董嘉琪，張旺東，姚萬(wàn)玲，薛 姣，劉瑩發(fā)，魏彥明，紀(jì) 鵬

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

胃腸道定植的微生物種類繁多、數(shù)目巨大，構(gòu)成了復(fù)雜的消化道微生態(tài)系統(tǒng)，其中，僅細(xì)菌的種類就達(dá)1 000種之多，其總量可達(dá)人類細(xì)胞總數(shù)的10倍。 它們對(duì)機(jī)體消化、能量代謝、腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育均具有重要的調(diào)節(jié)作用。在畜牧生產(chǎn)中，抗生素長(zhǎng)期大量使用會(huì)引起腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致畜禽免疫力降低及二次感染等問題。此外，斷奶等應(yīng)激誘發(fā)的菌群失調(diào)可導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)性能下降、免疫力降低，犢牛腹瀉率增加等。人類腸道菌群失調(diào)也可誘發(fā)多種疾病，有研究表明，當(dāng)機(jī)體腸道菌群失調(diào)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致糖尿病患者病情加劇，炎癥性腸病發(fā)病率提高，腸道菌群長(zhǎng)期紊亂還會(huì)導(dǎo)致結(jié)直腸腺瘤風(fēng)險(xiǎn)增加。此外，腸道菌群失調(diào)還會(huì)影響情緒行為的調(diào)控等。為提高畜牧業(yè)生產(chǎn)力、控制腸道菌群失調(diào)相關(guān)疾病的發(fā)生，開發(fā)新型產(chǎn)品以維持和改善腸道微生態(tài)已成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)，微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等產(chǎn)品己經(jīng)在生產(chǎn)、生活中廣泛應(yīng)用。

目前研究表明，中藥也可扶植胃腸道正常菌群生長(zhǎng)，提高機(jī)體免疫力。近年來，植物或中藥多糖對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié)作用的研究備受國(guó)內(nèi)外關(guān)注，如香菇多糖、黃芪多糖、人參多糖等。它們可為腸道微生物的生存提供必需的營(yíng)養(yǎng)素，同時(shí)糖類被微生物降解后產(chǎn)生的短鏈脂肪酸也可調(diào)節(jié)腸道pH并給機(jī)體提供能量，對(duì)動(dòng)物機(jī)體健康具有重要意義。紅芪為甘肅省道地藥材，古代本草學(xué)家將紅芪統(tǒng)稱為黃芪，直到20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)紅芪中含有黃芪不具有的成分1-3-羥基-9-甲氧基紫檀烷，具有較好的抑菌作用，使得紅芪的藥效學(xué)研究引起國(guó)內(nèi)研究者的重視。1985年中國(guó)藥典將紅芪從黃芪項(xiàng)中移出，成為一味單獨(dú)的中藥。據(jù)報(bào)道，紅芪多糖具有提高免疫、抗氧化、降血糖、抗輻射、抗腫瘤等多方面的功效，但關(guān)于其調(diào)節(jié)腸道菌群的作用鮮見報(bào)道。而且不同來源的多糖因分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及純度方面的差異，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的效用以及作用的最佳劑量會(huì)有所不同。

本試驗(yàn)將紅芪粗多糖分別用DEAE-52和Sephadex G-100進(jìn)行分離純化得單一多糖，用來調(diào)節(jié)灌服抗生素雞尾酒(氨芐西林、萬(wàn)古霉素、甲硝唑、新霉素)小鼠的腸道菌群，通過16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)分析不同劑量的純化紅芪多糖對(duì)腸道菌群的影響，篩選出調(diào)節(jié)腸道菌群的最佳有效劑量，以期為紅芪多糖調(diào)節(jié)腸道菌群的臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 Sephadex G-100和DEAE-52，購(gòu)自美國(guó)Whatman公司；標(biāo)準(zhǔn)品：巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、古羅糖醛酸、D-氨基半乳糖鹽酸鹽、鹽酸氨基葡萄糖，購(gòu)自Sigma公司；三氟乙酸和甲醇，購(gòu)自ANPEL公司；氨芐西林、新霉素、萬(wàn)古霉素、甲硝唑、兩性霉素B，購(gòu)自上海麥克林公司。

