。因此，導(dǎo)致VHP滅菌技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)至今未統(tǒng)一。而自由基是VHP滅菌的本質(zhì)[4,13-15]，是影響滅菌效果的直接因素，它受到諸多滅菌參數(shù)如濕度、溫度、飽和度等的影響。從自由種類及濃度出發(fā)，研究自由基對滅菌效果的影響，闡明滅菌參數(shù)—自由基種類及濃度—滅菌效果三者之間的關(guān)聯(lián)性，對完善VHP滅菌標(biāo)準(zhǔn)、優(yōu)化滅菌工藝、提高滅菌效果具有重要的理論及實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1.材料與方法

(1)實(shí)驗(yàn)材料及儀器

實(shí)驗(yàn)用商用生物指示劑（BIS）為嗜熱脂肪芽孢桿菌（ATCC 7953）[16]，BIs基于304級不銹鋼載體（直徑9mm，厚度0.2mm），每個載體接種1.0×106個嗜熱脂肪芽孢桿菌。該BIs由美國Mesa實(shí)驗(yàn)室制造，密封在醫(yī)用級Tyvek?封套中。所用培養(yǎng)基為溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，其配方見2002版《消毒技術(shù)規(guī)范》附錄A[17]。

實(shí)驗(yàn)儀器主要包括由長沙楚天科技股份有限公司提供的過氧化氫汽化及配套裝置（GE2S24），見圖1。該裝置由操作艙和傳遞艙組成，兩個艙中均裝有VAISALA傳感器HPP272，分別用以監(jiān)測艙內(nèi)實(shí)時溫度、相對濕度以及過氧化氫蒸汽濃度。其他主要使用的儀器有：DH5000AB恒溫培養(yǎng)箱（上海旌派儀器有限公司）；可見光分光光度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器有限公司）；JA2003電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

圖1 汽化過氧化氫滅菌配套裝置

(2)實(shí)驗(yàn)方法

①過氧化氫濃度的提升與維持

使用楚天科技股份有限公司提供的過氧化氫濃度提升與維持的配套裝置來進(jìn)行滅菌實(shí)驗(yàn)，滅菌周期包括四個連續(xù)的階段：第一階段（除濕階段）干燥空氣通過空壓機(jī)與艙內(nèi)的空氣進(jìn)行交換，降低密閉環(huán)境中的相對濕度，同時對管網(wǎng)進(jìn)行加熱，提高密閉環(huán)境中的溫度；第二階段（提升階段）提高蒸發(fā)盤溫度（145～155℃），通過蠕動泵將30%過氧化氫溶液滴入蒸發(fā)盤內(nèi)，使其快速汽化以提升密閉環(huán)境中過氧化氫蒸汽濃度；第三階段（維持階段）以較低的速率引入過氧化氫，使得僅替換消耗的過氧化氫，并且在隔離器內(nèi)保持恒定的過氧化氫濃度進(jìn)行滅菌；第四階段（通風(fēng)階段）利用空壓機(jī)通入新鮮空氣，使密閉空間中的過氧化氫濃度降低至1cm3/m3以下。

②滅菌參數(shù)優(yōu)化

在VHP滅菌領(lǐng)域，過氧化氫濃度和滅菌維持時間對滅菌效果影響較為顯著，一般密閉空間內(nèi)的過氧化氫濃度需達(dá)到在300cm3/m3以上，滅菌維持時間30min以上，才能達(dá)到良好的滅菌效果。為了縮短滅菌時間、降低過氧化氫濃度以降低工藝成本，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了50cm3/m3、100cm3/m3、200cm3/m3、300cm3/m3、400cm3/m3、500cm3/m3、600cm3/m3共7個過氧化氫濃度和10min、20min、30min共3個滅菌維持時間進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。對每種參數(shù)下的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作2次。

