鄭 琪，王曉雅，劉 杰，彭 成，熊 亮，朱雅寧，周勤梅，3#[.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/省部共建西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 637；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，成都 637；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，成都 637；.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川雅安 625000]

研究表明，心血管疾病與炎癥密切相關(guān)，動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭和心肌病等的發(fā)病過程都有炎癥因子的參與[1]。參附注射液是臨床上常用的中成藥，常用于血管性疾病的治療，如心力衰竭、心律失常、休克、缺血再灌注損傷、心肌梗死、腦梗死、血管性癡呆、缺血缺氧性腦病、血栓閉塞性脈管炎、下肢深靜脈血栓等[2]。目前關(guān)于參附注射液的化學(xué)成分研究主要集中于對參附注射液中的化學(xué)成分進(jìn)行分析及鑒定[3-5]，或?qū)ζ渲兄饕煞秩藚⒃碥者M(jìn)行含量測定[6-8]。為進(jìn)一步明確參附注射液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組對參附注射液開展了系統(tǒng)研究，采用大孔吸附樹脂、中壓液相色譜、制備薄層色譜和反相半制備高效液相色譜等方法進(jìn)行分離純化，從參附注射液中分離鑒定出12個化合物，并對其中的炔醇類化合物進(jìn)行了抗炎活性研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Bruker-600型核磁共振（NMR）波譜儀、離子淌度質(zhì)譜儀（德國Bruker公司），Synapt G2 HDMS型高分辨質(zhì)譜儀（美國Waters公司），LTQ-XL型線性離子阱質(zhì)譜儀、SeriesⅡWater Jacketed型CO2孵箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），1220型半制備型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Power-Pac Basic型基礎(chǔ)電泳儀（美國Bio-rad公司），Tanon 5200型顯影儀（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

參附注射液提取物（批號18100361002）購自華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司。柱層析硅膠（批號2202173，規(guī)格200～300目）購自青島海浪硅膠干燥劑廠；脂多糖（批號0000114327）購自美國Sigma公司；一氧化氮試劑盒（批號070821220411）購自南京建成生物工程研究所；DMEM培養(yǎng)基（批號8122126）購自美國Gibco公司；超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（批號4AE242220FGE）購自北京四正柏生物科技有限公司；兔源β-actin抗體（批號GTX19639）購自美國GeneTex公司；兔源環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抗體（批號AF1924）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）（批號219761108）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