1.1.2 主要儀器 ICS5000離子色譜系統(tǒng)，美國(guó)Thermo公司；7890A-5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；DZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；iMark型酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD公司；RM2245切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；Olympus DP-71顯微照相系統(tǒng)，日本Olympus公司。

1.2 試驗(yàn)藥物的制備

利用實(shí)驗(yàn)室已建立優(yōu)化的紅芪粗多糖提取方法制備紅芪多糖。對(duì)紅芪粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離純化得到的多糖RHPS-1(Radix Hedysari polysaccharide-1，RHPS-1)，經(jīng)Sephadex G-100凝膠色譜柱進(jìn)一步純化，采用苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，繪制吸收曲線，收集主峰部分，冷凍干燥得多糖RHPS-1-1。

1.3 多糖含量的測(cè)定

多糖含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定。

1.4 多糖的純度鑒定及分子量測(cè)定

采用凝膠滲透色譜法測(cè)定RHPS-1-1的相對(duì)分子質(zhì)量。以市售不同分子量(1、5、10、50、150、200、400 ku)的右旋糖酐為參照建立方法。樣品完全溶解于超純水中，通過0.45 μm濾器過濾后進(jìn)樣。

1.5 單糖組成分析

采用高效陰離子交換色譜法(high-performance anion-exchange chromatography，HPAEC)進(jìn)行單糖組成測(cè)定。

1.5.1 樣品前處理 精確稱量紅芪多糖樣品5 mg， 加入1 mL 2 mol·LTFA酸溶液，105 ℃加熱6 h，氮?dú)獯蹈?。加入甲醇清洗，再吹干，重?fù)甲醇清洗2～3次。加入無菌水溶解，轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測(cè)。

1.5.2 色譜條件 采用DionexCarboPacPA10(250×4.0 mm，10 μm)液相色譜柱；進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相A(0.1 mol·LNaOH)，流動(dòng)相B(0.1 mol·LNaOH，0.2 mol·LNaAc)，流速0.5 mL·min；柱溫為30 ℃；洗脫梯度：0 min A相/B相(95∶5，V/V)，30 min A相/B相(80∶20，V/V)，30.1 min A相/B相(60∶40，V/V)，45 min A相/B相(60∶40，V/V)，45.1 min A相/B相(95∶5，V/V)， 60 min A相/B相(95∶5，V/V)。

1.6 多糖的甲基化分析

1.6.1 樣品衍生化 稱取紅芪多糖樣品10 mg，加入1 mL一級(jí)水溶解，再加入1 mL 100 mg·mL碳二亞胺，反應(yīng)2 h。加入1 mL 2 mol·L的咪唑，再分別加入1 mL 30 mg·mL的NaBH和1 mL 30 mg·mL的NaBD，反應(yīng)3 h。加入100 μL冰醋酸終止反應(yīng)。透析樣品48 h，透析完成后冷凍干燥樣品，進(jìn)行甲基化處理。

1.6.2 樣品甲基化處理 凍干樣品中加入500 μL DMSO溶解。加入1 mg NaOH，孵育30 min。加入50 μL碘甲烷溶液反應(yīng)1 h。加入1 mL水和2 mL二氯甲烷，渦旋混勻，離心，棄水相。重復(fù)水洗3次。吸取下層二氯甲烷相并蒸干。加入100 μL 2 mol·LTFA，121 ℃反應(yīng)90 min。30 ℃蒸干。加入50 μL 2 mol·L氨水，50 μL 1 mol·LNaBD，混勻，室溫下反應(yīng)2.5 h。加入20 μL乙酸終止反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑?50 μL甲醇洗2次，氮?dú)獯蹈?。加入乙酸?50 μL，渦旋混勻，100 ℃反應(yīng)2.5 h。加入1 mL水靜置10 min。加入500 μL二氯甲烷，渦旋混勻，離心，棄水相。重復(fù)水洗3次。取下層二氯甲烷相，上機(jī)檢測(cè)。