③滅菌效果評價

均勻?qū)Is分布在操作艙內(nèi)的7個位置，其中底部臺面的四個頂點(diǎn)各1個，中間點(diǎn)1個共5個，兩側(cè)壁各1個。等待滅菌結(jié)束后，按照WS 310《醫(yī)院消毒供應(yīng)中心》來進(jìn)行驗(yàn)證與監(jiān)測[18]。即將所有已滅菌的菌片分別放入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中，同時每組都設(shè)置陽性對照和陰性對照，在60℃下?lián)u床培養(yǎng)7天，若所有培養(yǎng)基均不變色則代表滅菌成功，反之滅菌失敗。

④羥基自由基濃度檢測

基于·OH跟亞甲基藍(lán)（Methylene blue，MB）的發(fā)色基團(tuán)（巰基）反應(yīng)生成亞甲基白使MB溶液褪色，利用紫外-可見分光光度計(jì)測定捕捉后的MB溶液的OD664nm，根據(jù)MB的含量變化計(jì)算捕捉的·OH含量[19]。具體操作方法如下：

配制0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L濃度梯度的亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測定各溶液664nm下的吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。將操作艙中汽態(tài)過氧化氫濃度（CSC）設(shè)置為50cm3/m3、100cm3/m3、200cm3/m3、300cm3/m3、400cm3/m3、500cm3/m3，實(shí)驗(yàn)時將裝有5ml 0.4mg/L的亞甲基藍(lán)溶液的離心管提前放入封閉的操作艙中，將其分成兩組，一組敞開放置，以測量腔體內(nèi)的羥基自由基，另一組封閉管蓋，滅菌結(jié)束后放入菌片。同時設(shè)置兩組空白，一組置于操作艙外敞開于室內(nèi)空氣中，另一組置于操作艙內(nèi)封閉管蓋，滅菌結(jié)束后放入未滅菌的菌片。每個處理一式四份。

⑤超氧陰離子檢測

·O2-將羥胺氧化成NO2-，于酸性條件下與磺胺反應(yīng)形成重氮鹽；將重氮鹽進(jìn)一步與α-萘胺偶聯(lián)形成粉紅色偶氮化合物，該化合物在530nm處有強(qiáng)烈吸收峰。在實(shí)際生物樣本·O2-含量測試時，利用羥胺氧化法工作曲線將測試體系吸光度A530nm轉(zhuǎn)換為NO2-濃度，再依據(jù)反應(yīng)式可計(jì)算·O2-濃度[21]。具體操作方法見圖2，每組3個平行，測定腔體內(nèi)超氧陰離子濃度時溶液體系放大4倍，具體操作和空白對照設(shè)置與1.2.4相同。

2.結(jié)果與討論

(1)自由基濃度標(biāo)曲

根據(jù)亞甲基藍(lán)法和羥胺氧化法，采用分光光度法，可快速測定出MB和NO2-的標(biāo)曲，見圖3，線性擬合性較好，說明用該方法測定自由基濃度是可行的。

圖3 亞甲基藍(lán)法及羥胺氧化法測羥基自由基和超氧陰離子的工作標(biāo)曲

(2)操作條件對自由基濃度的影響

①環(huán)境溫度對自由基濃度的影響

將滅菌時間固定為30min，在環(huán)境溫度分別為4℃、10℃、20℃時，測定了腔體內(nèi)部和菌片表面的羥基自由基和超氧陰離子濃度。如圖4，在相同的過氧化氫濃度下，隨著溫度升高，菌片表面的自由基濃度呈現(xiàn)下降趨勢。在300cm3/m3、400cm3/m3、500cm3/m3過氧化氫濃度下，20℃時菌片表面的羥基自由基含量比4℃分別減少了1.518×10-5μmol/m3、4.334×10-5μmol/m3、3.068×10-5μmol/m3，而超氧陰離子分別減少0.0215μmol/m3、0.02355μmol/m3、0.01218μmol/m3。當(dāng)過氧化氫濃度為300cm3/m3時，20℃時腔體內(nèi)的羥基自由基和超氧陰離子含量比4℃時分別減少了1.330×10-4μmol/m3和0.251μmol/m3。當(dāng)過氧化氫濃度為400cm3/m3時，20℃時腔體內(nèi)的羥基自由基和超氧陰離子含量比4℃時分別減少了2.031×10-4μmol/m3和0.233μmol/m3，這說明低濃度過氧化氫條件下，較高溫度更容易導(dǎo)致腔體內(nèi)自由基的消散。而當(dāng)過氧化氫濃度為500cm3/m3時，隨溫度上升腔體內(nèi)部自由基的含量呈先上升再下降的趨勢，在環(huán)境溫度為10℃時其濃度分別可達(dá)4.590×10-4μmol/m3和0.593μmol/m3，這可能是因?yàn)樵谠摋l件下，過氧化氫蒸汽濃度已經(jīng)超過了其飽和度，此時提高溫度相當(dāng)于提高了其飽和度，說明在高濃度過氧化氫條件下，適當(dāng)提高環(huán)境溫度反而能增加羥基自由基的含量。

