郝曉霞，王 丹，丁元鈞，羅二平，景 達(dá)*

（1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院組織工程實(shí)驗(yàn)室，西安710069；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系，西安710032）

0 引言

我國(guó)幅員遼闊、疆域廣大，地勢(shì)西高東低，呈階梯狀分布，高原地區(qū)占據(jù)了全國(guó)總面積的1/3 左右，具有特殊的政治、社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、軍事條件，但因其自然環(huán)境惡劣，人類對(duì)于高原資源的開(kāi)發(fā)和利用的效率不高。與平原地區(qū)相比，高原地區(qū)的氣候特征主要表現(xiàn)為嚴(yán)寒、晝夜溫差大、空氣干燥、強(qiáng)風(fēng)和強(qiáng)紫外線輻射等，其中最突出的特點(diǎn)是低壓低氧，嚴(yán)重影響人體的呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，損害機(jī)體健康。久居平原的人群初進(jìn)高原地區(qū)時(shí)，會(huì)感到呼吸困難、胸悶、心率加快[1-3]，長(zhǎng)期暴露則會(huì)引發(fā)肺動(dòng)脈高壓、腦水腫等急性損傷疾病[4]。隨著現(xiàn)代化進(jìn)程的加速，人口遷移率逐年增加，除機(jī)體器官遭受到急性損傷外，高原環(huán)境對(duì)于機(jī)體骨骼的慢性損傷也引發(fā)了廣泛討論和關(guān)注。

骨骼作為人體主要的受力器官，在維持機(jī)體運(yùn)動(dòng)、感受外界應(yīng)力、保護(hù)內(nèi)部器官等方面發(fā)揮著重要作用。無(wú)論是人還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明，高原低壓低氧環(huán)境會(huì)對(duì)骨骼狀態(tài)和骨骼健康產(chǎn)生影響，并改變骨的完整性，影響骨重塑過(guò)程。據(jù)王琦等[5]報(bào)道，高原地區(qū)青少年的骨骼發(fā)育晚熟率遠(yuǎn)大于早熟率，骨密度下降，骨脆性增加；一項(xiàng)對(duì)登山愛(ài)好者的研究亦表明，極端海拔暴露會(huì)嚴(yán)重影響骨骼狀況并降低骨密度，且返回正常海拔高度12 個(gè)月后仍未能完全恢復(fù)[6]。目前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究尚未達(dá)成一致的結(jié)論，Durand 等[7]研究發(fā)現(xiàn)每天5 h 的間歇性缺氧處理對(duì)骨組織有促進(jìn)作用，可以加速骨愈合。但更多的證據(jù)表明[8-9]，間歇性暴露于低氧環(huán)境與持續(xù)暴露于模擬的高海拔環(huán)境所引起的生理效應(yīng)是不同的，持續(xù)性暴露于低壓低氧環(huán)境會(huì)顯著抑制骨量、破壞骨組織結(jié)構(gòu)，并影響骨骼力學(xué)強(qiáng)度。Brent 等[10]的研究表明，低壓低氧對(duì)股骨皮質(zhì)骨和腰椎骨小梁影響較大，對(duì)股骨骨小梁影響較小，可降低股骨骨干中部和腰椎的骨強(qiáng)度。由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用低壓氧艙來(lái)模擬高原環(huán)境，為縮短實(shí)驗(yàn)周期，大部分研究常將海拔高度設(shè)置在6 000 m 及以上，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物暴露1～21 d，對(duì)于骨的力學(xué)屬性或結(jié)構(gòu)屬性有破壞作用[11]。但人類不適宜居住在海拔6 000 m 以上的高原地區(qū)，短期受高海拔刺激的動(dòng)物數(shù)據(jù)不能真實(shí)反映我國(guó)高原居住人口的健康狀況，因此人們?nèi)狈?duì)長(zhǎng)期處于低壓低氧環(huán)境下骨量和骨質(zhì)量變化的認(rèn)識(shí)。