1.6.3 色譜條件 采用Agilent氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定多糖結(jié)構(gòu)。進(jìn)樣量為1 μL，分流比為10∶1， 載氣為高純氦氣；柱溫箱的初始溫度為140 ℃保持2.0 min，以3 ℃·min程序升溫至230 ℃，保持3 min。質(zhì)量掃描范圍(m·z)： 30～600。

1.7 紅外光譜分析

用傅里葉變換紅外光譜儀以1 cm分辨率在4 000～400 cm內(nèi)掃描紅芪多糖的吸收峰。

1.8 動(dòng)物試驗(yàn)

SPF級(jí)C57BL/6小鼠90只，6～8周齡，體重18～22 g，雄性，由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SYXK(甘)2020-0010)。試驗(yàn)過程中遵循動(dòng)物倫理福利相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在(18±2)℃，相對(duì)濕度為50%～60%，12 h光照/12 h黑暗，小鼠自由采食和飲水。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將90只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、自愈組，12.5、25、50、100、200和400 mg·kg的紅芪多糖干預(yù)組，每組10只。模型組、自愈組和不同劑量紅芪多糖干預(yù)組參考文獻(xiàn)[25-27]復(fù)制模型：小鼠口腔灌服抗生素雞尾酒(由4種抗生素和1種抗真菌藥組成，將氨芐西林100 mg·kg、萬(wàn)古霉素50 mg·kg、甲硝唑100 mg·kg、新霉素100 mg·kg和兩性霉素B 1 mg·kg溶于滅菌蒸餾水中，現(xiàn)用現(xiàn)配)，每天2次，每次間隔12 h，連續(xù)14 d，建立小鼠腸道菌群失調(diào)模型，正常對(duì)照組灌服等量的生理鹽水。造模結(jié)束后，將模型組小鼠處死，各紅芪多糖治療組分別灌服12.5、25、50、100、200和400 mg·kg的RHPS-1-1進(jìn)行治療，正常對(duì)照組、自愈組給予等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。

1.9 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，將各組小鼠禁食12 h，眼球采血處死，取盲腸內(nèi)容物立即放入液氮中，-80 ℃儲(chǔ)存。取心、肝、脾、肺、腎、腦置于4%中性甲醛溶液中固定。

1.10 檢測(cè)指標(biāo)

1.10.1 小鼠體重的檢測(cè) 試驗(yàn)期間每2 d稱量每只小鼠的體重，以各組小鼠的平均體重變化率為指標(biāo)，檢測(cè)不同處理對(duì)小鼠體重的影響。

1.10.2 腸道菌群高通量測(cè)序分析 盲腸內(nèi)容物16S rDNA檢測(cè)由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成，根據(jù)說明書，使用 E.Z.N.A.Stool DNA Kit分離試劑盒從樣品中提取總DNA，選取細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增與測(cè)序。所用引物序列為：341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)，805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：Phusion Hot start flex 2× Master Mix 12.5 μL、Forward Primer 2.5 μL、Reverse Primer 2.5 μL、Template DNA 50 μL、ddHO 25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：98 ℃，30 s；(98 ℃，10 s； 54 ℃，30 s；72 ℃，45 s)×35次循環(huán)；72 ℃，10 min。 所有PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、定量和均一化處理后，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，利用Illumina NovaSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.10.3 生物信息學(xué)分析 用QIIME2分析菌群α多樣性(Chao1、Shannon、Goods_coverage和Simpson)，使用R軟件vegan進(jìn)行β多樣性分析，包括主成分分析和聚類分析，<0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.10.4 各臟器指數(shù) 稱量心、肝、脾、肺、腎和腦的重量，計(jì)算各臟器指數(shù)(mg·g)。

1.10.5 病理組織學(xué)觀察 取固定于4%中性甲醛溶液中的各臟器樣品進(jìn)行流水沖洗24 h，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片和HE染色，中性樹膠封片。采用Olympus DP-71顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用軟件Chromeleon處理色譜數(shù)據(jù)；用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，正常和模型組差異菌群分析比較采用LSD法，其他事后比較采用鄧肯法，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，<0.01表示差異極顯著，<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 RHPS-1的純化

