宋忠軍，朱曉青，何艷，李勇軍，陸苑（1.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550004；.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床試驗研究中心，貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴陽 550004）

銀杏葉提取物是從銀杏葉中提取的以黃酮類、萜內(nèi)酯類等化合物為主要活性成分的天然藥物[1]。研究表明，銀杏葉提取物具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用，被廣泛應(yīng)用于心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病和腫瘤的輔助治療[1]。銀杏黃酮苷元（ginkgo flavone aglycone，GA）是借助酶水解法除去銀杏葉提取物中黃酮苷的糖基所獲得的新型提取物，主要成分為槲皮素、山柰酚和異鼠李素[2]。與傳統(tǒng)的銀杏葉提取物相比，GA具有更高的生物利用度和更強(qiáng)的生物活性[3]。多柔比星（doxorubicin，DOX）又稱阿霉素，是臨床治療肝癌、淋巴瘤、乳腺癌等惡性腫瘤的一線化療藥物，但該藥具有明顯的心臟毒性、腎毒性、骨髓抑制等毒副作用（尤以心臟毒性最為嚴(yán)重），且在治療過程中易誘發(fā)多藥耐藥，已成為目前腫瘤臨床治療難以克服的瓶頸[4-5]。

中藥對化療藥物的增效減毒作用是腫瘤治療研究的熱點之一[6]。相關(guān)研究表明，中藥的介入可明顯減少化療藥物所致不良反應(yīng)，提高化療有效率，改善腫瘤患者的生存質(zhì)量[7]。有研究表明，在腫瘤治療過程中，DOX的多藥耐藥性主要由P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）介導(dǎo)，而DOX與P-gp抑制劑聯(lián)合使用可增強(qiáng)DOX的抗腫瘤活性[8]。此外，DOX所致氧化損傷是其引發(fā)心臟毒性的主要原因[9]，而槲皮素、山柰酚和異鼠李素均具有抗腫瘤、抗氧化和保護(hù)心腦血管系統(tǒng)等多種藥理活性[10-13]，且三者都是P-gp抑制劑[14]?；诖?，本課題組推測GA對DOX具有一定的增效減毒作用，故本研究以H22荷瘤小鼠為對象，初步探討GA的增效減毒作用，旨在為銀杏資源的深度開發(fā)利用及臨床抗肝癌聯(lián)合用藥方案的選擇提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括680型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）、800DH型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

GA（槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量分別為44.61%、44.23%、4.77%）由貴州省生化工程中心何珺副教授惠贈；鹽酸多柔比星原料藥（批號N1111A，純度＞98%）購自大連美倫生物技術(shù)有限公司；甲胎蛋白（alpha-fetal protein，AFP）檢測試劑盒（批號20210816）購自南京建成生物工程研究所；B型鈉尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）、N末端腦鈉肽前體（N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-pro BNP）檢測試劑盒（批號分別為08/2021、08/2021）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗人血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，又名CD31）抗體（批號GB113151）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號GB23303）和蘇木精-伊紅（HE）染液、天狼星紅染液、pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）、TUNEL試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

H22小鼠肝癌細(xì)胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.4 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠，體質(zhì)量為16～20 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2020-0001。所有小鼠均飼養(yǎng)于溫度18～25℃、相對濕度50%～70%的動物房內(nèi)，自由攝食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周開始后續(xù)實驗。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批件號為NO2101200。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將H22細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，共傳代2次。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)臺盼藍(lán)染色并待細(xì)胞存活率大于95%后，用PBS稀釋得1×107個/mL的細(xì)胞懸液，備用。

2.2 H22荷瘤小鼠模型建立

取“2.1”項下H22細(xì)胞懸液經(jīng)2次腹水傳代后，用PBS稀釋，制成2×107個/mL的腫瘤細(xì)胞懸液。取上述腫瘤細(xì)胞懸液0.2 mL于小鼠右腋皮下單次接種，以接種后小鼠右腋出現(xiàn)肉眼可見瘤體為造模成功。