以參附注射液提取物（260 g）為原料，經(jīng)D101大孔吸附樹脂上樣吸附，依次用純水和10%、30%、50%、70%、90%乙醇洗脫，得到不同乙醇洗脫部位（A～F）。D部位（12.6 g）經(jīng)中壓液相色譜分離，用甲醇-水（甲醇30%→80%）進(jìn)行梯度洗脫，得到5個餾分（D1～D5），其中D2有粉末析出；采用反相半制備液相色譜對該粉末進(jìn)行分離，用乙腈-水（乙腈30%→70%）進(jìn)行梯度洗脫，制備得到化合物1（8.5 mg）、化合物2（12.2 mg）和化合物3（11.0 mg）。E部位（18.0 g）經(jīng)中壓液相色譜分離，用甲醇-水（甲醇50%→100%）進(jìn)行梯度洗脫，通過薄層色譜檢視，合并相似流分，減壓濃縮，最后得到12個流分（E1～E12）。取E3（58.0 mg）經(jīng)反相半制備液相色譜，以乙腈-水（20∶80，V/V）為流動相分離得到化合物7（1.2 mg）。取E4（251.0 mg）經(jīng)反相制備液相色譜，以甲醇-水（70∶30，V/V）為流動相分離得到化合物9（1.2 mg）。取E7（428.0 mg）經(jīng)反相制備液相色譜，以甲醇-水（87∶13，V/V）為流動相分離得到6個流分（E7-1～E7-6）。其中E7-2經(jīng)反相制備液相色譜，以乙腈-水（80∶20，V/V）為流動相分離得到5個流分（E7-2-1～E7-2-5）；E7-2-2和E7-2-5進(jìn)一步通過反相半制備液相色譜，分別以乙腈-水（70∶30，V/V）和乙腈-水（68∶32，V/V）為流動相分離得到化合物11（1.4 mg）和化合物12（2.2 mg）。E7-6通過反相半制備液相色譜，以乙腈-水（72∶28，V/V）為流動相制備得到化合物10（2.1 mg）。E11（162.0 mg）經(jīng)反相制備液相色譜，以甲醇-水（90∶10，V/V）為流動相分離得到3個流分（E11-1～E11-3）；E11-1進(jìn)一步通過反相半制備液相色譜，以乙腈-水（70∶30，V/V）為流動相分離得到化合物4（1.1 mg）；E11-3經(jīng)反相半制備液相色譜，以乙腈-水（72∶28，V/V）為流動相不斷純化得到化合物5（2.5 mg）和化合物6（2.3 mg）。E12（47.0 mg）經(jīng)制備薄層色譜和反相半制備液相色譜，分別以二氯甲烷-甲醇（5∶1，V/V）和甲醇-水（90∶10，V/V）為流動相分離得到化合物 8（3.4 mg）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末。高分辨電噴霧離子化質(zhì)譜（HR-ESI-MS）顯示質(zhì)荷比（m/z）為823.481 7[M+Na]+（計算值823.482 0，C42H72NaO14），推測化合物的分子式為C42H72O14。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）顯示8個甲基質(zhì)子信號：δH2.10（3H，s，H3-28），1.64（3H，s，H3-21），1.61（3H，s，H3-26或H3-27），1.62（3H，s，H3-26或H3-27），1.60（3H，s，H3-29），1.18（3H，s，H3-18），1.06（3H，s，H3-19），0.83（3H，s，H3-30）；2個糖端基質(zhì)子信號：δH5.20（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1″），5.06（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1′）；1個烯氫信號：δH5.26（1H，t，J＝7.2 Hz，H-24）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中δC：39.8（C-1），28.3（C-2），79.0（C-3），40.7（C-4），61.7（C-5），80.1（C-6），45.5（C-7），41.5（C-8），50.4（C-9），40.0（C-10），31.3（C-11），70.5（C-12），49.5（C-13），51.7（C-14），31.0（C-15），27.0（C-16），51.8（C-17），18.1（C-18），17.9（C-19），83.6（C-20），22.6（C-21），36.5（C-22），23.5（C-23），126.3（C-24），131.3（C-25），26.1（C-26），18.1（C-27），32.1（C-28），16.7（C-29），17.5（C-30），6-Glc-C-1′～6-Glc-C-6′（106.3，75.8，80.5，72.2，78.6，63.4），20-Glc-C-1″～20-Glc-C-6″（98.6，75.5，79.8，72.0，78.7，63.3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道的人參皂苷Rg1一致。

化合物2：白色粉末。HR-ESI-MS顯示m/z為969.538 1[M+Na]+（計算值969.539 9，C48H82NaO18），推測化合物的分子式為C48H82O18。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）顯示8個甲基質(zhì)子信號：δH2.15（3H，s，H3-28），1.62（3H，s，H3-21），1.61（3H，s，H3-26），1.61（3H，s，H3-27），1.39（3H，s，H3-29），1.20（3H，s，H3-18），0.99（3H，s，H3-19），0.98（3H，s，H3-30）；3個糖端基質(zhì)子信號：δH6.54（1H，br s，H-1″），5.30（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1′），5.20（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1″′）；1個Rha的甲基質(zhì)子信號：δH1.80（3H，d，J＝6.6 Hz，H3-6″）；1個烯氫信號：δH5.26（1H，t，J＝6.6 Hz，H-24）；1個苷元部分特征質(zhì)子信號：δH1.42（1H，d，J＝10.8 Hz，H-5α）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中δC：39.4（C-1），27.8（C-2），78.7（C-3），40.4（C-4），61.2（C-5），78.3（C-6），46.3（C-7），41.6（C-8），49.9（C-9），40.0（C-10），31.3（C-11），70.5（C-12），49.5（C-13），51.8（C-14），31.1（C-15），27.0（C-16），52.0（C-17），17.9（C-18），18.0（C-19），83.6（C-20），22.6（C-21），36.4（C-22），23.6（C-23），126.4（C-24），131.2（C-25），26.1（C-26），18.1（C-27），32.6（C-28），17.7（C-29），17.6（C-30），6-Glc-C-1′～6-Glc-C-6′（102.2，79.8，78.7，72.7，78.9，63.4），2′-Rha-C-1″～2′-Rha-C-6″（102.3，72.8，72.9，74.6，69.9，19.1），20-Glc-C-1″′～20-Glc-C-6″′（98.6，75.5，79.7，72.0，78.7，63.3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道的人參皂苷Re一致。