圖4 不同環(huán)境溫度下腔體內(nèi)部

②過氧化氫濃度對自由基濃度的影響

見圖5，在腔體內(nèi)部，隨汽態(tài)過氧化氫濃度升高，過氧化氫分解產(chǎn)生的羥基自由基和超氧陰離子都呈先上升再下降的趨勢，在過氧化氫濃度為300cm3/m3時急速上升，在400cm3/m3時達(dá)到最大，分別為4.50×10-4μmol/m3和0.8442μmol/m3。而在菌片表面，羥基自由基和超氧陰離子生成的趨勢相同，但卻不在同一過氧化氫濃度達(dá)到最大值，在過氧化氫濃度為400cm3/m3時羥基自由基含量達(dá)8.0×10-5μmol/cm2，而在300cm3/m3時超氧陰離子就已經(jīng)達(dá)到0.109μmol/cm2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于羥基自由基的濃度。

圖5 環(huán)境溫度4℃下不同過氧化氫濃度下腔體內(nèi)部（a）與菌片表面（b）自由基的含量

③濕度對自由基濃度的影響

由于過氧化氫分子與水分子結(jié)構(gòu)相似，兩者都會影響空氣濕度[22]，故總的相對濕度應(yīng)由過氧化氫蒸汽的相對濕度和水的相對濕度兩部分構(gòu)成。本實(shí)驗(yàn)監(jiān)測了環(huán)境溫度為4℃時，不同滅菌時間和過氧化氫蒸汽濃度下，過氧化氫蒸汽的相對濕度變化情況；以及不同過氧化氫蒸汽的相對濕度下，腔體內(nèi)部和菌片表面的羥基自由基濃度。見圖6，當(dāng)過氧化氫蒸汽濃度不變時，隨著滅菌時間延長，腔體內(nèi)過氧化氫蒸汽的相對濕度均有一定程度的下降。這是因?yàn)殡S著滅菌時間變長，過氧化氫分解程度也不斷增加，其產(chǎn)物水蒸汽變多，且過氧化氫蒸汽濃度越大，其分解的速率越大，30min內(nèi)500cm3/m3濃度時的相對濕度減少量是50cm3/m3時的5.6倍。而腔體內(nèi)過氧化氫蒸汽濃度越高，其相對濕度也會相應(yīng)變大，當(dāng)過氧化氫蒸汽濃度達(dá)到500cm3/m3時，其相對濕度最高可達(dá)39.292%，這相對于50cm3/m3濃度時提高了近3倍。

圖6 環(huán)境溫度4℃下不同過氧化氫濃度和維持時間下過氧化氫濕度的變化情況

見圖7，隨著腔體內(nèi)過氧化氫濕度不斷提高，腔體內(nèi)和菌片表面的羥基自由基呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在過氧化氫濕度為23.252%時，羥基自由基濃度激增，在24.634%達(dá)到最大值，分別為4.5×10-4μmol/m3和8.0×10-5μmol/cm2。超氧陰離子的趨勢與羥基自由基相同，但當(dāng)過氧化氫濕度為24.635%時，腔體內(nèi)超氧陰離子達(dá)到最大值0.8442μmol/m3，而當(dāng)過氧化氫濕度為23.252%時，菌片表面超氧陰離子達(dá)到最大值0.109μmol/cm2。