2.3 動物分組與給藥

造模成功后，將小鼠隨機(jī)分為模型對照組、DOX組、GA組、GA+DOX組，每組6只。模型對照組小鼠每天腹腔注射生理鹽水0.25 mL，DOX組小鼠隔天（即第1、3、5、7、9、11、13、15天）尾靜脈注射DOX藥液（以生理鹽水為溶劑）2.5 mg/kg，GA組小鼠每天灌胃GA混懸液（以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑）30 mg/kg，GA+DOX組小鼠每天灌胃GA混懸液30 mg/kg+隔天（同DOX組）尾靜脈注射DOX藥液2.5 mg/kg，連續(xù)給藥15 d。各藥物組劑量均依據(jù)本課題組前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置。

2.4 小鼠一般生長狀況檢測

實驗期間，觀察各組小鼠的一般生長狀況，稱定其體質(zhì)量并繪制體質(zhì)量變化曲線；同時，計算各組小鼠的體質(zhì)量變化百分比：體質(zhì)量變化百分比（%）＝（最終體質(zhì)量-最初體質(zhì)量）/最初體質(zhì)量×100%。

2.5 小鼠腫瘤組織生長情況檢測

治療期間，每2天測量并計算腫瘤體積（V）：V＝（a×b2）×0.5（式中，a為瘤體長度，b為瘤體寬度），同時繪制腫瘤生長曲線。末次給藥2 h后，于眼球取血并處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，稱取瘤體質(zhì)量并計算抑瘤率：抑瘤率（%）＝（C-T）/C×100%（式中，C為模型對照組小鼠的平均瘤體質(zhì)量，T為各藥物組小鼠的平均瘤體質(zhì)量）。使用金氏公式來評估藥物聯(lián)合使用的效果（Q）：Q＝EGA+DOX/[EGA+（1-EGA）EDOX]（式中，EGA、EDOX和 EGA+DOX分別表示GA、DOX單藥及其聯(lián)合使用的抑瘤率）。當(dāng)Q＜0.85時，表示兩藥作用拮抗；當(dāng)Q為0.85～1.15時，表示兩藥作用相加；當(dāng)Q＞1.15時，表示兩藥作用協(xié)同[15]。

2.6 小鼠血清AFP水平檢測

末次給藥后，取各組小鼠血樣，制備血清。取血清適量，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法以酶標(biāo)儀測定AFP水平，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作。

2.7 小鼠腫瘤組織病理觀察及細(xì)胞凋亡情況檢測

末次給藥后，取各組小鼠腫瘤組織適量，在4%甲醛溶液中固定72 h后，常規(guī)石蠟包埋、脫水、切片。取組織切片進(jìn)行HE染色，觀察腫瘤組織病理改變情況并計算腫瘤組織壞死面積百分比：腫瘤組織壞死面積百分比（%）＝腫瘤組織壞死面積/腫瘤總面積×100%。同時，取組織切片進(jìn)行TUNEL染色，觀察腫瘤組織中細(xì)胞的凋亡情況并分析凋亡陽性率：凋亡陽性率（%）＝凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.8 小鼠腫瘤組織中CD31表達(dá)水平檢測

采用免疫組化法進(jìn)行檢測。取各組小鼠腫瘤組織適量，常規(guī)石蠟包埋、脫水、切片，切片脫蠟并經(jīng)乙醇梯度水化、抗原修復(fù)后，用3%過氧化氫溶液孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；用3%牛血清白蛋白在室溫下孵育，加入CD31一抗（稀釋比例為1∶500），4℃孵育過夜；加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶200），室溫孵育50 min，用PBS清洗3次，以DAB試劑顯色，經(jīng)水洗、蘇木精復(fù)染、脫水、封片后，使用顯微鏡觀察并采集圖像（蘇木精染細(xì)胞核呈藍(lán)色，DAB染CD31陽性表達(dá)細(xì)胞呈棕黃色），通過分析蛋白表達(dá)陽性率來反映CD31蛋白的表達(dá)水平。