化合物3：白色粉末。HR-ESI-MS顯示m/z為1 131.591 2[M+Na]+（計算值 1 131.592 7，C54H92NaO23），推測化合物的分子式為C54H92O23。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）顯示8個甲基質(zhì)子信號：δH1.67（3H，s，H3-26或H3-27），1.68（3H，s，H3-26或H3-27），1.61（3H，s，H3-21），1.30（3H，s，H3-28），1.12（3H，s，H3-29），0.97（3H，s，H3-18或 H3-30），0.98（3H，s，H3-18 或 H3-30），0.83（3H，s，H3-19）；4個糖端基質(zhì)子信號：δH5.40（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1″），5.16（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1″′），5.13（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1″），4.95（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1′）；1個烯氫信號：δH5.32（1H，t，J＝7.2 Hz，H-24）；1個苷元部分特征質(zhì)子信號：δH0.67（1H，d，J＝12.0 Hz，H-5α）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中 δC：39.5（C-1），27.1（C-2），89.3（C-3），40.4（C-4），56.7（C-5），18.8（C-6），35.5（C-7），40.0（C-8），50.6（C-9），37.2（C-10），31.2（C-11），70.6（C-12），49.9（C-13），51.9（C-14），31.0（C-15），27.0（C-16），51.7（C-17），16.6（C-18），16.4（C-19），83.8（C-20），22.7（C-21），36.5（C-22），23.6（C-23），126.3（C-24），131.4（C-25），26.2（C-26），18.3（C-27），28.5（C-28），17.0（C-29），17.8（C-30），3-Glc-C-1′～3-Glc-C-6′（105.8，83.9，78.3，72.0，78.5，63.0），2′-Glc-C-1″～2′-Glc-C-6″（106.5，77.6，78.7，72.0，78.7，63.2），20-Glc-C-1″′～20-Glc-C-6″′（98.5，75.2，78.8，71.9，77.5，70.5），6″′-Glc-C-1″″～6″′-Glc-C-6″（105.6，75.6，78.8，71.9，79.6，63.4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道的人參皂苷Rb1一致。

化合物4：白色無定形粉末。HR-ESI-MS顯示m/z為789.475 4[M+Na]+（計算值789.476 5，C42H70NaO12），推測化合物的分子式為C42H70O12。1H-NMR（600 MHz，C5D5N）顯示7個甲基質(zhì)子信號：δH1.68（3H，s，H3-28），1.62（3H，s，H3-26），1.33（3H，s，H3-27），1.13（3H，s，H3-18），1.04（3H，s，H3-29），0.98（3H，s，H3-19），0.84（3H，s，H3-30）；2個糖端基質(zhì)子信號：δH5.41（1H，d，J＝7.8 Hz，2′-Glc-H-1″），4.96（1H，overlapped，3-Glc-H-1′）；3個烯氫信號：δH5.31（1H，t，J＝7.2 Hz，H-24），5.17（1H，br s，H-21b），4.93（1H，br s，H-21a）；1個連氧次甲基信號：δH3.96（1H，m，H-12）；2個苷元部分特征質(zhì)子信號：δH3.31（1H，dd，J＝13.2、5.4 Hz，H-3），0.70（1H，br d，J＝11.4 Hz，H-5）。13C-NMR（150 MHz，C5D5N）中δC：39.7（C-1），26.2（C-2），89.4（C-3），40.2（C-4），56.9（C-5），18.9（C-6），35.8（C-7），40.6（C-8），48.8（C-9），37.5（C-10），32.5（C-11），72.1（C-12），53.0（C-13），51.7（C-14），31.2（C-15），27.5（C-16），51.3（C-17），17.1（C-18），17.4（C-19），156.0（C-20），108.6（C-21），34.3（C-22），27.2（C-23），125.8（C-24），131.7（C-25），26.2（C-26），18.2（C-27），28.6（C-28），16.3（C-29），17.0（C-30），3-Glc-C-1′～3-Glc-C-6′（105.6，84.0，78.8，72.1，78.4，63.2），2′-Glc-C-1″～2′-Glc-C-6″（106.6，77.7，78.8，72.9，78.6，63.3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報道的人參皂苷Rk1一致。