將紅芪粗多糖過DEAE-52離子交換柱，用蒸餾水洗脫，在30～60管之間洗出現(xiàn)一個(gè)峰，合并洗脫液，濃縮、冷凍干燥，得RHPS-1；將RHPS-1組分經(jīng)Sephadex G-100凝膠色譜柱純化，在18～55管之間洗出一個(gè)峰(圖1)，合并洗脫液，濃縮、冷凍干燥，得RHPS-1-1，回收率為64.98%，糖含量為99.12%。

圖1 RHPS1-1的Sephadex G-100凝膠色譜柱洗脫圖Fig.1 Chromatographic elution on RHPS1-1 by Sephadex G-100 gel column

2.2 RHPS-1-1的純度測(cè)定及相對(duì)分子質(zhì)量分布

RHPS-1-1的重均分子量為19.420 ku；RHPS-1-1的多分散系數(shù)(Mw/Mn)為1.31，接近于1，兩級(jí)分布均為單一對(duì)稱峰，說明RHPS-1-1為均一多糖。

2.3 RHPS-1-1的單糖組成分析

高效陰離子交換色譜分析顯示RHPS-1-1主要由葡萄糖(99.20%)組成，還含有少量的阿拉伯糖(0.19%)和葡萄糖醛酸(0.21%)(圖2)。

A. 標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖；B. RHPS-1-1離子色譜圖；標(biāo)準(zhǔn)品：巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、古羅糖醛酸、D-氨基半乳糖鹽酸鹽、鹽酸氨基葡萄糖A.Ion Chromatogram of standard samples; B. Ion Chromatogram of RHPS-1-1; Standards: Fuc(Fucose); Rha(Rhamnose); Ara(Arabinose); Gal(Galactose); Glc(Glucose); Xyl(Xylose); Man(Mannose); Fru(Fructose); Rib(Ribose); Gal-UA(Galacturonic Acid); Glc-UA(Glucuronic Acid); Man-UA(Mannuronic Acid); Gul-UA(Guluronic Acid); D-GalN(D-Glucosamine hydrochloride); GluN(Glucosamine)圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和RHPS-1-1的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of standards and RHPS-1-1

2.4 RHPS-1-1的甲基化分析

甲基化的RHPS-1-1樣品的GC-MS分析結(jié)果如表1所示。在RHPS-1-1中，以1,4-D-Glcp連接類型為主，有少數(shù)1,6-D-Glcp連接。此外，還發(fā)現(xiàn)少量的1,3,4-D-Glcp、1,2,4-D-Glcp和1,4,6-D-Glcp連接，表明存在少量的分支。根據(jù)甲基化分析的結(jié)果，可以推斷RHPS-1-1具有1,4-D-Glcp連接的葡聚糖結(jié)構(gòu)，在O-2或O-3處可能存在Glcp分支，T-D-Glcp為糖鏈末端。

2.5 RHPS-1-1的紅外光譜分析

如圖3所示，紅芪多糖RHPS-1-1在3 600～3 200、 3 000～2 800、1 400～1 200和1 200～700 cm范圍內(nèi)的吸收峰是多糖的特征吸收峰。RHPS-1-1在波數(shù)3 280 cm處都具有強(qiáng)而寬的吸收峰，是由糖環(huán)中的O—H鍵的變角振動(dòng)引起的；在波數(shù)2 930 cm處具有中等強(qiáng)度的吸收峰，是由于C—H的拉伸振動(dòng)，這些特征峰也均為典型的多糖特征峰。RHPS-1-1在1 630 cm處的吸收峰表示與水結(jié)合的峰，1 340 cm處的吸收峰表示C—O的拉伸振動(dòng)。在990.0 cm處的吸收峰表示D-葡萄吡喃糖的非對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)。在843 cm處的吸收峰表示RHPS-1-1是α構(gòu)型糖苷鍵。上述吸收峰為植物多糖的特殊吸收峰。