2.9 小鼠心臟病理改變及心肌纖維化情況檢測

末次給藥后，取各組小鼠心臟，用生理鹽水沖洗并用濾紙吸干，稱定心臟質(zhì)量并計算心臟指數(shù)：心臟指數(shù)＝心臟質(zhì)量/最終體質(zhì)量。取心臟組織適量，于4%甲醛溶液中固定72 h后，常規(guī)石蠟包埋、脫水、切片。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法以酶標(biāo)儀檢測其血清BNP、NT-pro BNP水平，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作；取組織切片進(jìn)行HE和天狼星紅染色，分別觀察其心臟病理改變和心肌纖維化情況。

2.1 0 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 GA聯(lián)合DOX對小鼠一般生長狀況的影響

H22荷瘤小鼠的造模成功率為100%。實驗期間，各組小鼠飲食正常，除模型對照組和DOX組小鼠出現(xiàn)精神萎靡外，其余各組小鼠的精神狀況良好。

實驗期間，各組小鼠體質(zhì)量均有所增加；與模型對照組比較，GA組小鼠體質(zhì)量變化百分比無明顯變化（P＞0.05），DOX組小鼠體質(zhì)量變化百分比顯著降低（P＜0.01），GA+DOX組上述指標(biāo)介于DOX組和GA組之間，但仍顯著低于模型對照組（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠的體質(zhì)量變化（±s，n＝6）

3.2 GA聯(lián)合DOX對小鼠腫瘤組織生長的影響

實驗期間，各組小鼠的腫瘤生長速度依次為：模型對照組＞GA組＞DOX組＞GA+DOX組。經(jīng)過15 d的干預(yù)后，各藥物組小鼠的瘤體體積和質(zhì)量（P＜0.01）均小于/低于模型對照組；與DOX組比較，GA+DOX組小鼠的瘤體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖2、表1。DOX組、GA組、GA+DOX組的抑瘤率分別為54.29%、42.50%和89.29%；GA與DOX聯(lián)用的Q為1.21，提示兩藥聯(lián)用表現(xiàn)為協(xié)同的抑瘤作用。

表1 GA聯(lián)合DOX對小鼠腫瘤組織生長和血清AFP水平的影響（±s，n＝6）

表1 GA聯(lián)合DOX對小鼠腫瘤組織生長和血清AFP水平的影響（±s，n＝6）

a：與模型對照組比較，P＜0.01；b：與模型對照組比較，P＜0.05；c：與DOX組比較，P＜0.01

AFP/（ng/mL）3.34±0.19 2.77±0.12a 3.03±0.18b 2.63±0.18a組別模型對照組DOX組GA組GA+DOX組瘤體質(zhì)量/g 2.80±0.25 1.28±0.09a 1.61±0.22a 0.30±0.05ac

圖2 GA聯(lián)合DOX對小鼠腫瘤組織生長的影響（±s，n＝6）

3.3 GA聯(lián)合DOX對小鼠血清AFP水平的影響

與模型對照組比較，各藥物組小鼠血清AFP水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與DOX組比較，GA+DOX組小鼠血清中AFP水平雖有所降低，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

3.4 GA聯(lián)合DOX對小鼠腫瘤組織病理學(xué)及細(xì)胞凋亡情況的影響

HE染色腫瘤組織病理學(xué)檢查結(jié)果見圖3。由圖3可知，模型對照組小鼠腫瘤組織中細(xì)胞數(shù)量較多，無明顯壞死細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)特征明顯，呈明顯的球形、梭形且有大核，表明組織內(nèi)細(xì)胞處于快速增殖狀態(tài)。各藥物組小鼠腫瘤組織出現(xiàn)不同程度壞死，細(xì)胞分布不規(guī)則，胞核固縮、碎裂，其腫瘤組織壞死面積百分比均顯著高于模型對照組（P＜0.05或P＜0.01）；與DOX組比較，GA+DOX組小鼠腫瘤組織壞死面積雖有增大趨勢，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。腫瘤組織TUNEL染色結(jié)果見圖4。由圖4可知，與模型對照組比較，各藥物組小鼠腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞均有所增多，且GA+DOX組小鼠腫瘤組織中細(xì)胞的凋亡陽性率均顯著高于模型對照組和DOX組（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠腫瘤組織病理改變情況（HE染色）及腫瘤組織壞死面積百分比