化合物5：白色無定形粉末。HR-ESI-MS顯示m/z為661.427 9[M+Na]+（計算值661.429 2，C36H62NaO9），推測化合物的分子式為 C36H62O9。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）顯示8個甲基質(zhì)子信號：δH2.12（3H，s，H3-28），1.71（3H，s，H3-26），1.66（3H，s，H3-27），1.65（3H，s，H3-29），1.42（3H，s，H3-21），1.27（3H，s，H3-18），1.09（3H，s，H3-19），0.89（3H，s，H3-30）；7個糖端基質(zhì)子信號：5.09（1H，d，J＝7.8 Hz，6-Glc-H-1′），4.57（1H，br d，J＝11.4 Hz，6-Glc-H-6′a），4.41（1H，dd，J＝11.4、5.4 Hz，6-Glc-H-6′b），4.27（1H，m，6-Glc-H-3′），4.14（1H，t，J＝7.8 Hz，6-Glc-H-4′），4.00（1H，m，6-Glc-H-2′），3.95（1H，m，6-Glc-H-5′）；1個烯氫信號：δH5.32（1H，m，H-24）；2個苷元部分特征質(zhì)子信號：δH1.48（1H，d，J＝10.2 Hz，H-5），1.16（1H，t，J＝10.2 Hz，H-15b）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中 δC：39.9（C-1），28.4（C-2），79.0（C-3），40.9（C-4），61.9（C-5），80.5（C-6），45.7（C-7），41.6（C-8），50.7（C-9），40.1（C-10），32.7（C-11），71.4（C-12），49.4（C-13），52.2（C-14），31.8（C-15），27.1（C-16），51.1（C-17），17.9（C-18），18.2（C-19），73.5（C-20），23.2（C-21），43.7（C-22），23.1（C-23），126.5（C-24），131.2（C-25），26.3（C-26），18.2（C-27），32.2（C-28），16.9（C-29），17.5（C-30），6-Glc-C-1′～6-Glc-C-6′（106.5，76.0，80.2，72.3，78.7，63.6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道的20（R）-人參皂苷Rh1一致。

化合物6：白色無定形粉末。HR-ESI-MS顯示m/z為807.485 7[M+Na]+（計算值807.487 1，C42H72NaO13），推測化合物的分子式為C42H72O13。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）顯示8個甲基質(zhì)子信號：δH1.67（3H，s，H3-26），1.64（3H，s，H3-27），1.44（3H，s，H3-21），1.33（3H，br s，H3-28），1.13（3H，s，H3-29），0.98（3H，s，H3-30），0.97（3H，s，H3-18），0.82（3H，s，H3-19）；2個糖端基質(zhì)子信號：δH5.40（1H，d，J＝7.2 Hz，2-Glc-H-1″），4.58（1H，d，J＝10.2 Hz，1-Glc-H-1′）；1個烯氫信號：δH5.33（1H，m，H-24）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中δC：39.6（C-1），27.2（C-2），89.4（C-3），40.2（C-4），56.8（C-5），18.9（C-6），35.6（C-7），40.5（C-8），50.8（C-9），37.4（C-10），32.5（C-11），71.5（C-12），49.1（C-13），52.2（C-14），31.8（C-15），27.3（C-16），55.3（C-17），16.3（C-18），16.8（C-19），73.4（C-20），27.6（C-21），36.4（C-22），23.5（C-23），126.8（C-24），131.2（C-25），26.3（C-26），17.5（C-27），28.6（C-28），17.1（C-29），18.1（C-30），3-Glc-C-1′～3-Glc-C-6′（105.6，84.0，78.8，72.1，78.8，63.3），2′-Glc-C-1″～2′-Glc-C-6″（106.6，77.7，78.6，72.1，78.4，63.2）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道的20（S）-人參皂苷Rg3一致。