本研究通過(guò)建立大鼠低壓低氧損傷模型，模擬人體進(jìn)入高原引起的低壓低氧損傷，通過(guò)比較低壓低氧和常壓常氧2 種環(huán)境下大鼠股骨骨量及其微觀結(jié)構(gòu)的改變，揭示低壓低氧環(huán)境對(duì)于骨骼的影響，豐富高原環(huán)境下骨丟失的認(rèn)識(shí)，為高原型骨疾病的預(yù)防和治療提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為16 只10 周齡的健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量為（300±20）g，由西安科奧科生物科技有限公司提供。大鼠飼養(yǎng)的環(huán)境溫度為（23±1）℃，相對(duì)濕度為50%～60%，在12 h 的光/暗周期的環(huán)境中自由飲水、進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)中SD 大鼠4 只/籠，可以保證自由活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)前，將所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放置在動(dòng)物房2 周以適應(yīng)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)的所有操作均滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理?xiàng)l例。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備和軟件

低壓低氧模擬氧艙（如圖1 所示）：型號(hào)#LATSY01，蘇州聯(lián)特醫(yī)療設(shè)備公司；Micro-CT：型號(hào)skyscan1276，德國(guó)Bruker；Micro-CT 分析軟件：型號(hào)VGStudio 2.2，德國(guó)Volume Graphics。

圖1 低壓低氧模擬氧艙實(shí)物圖

1.3 動(dòng)物模型制作及實(shí)驗(yàn)流程

將16 只10 周齡的雄性SD 大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組和低壓低氧組，每組8 只。低壓低氧組的大鼠在低壓低氧模擬氧艙（正常大氣壓）中提前放置3 d，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)時(shí)低壓低氧模擬氧艙的具體參數(shù)設(shè)置為壓強(qiáng)54 kPa、海拔5 000 m、氧分壓11.316 kPa，上升和下降的速度均接近6 m/s，每天處理22 h，持續(xù)處理6 周；定時(shí)清理鼠籠并更換水和食物，時(shí)常更換低壓低氧模擬氧艙中鼠籠的位置，減少實(shí)驗(yàn)誤差。對(duì)照組大鼠在同一時(shí)間放置在同一個(gè)房間內(nèi)的正常大氣壓下（參考西安地區(qū)海拔，約400 m），不作其他處理。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄大鼠的進(jìn)食、體質(zhì)量。

1.4 股骨形態(tài)檢測(cè)

使用過(guò)量的戊巴比妥鈉處死大鼠后，立即分離大鼠右側(cè)股骨，處理干凈股骨上附著的肌肉和結(jié)締組織后，使用游標(biāo)卡尺對(duì)股骨長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量3 次，取平均值并記錄。

1.5 Micro-CT 檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)注射過(guò)量的戊巴比妥鈉處死各組實(shí)驗(yàn)大鼠，將各組大鼠的右側(cè)股骨在4%的多聚甲醛中固定24 h 后進(jìn)行Micro-CT 掃描，測(cè)定大鼠右側(cè)股骨遠(yuǎn)端干骺端皮質(zhì)骨和骨小梁的微結(jié)構(gòu)。掃描過(guò)程中，樣本隨模具進(jìn)行360°轉(zhuǎn)動(dòng)，X 射線掃描的空間分辨力為10 μm。掃描結(jié)束后，采用軟件進(jìn)行分析，得到樣本的三維模型。選取生長(zhǎng)板以下高度為5 mm、半徑為10 mm 的圓柱區(qū)域作為感興趣區(qū)域進(jìn)行定量分析，通過(guò)灰度分析獲取該區(qū)域的骨組織，計(jì)算骨組織的相關(guān)參數(shù)，包括骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分離度（Tb.Sp）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低壓低氧對(duì)大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量的影響