圖3 RHPS-1-1的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum diagram of RHPS-1-1

2.6 紅芪多糖對(duì)各組小鼠體重的影響

試驗(yàn)過程中各組小鼠體重變化率均呈逐漸上升趨勢(shì)(圖4A)。第22和28天各組小鼠體重變化率組間差異顯著(<0.05)，其余天數(shù)各組之間無顯著性差異(>0.05)。與正常對(duì)照組相比，自愈組小鼠體重變化率在第22和28天時(shí)均顯著下降(<0.05)， 經(jīng)RHPS-1-1治療后，除RHPS-1-1 200 mg·kg組小鼠體重變化率在22 d時(shí)顯著上升(<0.05)， 其他組在第22和28天時(shí)小鼠體重變化均上升，但差異不顯著(>0.05)。

A. 整個(gè)試驗(yàn)過程中各組小鼠的體重變化率；B. 第22天各組小鼠的體重變化率；C. 第28天各組小鼠的體重變化率。NC. 正常對(duì)照組；SH. 自愈組；M. 模型組；R1T-12.5、R1T-25、R1T-50、R1T-100、R1T-200和R1T-400分別代表劑量為12.5、25、50、100、200和400 mg·kg-1 RHPS-1-1給藥組。相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同A. Body weight change of mice in each group throughout the experiment; B. The body weight change of mice in each group on day 22; C. The body weight change of mice in each group on day 28. NC. Normal control group; SH. Self-healing group; M. Model group; R1T-12.5, R1T-25, R1T-50, R1T-100, R1T-200 and R1T-400 respectively represent 12.5, 25, 50, 100, 200 and 400 mg·kg-1 of RHPS-1-1 treatment groups. The same letter means no significant difference (P>0.05), different letters mean significant difference (P<0.05). The same as below圖4 各組小鼠的體重變化率Fig.4 Change rate of body weight in each group

2.7 正常對(duì)照組和模型組腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.7.1 正常和模型組腸道菌群分布 通過分類學(xué)分析，共鑒定出10個(gè)門。正常對(duì)照組所有樣本中的最優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)，變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的豐度占比次之，另外，其他一些豐度較低的門也被檢出；模型組樣本菌群較為單一，幾乎為變形菌門(Proteobacteria)(圖5A)。為進(jìn)一步驗(yàn)證分類學(xué)差異，本研究對(duì)top5的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組所有樣本中_unclassified占比較大，而模型組所有樣本中克雷伯菌屬()占比較大(圖5B)。

A. 門水平的腸道菌群分布相對(duì)豐度；B. 屬水平的腸道菌群分布相對(duì)豐度。NC-1～5. 正常對(duì)照組小鼠編號(hào)；M-1～5. 模型組小鼠編號(hào)A. Relative abundance of intestinal flora at phylum level; B. Relative abundance of intestinal flora at genus level; NC-1-5. The number of mice in normal control group; M-1-5. The number of mice in model group圖5 正常對(duì)照組和模型組門和屬水平的腸道菌群分布Fig.5 Intestinal flora distribution at phylum and genus levels in normal control and model groups

2.7.2 正常對(duì)照組和模型組差異菌群分析 在門水平上，與正常對(duì)照組相比，模型組擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度極顯著降低(<0.01)，放線菌門顯著降低(<0.05)，變形菌門極顯著升高(<0.01)(圖6A～D)。在屬水平上，與正常對(duì)照組相比，模型組_NK4A136_group相對(duì)豐度極顯著降低(<0.01)，克雷伯菌屬極顯著升高(<0.01)(圖6E～F)。

A. 擬桿菌門；B. 厚壁菌門；C. 變形菌門；D. 放線菌門；E. 克雷伯菌屬；F. Lachnospiraceae_NK4A136_group。*. P<0.05； **. P<0.01A. Bacteroidetes; B. Firmicutes; C. Proteobacteria; D. Actinobacteria; E. Klebsiella; F. Lachnospiraceae_NK4A136_group. *. P<0.05； **. P<0.01圖6 正常對(duì)照組和模型組門和屬水平差異菌群分析Fig.6 Analysis of differential flora at phylum and genus levels in normal control and model groups