化合物7：白色無定形粉末。電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）顯示 m/z為955.52[M+Na]+，綜合其1D-NMR數(shù)據(jù)分析，推測其分子式為C47H80O18。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）顯示8個甲基質(zhì)子信號：δH2.09（3H，s，H3-28），1.61（3H，s，H3-21），1.61（6H，s，H3-26 和 H3-27），1.49（3H，s，H3-29），1.15（3H，s，H3-18），0.98（3H，s，H3-19），0.81（3H，s，H3-30）；3個糖端基質(zhì)子信號：δH5.20（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1″），4.95（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1′），4.95（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1″′）；1個烯氫信號：δH5.55（1H，br s，H-24）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中δC：39.9（C-1），28.3（C-2），79.3（C-3），40.1（C-4），61.8（C-5），80.0（C-6），45.4（C-7），41.6（C-8），79.8（C-9），40.7（C-10），31.1（C-11），70.6（C-12），49.7（C-13），51.9（C-14），31.4（C-15），27.1（C-16），51.9（C-17），18.0（C-18），17.6（C-19），83.7（C-20），22.8（C-21），36.6（C-22），23.6（C-23），126.5（C-24），131.4（C-25），26.2（C-26），18.2（C-27），32.2（C-28），18.0（C-29），17.2（C-30），6-Glc-C-1′～6-Glc-C-6′（104.0，80.6，79.3，72.2，80.4，63.4），2?-Xyl-C-1″～2′-Xyl-C-5″（105.3，76.3，78.5，71.8，67.8），20-Glc-C-1′～20-Glc-C-6′（98.7，75.6，78.8，72.2，79.3，63.4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道的三七皂苷R1一致。

化合物8：白色無定形粉末。ESI-MS顯示m/z為477.33[M+H]+，綜合其1D-NMR數(shù)據(jù)分析，推測其分子式為C30H52O4。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）顯示8個甲基質(zhì)子信號：δH1.31（3H，s，H3-28），1.26（3H，s，H3-27），1.22（3H，s，H3-26），1.18（3H，s，H3-21），1.06（3H，s，H3-18），0.98（3H，s，H3-29），0.93（3H，s，H3-19），0.91（3H，s，H3-30）；3個連氧次甲基信號：δH4.11（1H，m，H-6），3.53（1H，m，H-12），3.18（1H，dd，J＝11.4、4.2 Hz，H-3）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）中δC：38.8（C-1），27.2（C-2），78.7（C-3），39.3（C-4），61.3（C-5），68.9（C-6），47.2（C-7），41.1（C-8），49.5（C-9），39.4（C-10），31.0（C-11），69.9（C-12），48.9（C-13），51.1（C-14），31.2（C-15），25.3（C-16），54.8（C-17），17.3（C-18），17.3（C-19），76.8（C-20），19.5（C-21），35.8（C-22），16.4（C-23），36.5（C-24），73.3（C-25），33.1（C-26），27.2（C-27），30.5（C-28），15.6（C-29），17.2（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道的人參三醇一致。