圖4 各組小鼠腫瘤組織中細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色）及細(xì)胞凋亡陽性率

3.5 GA聯(lián)合DOX對小鼠腫瘤組織中CD31表達(dá)水平的影響

與模型對照組比較，各藥物組小鼠腫瘤組織中CD31的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）；與DOX組比較，GA+DOX組CD31的表達(dá)水平雖有降低趨勢，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖5。

圖5 GA聯(lián)合DOX對小鼠腫瘤組織中CD31表達(dá)水平的影響

3.6 GA聯(lián)合DOX對小鼠心臟病理改變及心肌纖維化情況的影響

與模型對照組比較，DOX組小鼠的心臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與DOX比較，GA組和GA+DOX組小鼠的心臟指數(shù)均有增加的趨勢，但組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。此外，與模型對照組比較，DOX組和GA+DOX組小鼠血清BNP、NT-pro BNP水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與DOX組比較，GA+DOX組小鼠血清BNP、NT-pro BNP水平雖有降低的趨勢，但組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 GA聯(lián)合DOX對小鼠心臟指數(shù)和血清BNP、NT-pro BNP水平的影響（±s，n＝6）

表2 GA聯(lián)合DOX對小鼠心臟指數(shù)和血清BNP、NT-pro BNP水平的影響（±s，n＝6）

a：與模型對照組比較，P＜0.05；b：與模型對照組比較，P＜0.01

組別模型對照組DOX組GA組GA+DOX組NT-pro BNP/（ng/L）1 229.29±70.21 1 437.36±33.85b 1 260.24±71.57 1 397.14±59.80b心臟指數(shù)/（mg/g）3.98±0.22 3.59±0.19a 4.39±0.36 3.79±0.19 BNP/（ng/L）93.46±5.97 110.03±9.67b 93.88±6.81 100.73±2.71a

小鼠心臟病理學(xué)觀察結(jié)果見圖6A。由圖6A可見，模型對照組和GA組小鼠心肌纖維束排列整齊，橫紋清晰，胞漿均勻，無空泡化，未見明顯組織病變；DOX組小鼠心肌纖維排列紊亂，橫紋消失，胞漿不均勻，可見節(jié)段性凝聚及溶解，空泡化嚴(yán)重；GA+DOX組小鼠心肌排列尚整齊，橫紋尚清晰，心肌肌纖維斷裂、胞漿空泡化及溶解情況均較DOX組明顯減輕。這表明GA不會引起心臟組織病變，且可改善DOX所致的心臟組織病變。

小鼠心肌纖維化情況觀察結(jié)果見圖6B。由圖6B可見，模型對照組與GA組小鼠心肌纖維排列規(guī)則，纖維化染色（紅染）不明顯；DOX組小鼠心肌纖維排列紊亂，纖維化（紅染）嚴(yán)重；GA+DOX組小鼠心肌排列較規(guī)則，纖維化程度較DOX組明顯減輕。這表明GA不會引起心肌纖維化，且可改善DOX所致的心肌纖維化。

圖6 GA聯(lián)合DOX對小鼠心臟組織病理改變及心肌纖維化情況影響的顯微圖

4 討論

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康及生命的疾病之一，2020年全球新增惡性腫瘤及死亡病例分別達(dá)到了1 930萬例和1 000萬例[16]?，F(xiàn)有化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會對正常細(xì)胞造成損傷，引發(fā)包括免疫抑制、神經(jīng)/心臟毒性、骨髓抑制在內(nèi)的諸多不良反應(yīng)，這些嚴(yán)重的不良反應(yīng)不僅會影響化療效果，而且會導(dǎo)致患者生存質(zhì)量下降[17]。隨著中藥研究的不斷深入，越來越多的研究表明部分中藥成分具有抗腫瘤活性，與化療藥物聯(lián)用不僅可增強(qiáng)化療藥物的療效，還可降低后者的毒性和細(xì)胞耐藥的發(fā)生率[18]。有文獻(xiàn)報道，GA中的槲皮素、山柰酚、異鼠李素可通過阻滯細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種途徑來發(fā)揮抗腫瘤作用[10-11，19]；此外，槲皮素還可通過抑制血管生成等途徑來發(fā)揮抗腫瘤作用[19]?；诖耍狙芯砍醪教接懥薌A與DOX聯(lián)合干預(yù)H22荷瘤小鼠的效果。