2.8 除模型組外的腸道菌群多樣性分析

2.8.1 Alpha多樣性分析 由圖7可知，與正常對(duì)照組相比，自愈組小鼠腸道菌群Chao1指數(shù)顯著降低(<0.05)，經(jīng)RHPS-1-1治療后，R1T-25組顯著升高(<0.05)，R1T-50、R1T-200、R1T-400組均顯著降低(<0.05)，其余各組無顯著性變化(>0.05)(圖7A)；與正常對(duì)照組相比，自愈組小鼠腸道菌群Shannon指數(shù)無顯著變化(>0.05)，經(jīng)RHPS-1-1治療后，R1T-200、R1T-400組Shannon指數(shù)顯著下降(<0.05,圖7C)，其余各組無顯著性變化(>0.05)；Goods_coverage和Simpson指數(shù)各組之間差異不顯著(>0.05,圖7B、7D)。

A. Chao1 指數(shù)；B. Goods_coverage； C. Simpson指數(shù)；D. Shannon指數(shù)A. Chao1 index; B. Goods_coverage; C. Simpson index; D. Shannon index圖7 除模型組外的各組小鼠腸道菌群alpha多樣性分析Fig.7 Alpha diversity analysis of intestinal microflora in mice of each group except model group

2.8.2 Beta多樣性分析

2.8.2.1 主成分分析：由圖8可知，正常對(duì)照組和自愈組完全分離，菌群結(jié)構(gòu)差異較大；R1T-25組和正常對(duì)照組重合度最高，菌群結(jié)構(gòu)差異較小，其余各治療組均與正常對(duì)照組菌群結(jié)構(gòu)差異較大。

圖8 除模型組外的各組小鼠腸道菌群PCA分析Fig.8 PCA analysis of intestinal flora of mice in each group except model group

2.8.2.2 各組小鼠腸道菌群UPGMA聚類樹分析：通過各組小鼠門和屬水平的聚類分析圖(圖9)可得出，正常對(duì)照組與自愈組間樣本的距離較大，表明兩組間腸道菌群結(jié)構(gòu)有較大差異；經(jīng)RHPS-1-1治療后，R1T-25組與正常對(duì)照組間樣本的距離最小，表明兩組間腸道菌群結(jié)構(gòu)有高度的相似性。該結(jié)果與PCA的聚類結(jié)果較為紊合。

A. 門水平；B.屬水平A. Phylum level; B. Genus level圖9 除模型組外的各組腸道菌群UPGMA聚類樹分析Fig.9 UPGMA clustering tree analysis of intestinal flora in each group except model group

2.9 除模型組外的腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.9.1 門和屬水平腸道菌群分布 在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門是小鼠腸道菌群中最主要的優(yōu)勢(shì)菌門，其相對(duì)豐度在所有樣本中占比最大(圖10A)。在屬水平上，_unclassified是腸道微生物中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌(圖10B)。與正常對(duì)照組相比，自愈組中_unclassified增加。與自愈組相比，各治療組_unclassified減少。

A. 門水平；B.屬水平A. Phylum level; B. Genus level圖10 除模型組外的各組小鼠門和屬水平的腸道菌群分布Fig.10 Intestinal flora distribution at phylum and genus levels in mice of each group except model group

2.9.2 門和屬水平差異菌群分析 在門水平上，與正常對(duì)照組相比，自愈組擬桿菌門相對(duì)豐度顯著升高(<0.05)，厚壁菌門相對(duì)豐度顯著降低(<0.05)，二者比值(擬桿菌門/厚壁菌門)也顯著升高(<0.05)；RHPS-1-1治療后，各劑量組的擬桿菌門相對(duì)豐度和二者比例均顯著降低(<0.05)，厚壁菌門相對(duì)豐度除R1T-200組無顯著變化外，其余各劑量組均顯著升高(<0.05)。與正常對(duì)照組相比，R1T-12.5、25、50、100組的擬桿菌門差異不顯著(>0.05)；除R1T-200組的厚壁菌門顯著降低外(<0.05)，其余差異不顯著(>0.05)；各治療組的擬桿菌門/厚壁菌門差異不顯著(>0.05)(圖11A～C)。