對(duì)照組和低壓低氧組大鼠的體質(zhì)量和進(jìn)食量比較如圖2 所示，2 組大鼠在實(shí)驗(yàn)前（0 周）體質(zhì)量無(wú)顯著差異（P＞0.05），低壓低氧處理后，低氧低氧組大鼠體質(zhì)量與對(duì)照組相比顯著下降，與文獻(xiàn)[12-13]研究結(jié)果相同。圖2（a）中結(jié)果顯示，對(duì)照組和低壓低氧組大鼠的體質(zhì)量在6 周后都有所增加，低壓低氧處理1 周后2 組大鼠的體質(zhì)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；低壓低氧處理2 周后，低壓低氧組大鼠的體質(zhì)量開(kāi)始顯著小于對(duì)照組。對(duì)照組和低壓低氧組大鼠的進(jìn)食量變化如圖2（b）所示。低壓低氧組大鼠在低壓低氧處理1 周后，進(jìn)食量少于對(duì)照組（P＜0.05）；低壓低氧處理2 周后，大鼠的進(jìn)食量顯著減少，達(dá)到最小值；低壓低氧處理3 周后，大鼠的進(jìn)食量開(kāi)始逐步增加，但始終少于對(duì)照組（P＜0.01）。

圖2 2 組大鼠的體質(zhì)量和進(jìn)食量比較

2.2 低壓低氧對(duì)大鼠股骨長(zhǎng)度的影響

對(duì)照組和低壓低氧組大鼠離體股骨長(zhǎng)度測(cè)量示意和統(tǒng)計(jì)結(jié)果對(duì)比如圖3（a）、（b）所示，低壓低氧組大鼠的股骨長(zhǎng)度顯著小于對(duì)照組（P＜0.01）。

圖3 2 組大鼠的股骨長(zhǎng)度比較

2.3 低壓低氧對(duì)大鼠股骨骨小梁的影響

對(duì)照組和低壓低氧組大鼠股骨骨小梁和皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)如圖4 所示。大鼠股骨骨小梁的Micro-CT 三維重建結(jié)果顯示，低壓低氧組大鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁的微結(jié)構(gòu)顯著受損、骨量明顯降低，骨小梁形態(tài)表現(xiàn)較為疏松、空隙明顯增大；對(duì)照組大鼠骨小梁骨量正常，空隙小且均勻。對(duì)照組和低壓低氧組大鼠股骨Micro-CT 測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，低壓低氧組股骨遠(yuǎn)端干骺端BV/TV 顯著下降（P＜0.01），Tb.N 顯著減少（P＜0.01），Tb.Th 顯著變?。≒＜0.01），這些都造成了低壓低氧組在三維重建后骨小梁的空間排列疏松、空隙變大，低壓低氧組骨小梁比對(duì)照組具有更大的分離度（Tb.Sp）（P＜0.01）。

表1 2 組大鼠股骨Micro-CT 測(cè)量結(jié)果

圖4 2 組大鼠股骨骨小梁和皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)比較

3 討論

隨著高原醫(yī)學(xué)的發(fā)展和人類健康的需要，人們不僅僅關(guān)注高海拔環(huán)境對(duì)人體心、腦、肺等器官的急性損傷，對(duì)于高海拔環(huán)境引起的骨損傷和骨質(zhì)疏松等慢性骨疾病也開(kāi)始廣泛關(guān)注[14-15]。在平原地區(qū)和高原地區(qū)的健康普查中發(fā)現(xiàn)海拔高度會(huì)嚴(yán)重影響青少年的骨成熟，增加骨質(zhì)疏松的患病風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)低氧對(duì)骨量和骨組織結(jié)構(gòu)有嚴(yán)重的抑制作用[16-18]。因此，推測(cè)高海拔地區(qū)的低壓低氧可能是通過(guò)破壞骨量和骨組織結(jié)構(gòu)進(jìn)而引起高原性慢性骨疾病。嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，模擬小于2 900 m 的海拔高度沒(méi)有導(dǎo)致任何不利的骨骼影響，相比之下，將動(dòng)物暴露在極高海拔（3 500～6 000 m）環(huán)境下研究發(fā)現(xiàn)，骨密度、皮質(zhì)骨形態(tài)和骨骼強(qiáng)度大幅度下降，骨小梁微結(jié)構(gòu)惡化[13，19-20]。大部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中涉及的海拔條件過(guò)高，實(shí)驗(yàn)周期縮短，造成高原環(huán)境下的急性損傷，對(duì)骨骼的健康狀況影響顯著，比如在海拔為7 500 m 處暴露18 h，骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)含量下降[8]，但這些研究都不能很好地揭示長(zhǎng)期居住在3 000～5 000 m海拔地區(qū)對(duì)人體骨骼健康的影響。

