吳東益 劉小龍 劉春雨 史興惠 楊澤鵬 施德山 袁智勇

（1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校極小種群野生動(dòng)物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2. 云南大圍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管護(hù)局屏邊管護(hù)分局，云南 紅河 661199；3. 云南省屏邊縣林業(yè)和草原局，云南 屏邊 661200）

姬蛙科（Microhylidae）[1]隸屬于兩棲綱（Amphibia）無尾目（Anura），現(xiàn)存63屬694種，主要分布于美洲、亞洲、澳大利亞北部、馬達(dá)加斯加和撒哈拉以南的非洲地區(qū)[2]。中國(guó)共有姬蛙科物種5屬，即小狹口蛙屬（Glyphoglossus）[3]、細(xì)狹口蛙屬（Kalophrynus）[4]、狹口蛙屬（Kaloula）[5]、姬蛙屬（Microhyla）[4]、小姬蛙屬（Micryletta）[6]，共19個(gè)物種。

Nikolay等[7]根據(jù)姬蛙科Vietnamophryne inexpectata的標(biāo)本建立新屬Vietnamophryne，共3個(gè)物種，即V.inexpectata、V.orlovi、和V.occidentalis。Vietnamophryne inexpectata和V.orlovi的模式產(chǎn)地分別位于越南中部及北部的嘉萊?。℅ia Lai Province）和高平?。–ao Bang Province），Vietnamophryne occidentalis模式產(chǎn)地位于泰國(guó)北部地區(qū)的清萊?。–haing Rai Province），這3個(gè)物種目前都僅收集到1號(hào)標(biāo)本。

2019年7 月，在對(duì)云南省大圍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的調(diào)查中，采集到1號(hào)姬蛙科物種標(biāo)本，經(jīng)外部形態(tài)特征對(duì)比以及分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，鑒定為V. orlovi，為中國(guó)兩棲動(dòng)物分布的新屬記錄。對(duì)該物種采集地的生境進(jìn)行了描述，為該屬物種的進(jìn)一步深入研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與形態(tài)測(cè)量

2019年7月17日19：00，在屏邊苗族自治縣大圍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（22°57′48.15″ N，103°41′58.31″ E，海拔1502 m）采集到1號(hào)標(biāo)本（SWFU 036798），通過解剖查看性腺確定標(biāo)本為雄性。股骨肌肉保存于95%乙醇溶液后，其余標(biāo)本保存于75%乙醇溶液中，存放于西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院。根據(jù)Nikolay等[7]的測(cè)量方法，使用精確度為0.1 mm的游標(biāo)卡尺對(duì)所采集到的標(biāo)本進(jìn)行了相應(yīng)形態(tài)指標(biāo)測(cè)量：頭體長(zhǎng)（SVL）、頭長(zhǎng)（HL）、吻長(zhǎng)（SL）、眼徑（EL）、鼻眼距（NEL）、頭寬（HW）、鼻間距（IND）、眼間距（IOD）、上眼瞼寬（UEW）、前肢長(zhǎng)（FLL）、小臂及手長(zhǎng)（LAL）、手掌長(zhǎng)（HAL）、后肢長(zhǎng)（HLL）、脛骨長(zhǎng)（TL）、跗足長(zhǎng)（FTL）、鼓膜徑（TD）、鼓膜至眼距（TED）、指長(zhǎng)（FL）及趾長(zhǎng)（TOEL）。同時(shí)基于Nikolay等[7]對(duì)V.orlovi、V. occidentalis的形態(tài)描述與本例標(biāo)本進(jìn)行了形態(tài)比較。