圖7 環(huán)境溫度4℃下不同過氧化氫濕度下羥基自由基（a）和超氧陰離子（b）的變化

(3)滅菌參數(shù)的優(yōu)化

該優(yōu)化實(shí)驗(yàn)經(jīng)過多次重復(fù)驗(yàn)證，其滅菌效果均相同，這里只展示其中一次的滅菌效果，見表1。結(jié)果表明，低濃度過氧化氫下，達(dá)到滅菌要求耗時更長；而在高濃度過氧化氫蒸汽條件下，滅菌時間對滅菌效果影響不大。當(dāng)過氧化氫蒸汽濃度達(dá)到400cm3/m3、滅菌時間達(dá)到20min時，7d內(nèi)所有BIs的培養(yǎng)都顯示為陰性，說明該參數(shù)下已經(jīng)能滿足滅菌要求，之后再增加過氧化氫濃度和滅菌時間將提高工藝成本。

表1 不同工藝參數(shù)下嗜熱脂肪芽孢桿菌的殺滅效果

續(xù)表

(4)滅菌效果與自由基濃度的關(guān)聯(lián)性

根據(jù)2.3中的工作內(nèi)容，測量了環(huán)境溫度為4℃、滅菌時間為30min時，過氧化氫蒸汽濃度為50cm3/m3、100cm3/m3、200cm3/m3、300cm3/m3、400cm3/m3、500cm3/m3時腔體內(nèi)部和菌片表面所對應(yīng)的羥基自由基和超氧陰離子濃度，如表2和表3?？傮w上，在相同參數(shù)下，超氧陰離子的濃度始終遠(yuǎn)大于羥基自由基濃度。2.3的結(jié)果表明過氧化氫蒸汽濃度達(dá)到400cm3/m3時才能達(dá)到滅菌效果，而在過氧化氫濃度為300cm3/m3時菌片表面超氧陰離子的濃度已經(jīng)達(dá)到最大值0.1090μmol/cm2，腔體內(nèi)部的超氧陰離子濃度也比過氧化氫蒸汽濃度為500cm3/m3時腔體內(nèi)部的超氧陰離子多4.9432×10-2μmol/m3，但在該條件下滅菌不合格，說明在過氧化氫的滅菌過程中，超氧陰離子對嗜熱脂肪芽孢桿菌的殺滅效果并不明顯。

表3 環(huán)境溫度4℃下滅菌維持時間30min時不同過氧化氫濃度下嗜熱脂肪芽孢桿菌的殺滅效果與相應(yīng)的超氧陰離子（?O2-）濃度

與之相對，滅菌結(jié)果顯示出羥基自由基濃度與滅菌效果明顯相關(guān)，當(dāng)過氧化氫蒸汽濃度達(dá)到400cm3/m3時，羥基自由基濃度最大，能滿足滅菌要求，而在過氧化氫濃度為500cm3/m3時，腔體內(nèi)部和菌片表面羥基自由基濃度分別為3.92×10-4μmol/m3和6.80×10-5μmol/cm2，相比過氧化氫濃度為400cm3/m3時羥基自由基濃度都有所下降，不過仍然能達(dá)到滅菌要求。說明在VHP滅菌過程中，羥基自由基是決定滅菌成功的一個重要因素。在其他人的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論。KWUN M S等人利用自由基清除劑，確定·OH是導(dǎo)致大腸桿菌凋亡的最重要的自由基，而·O2-的影響最小[23]。張靜[24]發(fā)現(xiàn)當(dāng)體系中·OH被抑制時，金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值急劇下降。