A.擬桿菌門；B. 厚壁菌門；C. 擬桿菌門/厚壁菌門；D. Muribaculaceae_unclassified；E. Ruminococcaceae_UCG-014；F. Clostridiales_unclassifiedA.Bacteroidetes; B. Firmicutes; C. Bacteroidetes/Firmicutes; D. Muribaculaceae_unclassified; E. Ruminococcaceae_UCG-014; F. Clostridiales_unclassified圖11 除模型組外的各組小鼠門和屬水平差異菌群分析Fig.11 Differential flora analysis at phylum and genus levels of mice in each group except model group

在屬水平上，與正常對(duì)照組相比，自愈組_unclassified相對(duì)豐度顯著升高(<0.05)，_UCG-014和_unclassified相對(duì)豐度顯著降低(<0.05)。經(jīng)RHPS-1-1治療后，各劑量組_unclassified均顯著降低(<0.05)；R1T-12.5和R1T-25組_UCG-014相對(duì)豐度顯著升高(<0.05)，其余各劑量組均無顯著性變化(>0.05)；R1T-12.5、R1T-100和R1T-200組_unclassified相對(duì)豐度無顯著性變化(>0.05)，其余各劑量組均顯著升高(<0.05)。與正常對(duì)照組相比，R1T-12.5組的_unclassified相對(duì)豐度顯著升高(<0.05)；R1T-12.5和25組的_UCG-014相對(duì)豐度差異不顯著(>0.05)，其余各組差異顯著(<0.05)；R1T-25、50、100和400組的_unclassified相對(duì)豐度差異不顯著(>0.05)，其余各組差異顯著(<0.05,圖11D～F)。

綜上，從門和屬的總體水平上可以看出，R1T-25組菌群的回調(diào)效果最好。

2.10 紅芪多糖對(duì)各組小鼠臟器的影響

與正常對(duì)照組相比，自愈組小鼠肝臟指數(shù)顯著下降(<0.05)，經(jīng)25 mg·kgRHPS-1-1治療后，顯著上升(<0.05)。心臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦指數(shù)3組間均無顯著性差異(>0.05，表2)。

表2 RHPS-1-1對(duì)腸道菌群失調(diào)小鼠主要器官指數(shù)的影響(Mean±SD)

正常對(duì)照組、自愈組和25 mg·kgRHPS-1-1治療組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常；胞核清晰呈橢圓形，著色較淺，位于肌纖維的中央，肌纖維間無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖12A～C)，且3組間無顯著變化；肝小葉結(jié)構(gòu)完整，以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞索和肝血竇向周圍呈放射狀排列；肝細(xì)胞形態(tài)清晰，核大而圓，居中，胞漿豐富(圖12D～F)，且3組間無顯著變化；脾組織結(jié)構(gòu)完整，紅、白髓區(qū)界限清晰，小梁結(jié)構(gòu)正常，脾索和脾竇結(jié)構(gòu)清晰，淋巴細(xì)胞排列緊密、結(jié)構(gòu)完整(圖12G～I(xiàn))，且3組間無顯著變化；肺泡結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核明顯，肺泡無塌陷及破裂，肺泡充盈適度，無滲出液及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖12 J～L)，且3組間無顯著變化；腎單位結(jié)構(gòu)清晰，腎皮質(zhì)迷路結(jié)構(gòu)明顯，腎小體結(jié)構(gòu)完整，腎小球位于小體中央且結(jié)構(gòu)完整，囊腔大小正常，腎小管上皮細(xì)胞排列規(guī)律(圖12M～O)，且3組間無顯著變化；腦海馬區(qū)細(xì)胞排列整齊、密集，核圓而大，核仁清晰，膠質(zhì)細(xì)胞無增生，間質(zhì)無水腫現(xiàn)象(圖12Q～R)，且3組間無顯著變化。