化合物9：無色油狀物。HR-ESI-MS顯示m/z為301.177 2[M+Na]+（計算值301.178 0，C17H26NaO3），推測化 合 物 的 分 子 式 為 C17H26O3。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）顯示3個烯氫質(zhì)子信號：δH5.94（1H，ddd，J＝16.8、10.2、5.4 Hz，H-2），5.46（1H，dt，J＝16.8、1.2 Hz，H-1a），5.24（1H，dt，J＝10.2、1.2 Hz，H-1b）；3個連氧次甲基信號：δH4.92（1H，br d，J＝5.4 Hz，H-3），3.65（1H，m，H-9），3.59（1H，m，H-10）；2個亞甲基信號：δH1.50（2H，m，H2-11），2.58（2H，t，J＝6.0 Hz，H2-8）；1組脂肪族鏈信號：δH1.29（10H，m，H-12～H-16）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）中 δC：117.2（C-1），136.3（C-2），63.5（C-3），75.0（C-4），71.0（C-5），66.6（C-6），78.3（C-7），25.7（C-8），72.3（C-9），73.2（C-10），33.7（C-11），25.1（C-12），29.7（C-13），29.4（C-14），31.9（C-15），22.8（C-16），14.2（C-17）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道的（3R，9R，10R）-人參炔三醇一致。

化合物10：無色油狀物，HR-ESI-MS顯示m/z為283.164 1[M+Na]+（計算值283.167 4，C17H24NaO2），推測化 合 物 的 分 子 式 為 C17H24O2。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）顯示3個烯氫質(zhì)子信號：δH5.95（1H，ddd，J＝16.8、10.2、5.4 Hz，H-2），5.47（1H，br d，J＝16.8 Hz，H-1a），5.26（1H，br d，J＝10.2 Hz，H-1b）；3個連氧次甲基信號：δH4.93（1H，d，J＝5.4 Hz，H-3），3.14（1H，ddd，J＝9.6、5.4、4.2 Hz，H-9），2.96（1H，m，H-10）；2個連炔鍵的亞甲基信號：δH2.70（1H，dd，J＝18.0、6.0 Hz，H-8a），2.39（1H，dd，J＝18.0、7.2 Hz，H-8b）；1個末端甲基信號：δH0.88（3H，t，J＝7.2 Hz，H3-17）；2組脂肪族鏈信號：δH1.50（4H，m，H-11～H-12），1.32（8H，m，H-13～H-16）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）中 δC：117.3（C-1），136.1（C-2），63.6（C-3），75.0（C-4），70.9（C-5），66.4（C-6），76.8（C-7），19.6（C-8），54.4（C-9），57.1（C-10），27.6（C-11），26.6（C-12），29.5（C-13），29.3（C-14），31.8（C-15），22.7（C-16），14.2（C-17）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道的人參環(huán)氧炔醇一致。

化合物11：白色無定形粉末，HR-ESI-MS顯示m/z為283.165 1[M+Na]+（計算值283.167 4，C17H24NaO2），推測化合物的分子式為 C17H24O2。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）顯示5個烯氫質(zhì)子信號：δH6.34（1H，dd，J＝15.6、5.4 Hz，H-9），5.96（1H，ddd，J＝17.4、10.2、5.4 Hz，H-2），5.77（1H，d，J＝15.6 Hz，H-8），5.48（1H，br d，J＝17.0 Hz，H-1b），5.27（1H，br d，J＝10.2 Hz，H-1a）；2個連氧次甲基信號：δH4.98（1H，d，J＝5.4 Hz，H-3），4.20（1H，m，H-10）；1個末端甲基信號：δH0.88（3H，t，J＝7.2 Hz，H3-17）；1組脂肪族鏈信號：δH1.28～1.64（12H，m，H-11～H-16）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）中δC：117.4（C-1），136.0（C-2），63.8（C-3），80.5（C-4），73.6（C-5），71.0（C-6），77.6（C-7），108.1（C-8），150.1（C-9），72.1（C-10），37.0（C-11），25.3（C-12），29.3（C-13），29.5（C-14），22.7（C-15），31.9（C-16），14.2（C-17）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道的heptadeca-1，8-dien-4，6-diyne-3，10-diol一致。