在利用過氧化氫蒸汽進(jìn)行滅菌時，當(dāng)過氧化氫蒸汽濃度接近其飽和濃度時，即達(dá)到其露點(diǎn)時，在物體表面會發(fā)生微冷凝，形成的液膜可以增大過氧化氫與微生物的接觸面積，使過氧化氫更好的在微生物表面沉積，從而縮短滅菌時間。而且研究表明在相對濕度較低的狀態(tài)下，汽態(tài)過氧化氫發(fā)生冷凝時的濃度更高[25]。因此在進(jìn)行VHP滅菌時，通常要使過氧化氫接近微冷凝的狀態(tài)，但不是使其冷凝，才能更快更好地達(dá)到滅菌要求[5,26]。

在一個密閉的空間里，過氧化氫濃度的提升與該空間的溫度和濕度密切相關(guān)。本研究雖然沒有測量過氧化氫的露點(diǎn)，但從表1、表2和圖4也不難推斷出，當(dāng)過氧化氫蒸汽濃度低于飽和濃度時，提高溫度會增大過氧化氫蒸汽的飽和度，達(dá)到微冷凝就需要更高的過氧化氫蒸汽濃度，這其實(shí)是不利于滅菌的；當(dāng)過氧化氫蒸汽濃度高于飽和度時，適當(dāng)?shù)奶岣邷囟饶茉黾恿u自由基和超氧陰離子濃度，但溫度過高自由基消失得越快，反而不利于滅菌。

表2 環(huán)境溫度4℃下滅菌維持時間30min時不同過氧化氫濃度下嗜熱脂肪芽孢桿菌的殺滅效果與相應(yīng)的羥基自由基（?OH）濃度

當(dāng)過氧化氫蒸汽濃度達(dá)到400cm3/m3，環(huán)境溫度為4℃，滅菌時間30min時，腔體內(nèi)部和菌片表面的羥基自由基濃度高達(dá)4.500×10-4μmol/m3和8.003×10-5μmol/cm2，可以達(dá)到完全滅菌的要求，此時再提高過氧化氫蒸汽濃度反而會使羥基自由基濃度下降，不利于滅菌。而在許多應(yīng)用研究中，往往選擇高濃度過氧化氫或者較長的滅菌時間來進(jìn)行滅菌。Rogers等[27]將炭疽桿菌、枯草芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子置于光滑材料表面，并暴露于1000cm3/m3汽態(tài)過氧化氫中20min，才能使三種微生物的殺滅對數(shù)值大于6。趙四清等[28]以嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌為指示菌，在汽化過氧化氫濃度460cm3/m3、滅菌時間90min的參數(shù)下進(jìn)行生物安全實(shí)驗(yàn)室的消毒，未檢出指示菌。雖然這些參數(shù)均能夠滿足滅菌要求，但顯然造成了資源的浪費(fèi)，這就需要我們從自由基的角度出發(fā)去設(shè)計(jì)VHP滅菌參數(shù)。

3.結(jié)論

從自由基種類及濃度出發(fā)，探究了溫度、過氧化氫濃度、濕度參數(shù)對其影響，以及結(jié)合滅菌參數(shù)及滅菌效果的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)羥基自由基、超氧陰離子與滅菌參數(shù)之間存在明顯的規(guī)律，且羥基自由基對滅菌效果產(chǎn)生重要影響。過氧化氫蒸汽濃度越高，其濕度越大，自由基的濃度均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，且在高濃度過氧化氫條件下，適當(dāng)提高溫度有利于提高空間自由基濃度，但溫度過高會導(dǎo)致自由基的消散，說明一味追求高濃度過氧化氫滅菌并不可取。當(dāng)過氧化氫蒸汽濃度達(dá)到400cm3/m3，環(huán)境溫度為4℃，濕度為24.634%，滅菌時間30min時，腔體內(nèi)部和菌片表面的羥基自由基濃度高達(dá)4.500×10-4μmol/m3和8.003×10-5μmol/cm2，可以達(dá)到完全滅菌的要求。本研究闡明了滅菌參數(shù)—自由基種類及濃度—滅菌效果三者之間的關(guān)聯(lián)性，對完善VHP滅菌標(biāo)準(zhǔn)、優(yōu)化滅菌工藝、提高滅菌效果具有重要的理論及實(shí)踐指導(dǎo)意義。