有研究指出，黃酮類化合物槲皮素、山柰酚、異鼠李素具有水溶性差、易被氧化、口服生物利用度低、體內(nèi)半衰期短等缺點[20]?；谏鲜鲈?，大多動物實驗中這3個成分的給藥劑量較大，為50～200 mg/kg。本研究曾在預(yù)實驗中考察了30、60、100 mg/kg GA的抗腫瘤效果，結(jié)果顯示，其藥效隨著劑量的增加而增強(qiáng)。隨著納米粒、聚合物膠束、自微乳、前體脂質(zhì)體等一系列藥物新劑型及制劑新技術(shù)的出現(xiàn)，中藥的開發(fā)與利用得以更進(jìn)一步[21]。由于本課題組后期考慮采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米囊技術(shù)解決GA成藥性差這一問題，以提高其口服生物利用度、延長其體內(nèi)生物半衰期、放大其藥理學(xué)效應(yīng)，故本研究采用了具有藥效學(xué)活性的較低劑量（30 mg/kg）。結(jié)果顯示，GA組、DOX組和GA+DOX組小鼠體內(nèi)腫瘤組織的生長均受到了不同程度的抑制，提示GA單用和與DOX聯(lián)用均表現(xiàn)出一定的抑瘤活性；同時，當(dāng)GA與DOX聯(lián)用時，Q為1.21，提示兩者聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤作用[15]。

癌癥標(biāo)志物AFP是一種糖蛋白分子，是目前臨床診斷肝癌的常用血清腫瘤標(biāo)志物，可用于原發(fā)性肝癌的診斷及療效評價[22]。細(xì)胞凋亡在腫瘤的形成與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，細(xì)胞凋亡失衡不僅是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的原因，也是腫瘤細(xì)胞對治療藥物耐藥的原因[23]。CD31是機(jī)體血管生成的重要標(biāo)志物[24]。肝癌是一種血管依賴性惡性腫瘤，其生長和轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示，各藥物組小鼠血清AFP水平和腫瘤組織中CD31的表達(dá)水平均較模型對照組顯著降低，且GA+DOX組上述指標(biāo)均有低于DOX組的趨勢；同時，各藥物組小鼠的腫瘤組織壞死面積百分比和細(xì)胞凋亡陽性率均顯著高于模型對照組，且GA+DOX組的細(xì)胞凋亡陽性率顯著高于DOX組。這提示GA與DOX聯(lián)用可能通過抑制腫瘤血管因子CD31的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮協(xié)同抗肝癌的作用。

心臟毒性（如心力衰竭）是DOX常見的不良反應(yīng)之一[4-5]。當(dāng)心臟功能受損時，心臟指數(shù)會有所降低[9]。BNP和NT-pro BNP由BNP前體經(jīng)裂解產(chǎn)生，當(dāng)心臟功能受損時，兩者的血清水平將有所升高[26]。心肌纖維化是心血管疾病發(fā)展到一定階段的結(jié)果，是以正常心肌組織中細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過度堆積為主要表現(xiàn)的疾病，是心力衰竭的重要病理因素[27]。本研究結(jié)果表明，給予DOX后，H22荷瘤小鼠的心臟指數(shù)顯著降低，血清BNP、NT-pro BNP水平均顯著升高，心臟組織病變及心肌纖維化程度嚴(yán)重；而GA與DOX的聯(lián)用對上述指標(biāo)均有改善趨勢。

綜上所述，GA是一種有效的抗腫瘤天然提取物，具有一定的抑瘤作用，且與DOX聯(lián)合具有協(xié)同作用，可增加DOX的促細(xì)胞凋亡作用，并有助于減輕后者的心臟毒性。