化合物12：無色油狀物。ESI-MS顯示m/z為245.24[M+H]+，綜合其1D-NMR數(shù)據(jù)分析，推測其分子式為C17H24O。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）顯示5個烯氫質(zhì)子信號：δH5.94（1H，ddd，J＝17.4、10.2、5.4 Hz，H-2），5.51（1H，m，H-10），5.47（1H，d，J＝17.4 Hz，H-1a），5.37（1H，m，H-9），5.24（1H，d，J＝10.2 Hz，H-1b）；1個連氧次甲基信號：δH4.91（1H，d，J＝4.8 Hz，H-3）；1個與雙鍵相連的亞甲基信號：3.03（2H，d，J＝7.2 Hz，H2-8）；1個末端甲基信號：δH0.88（3H，t，J＝6.6 Hz，H3-17）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）中δC：117.1（C-1），136.2（C-2），63.7（C-3），74.3（C-4），71.4（C-5），64.1（C-6），80.4（C-7），17.8（C-8），122.0（C-9），133.2（C-10），27.3（C-11），29.3（C-12），29.3（C-13），29.3（C-14），31.9（C-15），22.8（C-16），14.2（C-17）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道的人參炔醇一致。

2.3 炔醇類成分的抗炎活性研究

2.3.1 統(tǒng)計分析方法 實驗結(jié)果以SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

2.3.2 細(xì)胞活力測定 用CCK-8法進(jìn)行檢測。為防止藥物因具有細(xì)胞毒作用導(dǎo)致細(xì)胞死亡而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，對藥物是否具有殺死RAW264.7細(xì)胞的作用進(jìn)行考察。將RAW264.7細(xì)胞置于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/孔，設(shè)置空白組和給藥組。在37 ℃、5%CO2條件下（后同）培養(yǎng)24 h，棄上清液，給藥組加入用無血清DMEM培養(yǎng)基配制的含炔醇類化合物（化合物9～12）的藥液，濃度分別為1.56、3.13、6.25、12.5、25.0、50.0 μmol/L，空白組加入無血清DMEM培養(yǎng)基，每孔100 μL，每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)1 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔的光密度（optical density，OD）。細(xì)胞存活率（%）＝給藥組平均OD值/空白組平均OD值×100%。結(jié)果顯示，4個炔醇類化合物均對RAW264.7細(xì)胞無細(xì)胞毒作用。

2.3.3 NO含量測定 用Griess法進(jìn)行檢測。將RAW 264.7細(xì)胞置于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/孔，設(shè)置空白組、模型組和給藥組，給藥和造模同時進(jìn)行（給藥劑量和造模劑量依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置）。培養(yǎng)24 h后棄上清液，空白組加入無血清DMEM培養(yǎng)基，模型組加入含脂多糖（1 μg/mL）的無血清DMEM培養(yǎng)基，給藥組加入用無血清DMEM培養(yǎng)基配制的含不同濃度的炔醇類化合物（3.13、6.25、12.5、25.0、50.0 μmol/L）和脂多糖（1 μg/mL），每孔100 μL，每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后取細(xì)胞上清液在540 nm波長處測定OD值從而計算NO的含量。除化合物10以外，其他3種炔醇類化合物對NO含量均無降低作用。與模型組相比，化合物10在給藥濃度為12.5、25.0、50.0 μmol/L時，可顯著逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液中NO含量的升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 化合物10對RAW 264.7細(xì)胞上清液中NO含量的影響（±s，μmol/L，n＝3）

表1 化合物10對RAW 264.7細(xì)胞上清液中NO含量的影響（±s，μmol/L，n＝3）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01

組別（給藥濃度）空白組模型組給藥組（3.13 μmol/L）給藥組（6.25 μmol/L）NO含量1.93±0.65 27.49±1.89a 23.53±2.75 23.58±4.07組別（給藥濃度）給藥組（12.5 μmol/L）給藥組（25.0 μmol/L）給藥組（50.0 μmol/L）NO含量19.73±2.76b 15.71±4.88b 7.21±1.71c