本研究通過(guò)分析暴露于低壓低氧模擬氧艙內(nèi)（模擬海拔約5 000 m 環(huán)境）和正常環(huán)境下（海拔約為400 m 環(huán)境）雄性SD 大鼠的骨量特征，探索高海拔地區(qū)的低壓低氧環(huán)境對(duì)骨組織骨量和骨結(jié)構(gòu)的影響。為排除生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中由于個(gè)體差異而引起的骨形態(tài)和微結(jié)構(gòu)的差異，本研究選擇10 周齡SD 大鼠。結(jié)果表明，低壓低氧處理1 周后，大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化，從低壓低氧處理第2 周開(kāi)始一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，低壓低氧組大鼠的體質(zhì)量始終低于對(duì)照組。低壓低氧處理后，大鼠的體質(zhì)量減輕，一方面可能是由于氧分壓降低使大鼠出現(xiàn)厭食反應(yīng)；另一方面，體質(zhì)量減輕減少了機(jī)體對(duì)氧氣的消耗，使機(jī)體可以盡可能地適應(yīng)低壓低氧環(huán)境。低壓低氧處理4 周后，大鼠的體質(zhì)量開(kāi)始緩慢增加，說(shuō)明機(jī)體在逐步適應(yīng)低壓低氧環(huán)境，恢復(fù)身體的生理功能，這一研究結(jié)果與文獻(xiàn)[12]報(bào)道相同。也有文獻(xiàn)[8，13，20]報(bào)道發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境會(huì)引起生長(zhǎng)早期大鼠股骨形態(tài)的改變，這與本研究結(jié)果一致。本研究在觀察股骨的離體形態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)，低壓低氧環(huán)境使大鼠股骨長(zhǎng)度變短，可能對(duì)于10 周齡的大鼠來(lái)說(shuō)，骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育還未完成縱向的生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了暴露在低壓低氧環(huán)境中會(huì)對(duì)骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利的影響。在微觀結(jié)構(gòu)方面，本研究結(jié)果表明暴露在低壓低氧環(huán)境下，骨小梁的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受損，具體表現(xiàn)為骨小梁的數(shù)量明顯減少、厚度變薄、空間排列疏松、縫隙變大，造成了骨小梁更高的分離度，空間結(jié)構(gòu)被破壞。

本研究表明，低壓低氧對(duì)于大鼠骨質(zhì)量存在一定程度的損傷，但僅觀察了低壓低氧環(huán)境引起的骨量丟失，并未進(jìn)一步深入研究骨形成和骨吸收的過(guò)程，未完全揭露骨質(zhì)量損傷的具體原因及相對(duì)應(yīng)的治療靶點(diǎn)，后續(xù)擬采用脈沖電磁場(chǎng)治療、全身振動(dòng)[21]、藥物因子探索出一種安全有效的策略來(lái)預(yù)防高海拔地區(qū)的人的骨骼功能退化。

綜上所述，暴露于低壓低氧環(huán)境下會(huì)損害機(jī)體的健康，影響骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致骨骼功能障礙。本研究不僅豐富了對(duì)低壓低氧造成骨損傷的相關(guān)認(rèn)識(shí)，還為高原醫(yī)療中對(duì)高海拔地區(qū)骨損傷的診斷、預(yù)防和治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。