1.2 分子實(shí)驗(yàn)與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

使用ThermoFisher Scientific公司的DNA提取試劑盒對(duì)新采集標(biāo)本的肌肉組織進(jìn)行全基因組DNA的提取，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)其16S rRNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，引物為L(zhǎng)3975（5′?CGCCTGTTTACCAAAAACAT?3′）和H4551（5′?CCGGTCTGAACTCAGATCACGT?3′）[8]。其反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)熱5 min，95 ℃ 變性1 min，退火溫度為45 ℃，反應(yīng)1 min，72 ℃ 延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，最后由北京擎科生物科技有限公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。使用LASERGENE 7.0軟件包[9]中的Seq-Man對(duì)所得序列進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和人工校對(duì)，生成一致序列。分別使用最大似然法（ML）和貝葉斯分析法（BI）重建Vietnamophryne的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。根據(jù)Nikolay等[7]的研究結(jié)果，選取Gastrophrynoides immaculatus[10]、Siamophryne troglodytes[11]作為外群，共包括6條序列（表1），其中5條從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。使用MEGA 6.0對(duì)每個(gè)16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)和編輯[12]。使用jModelTest 2中的AIC標(biāo)準(zhǔn)推斷序列最佳進(jìn)化模型[13]，最佳模型為GTR + G?；谠撃Ｐ?，使用RAxML 8.2.4[14]構(gòu)建最大似然樹，自展1000次估算節(jié)點(diǎn)支持率。使用Mrbayes 3.1.2[15]進(jìn)行貝葉斯法分析。設(shè)置貝葉斯核苷酸的替換模型為GTR +G模型，位點(diǎn)間變異速率分布為gamma，在默認(rèn)熱值下使用馬爾可夫鏈蒙特卡洛（MCMC）鏈執(zhí)行獨(dú)立運(yùn)算4次，每1000代抽樣1次，執(zhí)行3000萬代，拋棄前25%，在運(yùn)行中通過查看分散頻率平均標(biāo)準(zhǔn)偏差 < 0.01來確定貝葉斯取樣是否達(dá)到穩(wěn)定。然后使用來自Mrbayes的分裂頻率平均標(biāo)準(zhǔn)差（ASDSF）和潛在尺度縮減因子（PSRF）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來評(píng)估拓?fù)涫諗啃院头种чL(zhǎng)度收斂性，最后通過使用Tracer v 1.5[16]來檢測(cè)有效樣本量（ESS > 200）來檢查各運(yùn)行參數(shù)值是否收斂。使用軟件MEGA 5.0[12]中的Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算本研究新采集的標(biāo)本與Vietnamophryne中已知物種的遺傳距離。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)本形態(tài)描述

所采標(biāo)本各部位度量數(shù)據(jù)見表2。標(biāo)本為成年雄性，體型較?。^體長(zhǎng)：16.8 mm）且肥碩（前臂及手長(zhǎng)/頭體長(zhǎng)58.9%，后肢長(zhǎng)/頭體長(zhǎng)為163%），吻部略凸，吻長(zhǎng)（2.4 mm）略大于眼徑（2.1 mm），鼓膜相對(duì)較?。?.1 mm），占頭體長(zhǎng)的6.5%。眼背部略凸，有顳褶，無犁骨齒，舌后端游離，無缺刻。無蹼，無緣膜，前肢短?。ㄇ氨奂笆珠L(zhǎng)9.8 mm），第1指發(fā)育良好，長(zhǎng)度小于第2指長(zhǎng)度的1/2。無指基下瘤，無婚墊。指末端無凹槽，指尖不膨大，第3趾和第4趾趾尖微擴(kuò)展，指序?yàn)镮 < II < IV < III，趾和指的關(guān)節(jié)下瘤均不明顯，后肢長(zhǎng)度（27.1 mm）為前肢長(zhǎng)度（9.8 mm）的3倍，趾序?yàn)镮 < II < V < III < IV。背部整體呈磚紅色，背中線清晰，有黑色暗紋、紅色斑點(diǎn)和白色疣粒散布在背部和后肢背部。腹部皮膚光滑，整體呈檸檬黃，有棕色暗紋。頭部呈棕紅色，無疣粒與暗紋。吻部至顳部為黑褐色，摻雜有少量白色斑塊。有一條白色細(xì)紋自吻部貫穿至上眼瞼后緣（圖1）。

表2 大圍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)所采姬蛙科物種標(biāo)本（SWFU 036798）形態(tài)量度Table 2 Morphological measurement of Microhylidae specimens collected in Dawei Mountain National Nature Reserve (SWFU 036798)