2.3.4 COX-2蛋白表達(dá)測定 采用Western blot法進(jìn)行測定。將RAW 264.7細(xì)胞接種于6孔板中，設(shè)置空白組、模型組和給藥組，給藥和造模同時進(jìn)行（給藥劑量和造模劑量依據(jù)“2.3.3”項下結(jié)果設(shè)置）。培養(yǎng)24 h后，空白組加入不含藥的DMEM培養(yǎng)基，模型組加入脂多糖（1 μg/mL），給藥組加入不同濃度的化合物 10（12.5、25.0、50.0 μmol/L）和脂多糖（1 μg/mL），每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，于冰盒上將上清液吸出，用PBS清洗細(xì)胞，加入RIPA裂解液處理30 min，以12 000 r/min離心15 min后檢測蛋白濃度。將蛋白高溫變性后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，取出，用5%脫脂牛奶封閉2 h，在4℃環(huán)境下與β-actin抗體（稀釋比例為1∶3 000）、COX-2抗體（稀釋比例為1∶5 000）共同孵育過夜；用TBST洗滌3次后將聚偏二氟乙烯膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（稀釋比例為1∶5 000）在37℃孵育2 h，再用TBST洗滌3次后用顯影儀檢測相應(yīng)的蛋白條帶。用Image J 1.8.0軟件分析各條帶灰度值，以COX-2蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值作為COX-2蛋白表達(dá)量。結(jié)果見圖1。與空白組比較，模型組COX-2蛋白表達(dá)量升高（P＜0.01）；與模型組比較，化合物10在給藥濃度為50.0 μmol/L時能顯著降低細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)量（P＜0.05）。

圖1 化合物10對RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型中COX-2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

參附注射液根據(jù)古方“參附湯”經(jīng)現(xiàn)代工藝提取制備而成，已連續(xù)3次被遴選為全國中醫(yī)醫(yī)院急診必備中成藥。目前關(guān)于參附注射液的化學(xué)研究以液質(zhì)分析為主，對其中的成分分離研究較少。為深入明確參附注射液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究應(yīng)用大孔吸附樹脂柱色譜、中壓液相色譜、制備薄層色譜、半制備液相色譜、質(zhì)譜、1H-NMR、13C-NMR等手段對參附注射液的化學(xué)成分進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定，共鑒定12個化合物，包括8個人參皂苷類化合物（化合物1～8）、4個人參炔醇類化合物（化合物9～12），其中化合物4、7、10～12均首次在參附注射液中鑒定并報道。本研究豐富了對參附注射液化學(xué)成分的認(rèn)識，首次明確了人參炔醇類化合物是參附注射液中的重要組成。

人參皂苷類化合物是參附注射液的重要有效成分，目前主要以人參總皂苷的含量測定對參附注射液進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究通過系統(tǒng)的化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液中人參皂苷類成分含量高、種類較多，同時也含有豐富的聚炔類成分，但有關(guān)該類成分的研究報道較少，僅Yang等[3]應(yīng)用高效液相-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析得出參附注射液中含有人參炔三醇。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，人參炔醇類成分也具有較好的藥理活性，如人參總?cè)泊紝Ψ伟┘?xì)胞株A549具有抑制作用[17]，人參炔醇對于小鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用、對正常大鼠心臟有負(fù)性肌力作用[18-19]等?？梢姡藚⑷泊碱惓煞质侵匾囊活惢钚晕镔|(zhì)。本研究采用脂多糖復(fù)制RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)化合物10（人參環(huán)氧炔醇）具有明顯的抗炎活性，能顯著降低模型細(xì)胞中升高的NO含量和COX-2蛋白表達(dá)量。綜合文獻(xiàn)報道及本實驗研究，筆者推測人參炔醇類化合物與參附注射液的藥理作用具有一定的相關(guān)性。建議今后學(xué)者在開展參附注射液中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制研究時，不應(yīng)只局限于人參皂苷類成分，也應(yīng)該重視對人參炔醇類成分的開發(fā)研究。