圖1 奧氏越南姬蛙標(biāo)本（屏邊苗族自治縣大圍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，SWFU 036798，雄性）Fig. 1 V. orlovi in preservation (Dawei Mountain National Nature Reserve, SWFU 036798, male)

2.2 生境描述

本次采集到的標(biāo)本位于大圍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的針闊混交林，屬于濕潤(rùn)型的亞熱帶氣候。采集地的步道兩旁多有蕨類植物，落葉堆積，灌叢茂密。距采集點(diǎn)約15 m處有1個(gè)水庫(kù)，距采集點(diǎn)約50 m處有一條溪流。在采集點(diǎn)附近還采集到大綠臭蛙（Odorrana graminea, Boulenger 1899）和黑眶蟾蜍（Duttaphrynus melanostictus, Schneider 1799）。

2.3 分子實(shí)驗(yàn)與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

本研究新獲得一條長(zhǎng)度為571 bp的16S rRNA序列（Genbank序列號(hào)：OK377338），結(jié)合從GenBank下載的5條16S rRNA數(shù)據(jù)，共30個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，87個(gè)堿基變異位點(diǎn)。使用BI和ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這里只展示貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。本研究所采姬蛙科標(biāo)本與V.orlovi模式產(chǎn)地（越南東北部地區(qū)的高平省）標(biāo)本聚在一個(gè)支系內(nèi)。使用Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算的遺傳距離分析結(jié)果顯示，新采集的姬蛙科物種標(biāo)本與V.orlovi遺傳距離較小，僅0.9%，與同屬V.occidentalis、V.inexpectata2個(gè)物種的遺傳距離分別為1.1%和3.9%。

圖2 基于16S rRNA基因所構(gòu)建的Vietnamophryne貝葉斯樹。Fig. 2 Bayesian phylogenetic tree of the genus Vietnamophryne inferred from a fragment of 16SrRNA gene

2.4 討論

本研究新發(fā)現(xiàn)的姬蛙科標(biāo)本形態(tài)學(xué)鑒定特征符合V. orlovi的鑒定特征。首先該標(biāo)本體型較小（頭體長(zhǎng)：16.8 mm），腹部皮膚光滑，整體呈檸檬黃，背部皮膚整體呈磚紅色，有微微凸起的微小白色疣粒散布于背部、側(cè)腹和后肢背部。其次，該標(biāo)本鼻眼距（1.7 mm）占眼徑（2.1 mm）的80.9%，吻長(zhǎng)（2.4 mm）略大于眼徑（2.1 mm）（114.2%）。新采集標(biāo)本與模式標(biāo)本異同點(diǎn)在于：本研究的標(biāo)本體型略大，其頭體長(zhǎng)為16.8 mm，模式標(biāo)本頭體長(zhǎng)為15.4 mm。本研究的標(biāo)本頭長(zhǎng)略小于頭寬（頭長(zhǎng)6.2 mm/頭寬6.9 mm），模式標(biāo)本頭長(zhǎng)略大于頭寬（6.7 mm/5.8 mm），但差異不是非常明顯，見表2。分子數(shù)據(jù)分析的結(jié)果也支持新采集到的標(biāo)本為V. orlovi。其結(jié)果顯示本文所采姬蛙科樣本與V.orlovi聚在一起構(gòu)成單系，兩者的遺傳距離僅為0.9%。綜合外部形態(tài)特征與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，確定新采集的姬蛙科物種標(biāo)本為V.orlovi。根據(jù)Nikolay等[7]的研究將該屬的中文名定為“越南姬蛙屬”，V. orlovi的中文名定為“奧氏越南姬蛙”。

本研究結(jié)果揭示V.occidentalis可能是V.orlovi的次定同物異名。首先，本研究的標(biāo)本與模式產(chǎn)地的V.orlovi和V.occidentalis之間的遺傳分化均較小，其遺傳距離分別為0.9%和1.1%，無明顯差異。其次，V.orlovi和V.occidentalis之間的外部形態(tài)鑒別特征不穩(wěn)定，且性狀變異具有連續(xù)性（表3）：1）V.orlovi和V.occidentalis模式標(biāo)本的頭體長(zhǎng)分別為15.4 mm和20.5 mm，本研究V.orlovi標(biāo)本頭體長(zhǎng)為16.6 mm，僅靠一個(gè)標(biāo)本很難判斷頭體長(zhǎng)的變異是否連續(xù)；2）V.orlovi模式標(biāo)本頭長(zhǎng)大于頭寬（86.5%），V.occidentalis模式標(biāo)本頭長(zhǎng)與頭寬近似相等（99%），本研究V.orlovi標(biāo)本頭長(zhǎng)小于頭寬（111.3%）；3）V.orlovi和V.occidentalis模式標(biāo)本的眼徑與吻長(zhǎng)比分別為141.3%和85.5%，本研究V.orlovi標(biāo)本的眼徑與吻長(zhǎng)比為114.3%；4）V.orlovi模式標(biāo)本鼻眼距與眼徑的比值為109.5%，V.occidentalis模式標(biāo)本鼻眼距與眼徑的比值為55.2%，本研究V.orlovi標(biāo)本鼻眼距與眼徑的比值為85.7%；5）V.orlovi模式標(biāo)本前肢與頭體長(zhǎng)的比值為53.3%，V.occidentalis模式標(biāo)本前肢長(zhǎng)與頭體長(zhǎng)的比值為62.7%，本研究V.orlovi標(biāo)本前肢長(zhǎng)與頭體長(zhǎng)的比值為58.9%。V.occidentalis模式標(biāo)本與V.orlovi模式標(biāo)本較為穩(wěn)定的區(qū)別僅在于腹部顏色和指序，V.orlovi腹部顏色為檸檬黃，指序?yàn)镮 < IV < II < III，V.occidentalis腹部顏色為橘黃色，指序?yàn)镮 < IV < II < III；但顏色的根據(jù)僅基于一個(gè)標(biāo)本的特征，不能排除顏色在個(gè)體間具有變異?；谝陨咸卣鳎y以在形態(tài)上區(qū)別V.occidentalis和V.orlovi，這提示V.occidentalis可能是V.orlovi的次定同物異名。

表3 Vietnamophryne orlovi和Vietnamophryne occidentalis形態(tài)特征比較Table 3 Comparison of morphological characteristics of V. orlovi and V. occidentalis

3 結(jié)論

本次發(fā)現(xiàn)為我國(guó)的姬蛙科增加一個(gè)新屬記錄和一個(gè)物種新記錄。本次采集點(diǎn)的環(huán)境是針闊混交林，Nikolay等[7]描述的生境為常綠闊葉林，說明本物種至少分布于這2種環(huán)境。此外，之前Nikolay等[7]的采集點(diǎn)海拔為1050 m和1200 m，本次的采集點(diǎn)海拔為1502 m，說明V. orlovi的分布范圍至少在1050～1500 m。項(xiàng)目組成員在2019年7月采到一例標(biāo)本后，在2019年8月14日至8月21日、9月28日至10月7日先后2次前往采集地點(diǎn)，均未能再次采集到更多個(gè)體。推測(cè)其原因，可能是7月之后，過了本物種的繁殖季節(jié)，或是因?yàn)槠潆[蔽的生活史，Nikolay等[7]提及本屬物種大多為營(yíng)半穴居生活，所以未能采集到更多個(gè)體。

致謝：感謝西南林業(yè)大學(xué)錢昱含老師對(duì)標(biāo)本采集提供的幫助，感謝西南林業(yè)大學(xué)黃佳玥同學(xué)在分子鑒定方面給予的幫助，感謝屏邊苗族自治縣大圍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的工作人員對(duì)野外工作給予的幫助。本研究得到了云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（專項(xiàng)）優(yōu)秀青年項(xiàng)目?jī)蓷珓?dòng)物多樣性與演化研究（202001AW070016）、中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目（202005AC160046）、中國(guó)科協(xié)青年人才托舉工程（2019?2021QNRC001）、生態(tài)環(huán)境部生物多樣性調(diào)查、觀測(cè)和評(píng)估項(xiàng)目（2019?2023年）的資助。