A～C.心；D～F.肝；G～I(xiàn).脾；J～L.肺；M～O.腎；P～R.大腦A-C. Heart; D-F. Liver; G-I. Spleen; J-L. Lung; M-O. Kidney; P-R. Brain圖12 各組小鼠主要臟器組織病理變化(HE染色，400×)Fig.12 Histopathological changes of main organs of mice in each group(HE staining, 400×)

3 討 論

本研究分離純化所得的RHPS-1-1的重均分子量為19.420 ku，其單糖組成主要為葡萄糖，主鏈連接方式為1,4-D-Glcp，這與陳同強(qiáng)和石義凱從紅芪中提取的多糖在單糖組成和主鏈連接方式上均相似，但分子量存在差異，而本研究獲得的RHPS-1-1支鏈較少，易溶解，能較好地進(jìn)入細(xì)胞，從而發(fā)揮生物學(xué)作用，表明本研究所提取的RHPS-1-1具有較高的生物活性。

本研究用RHPS-1-1對(duì)抗生素雞尾酒法建立的小鼠腸道菌群失調(diào)模型進(jìn)行菌群調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門幾乎耗竭，而變形菌門豐度比例顯著上升，表明小鼠腸道菌群嚴(yán)重失調(diào)，造模成功。自愈組相比正常對(duì)照組Chao1指數(shù)顯著降低，說明抗生素可降低腸道菌群的多樣性，且不能自行恢復(fù)，這與Kaur等的研究結(jié)果相一致。經(jīng)不同劑量RHPS-1-1治療后，RIT-25組Chao1指數(shù)提高程度最大，且PCA和UPGMA聚類分析結(jié)果表明，R1T-25組的腸道菌群組成與正常對(duì)照組最接近。提示以25 mg·kgRHPS-1-1給藥對(duì)腸道菌群紊亂小鼠的調(diào)控效果最佳，這可能與多糖濃度有關(guān)，在適量濃度下多糖可作為能源物質(zhì)為微生物提供營(yíng)養(yǎng)，但當(dāng)濃度過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致部分菌群細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生物理性滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)水分流失，導(dǎo)致死亡。綜上，說明25 mg·kgRHPS-1-1為調(diào)節(jié)小鼠菌群失調(diào)的最佳劑量。

本研究結(jié)果顯示，在門水平上，自愈組相比正常對(duì)照組擬桿菌門相對(duì)豐度顯著升高，厚壁菌門顯著降低，擬桿菌門與厚壁菌門的豐度比(擬桿菌門/厚壁菌門)也顯著升高，這與Rodrigues等研究相一致。厚壁菌門和擬桿菌門是人體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌門。有研究報(bào)道，厚壁菌門能幫助機(jī)體有效地吸收食物中的熱量，并逐漸轉(zhuǎn)化為脂肪，還可調(diào)控能量貯存基因的表達(dá)；而擬桿菌門擅長(zhǎng)分解碳水化合物，使人和動(dòng)物不易肥胖。因此，本研究中自愈組小鼠在22和28 d體重下降，可能與擬桿菌門豐度升高，厚壁菌門豐度降低，兩者豐度比值升高有關(guān)。另外，兩者比值升高還與一些疾病相關(guān)，例如糖尿病、結(jié)腸腺瘤性息肉、腦出血等。本研究所復(fù)制的菌群失調(diào)模型，是否有相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)還有待進(jìn)一步研究。經(jīng)RHPS-1-1治療后，各劑量組的擬桿菌門相對(duì)豐度和二者比例均顯著降低，厚壁菌門顯著升高，說明RHPS-1-1對(duì)抗生素造成的腸道菌群失調(diào)具有調(diào)節(jié)作用。在屬水平上，自愈組_UCG-014和_unclassified相對(duì)豐度相比正常對(duì)照組顯著降低，這與Park等和Cho等研究結(jié)果一致。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，自愈組中有害菌_unclassified相對(duì)豐度增多。經(jīng)RHPS-1-1治療后，R1T-25組_UCG-014和_unclassified相對(duì)豐度顯著升高，_unclassified顯著降低。有研究報(bào)道瘤胃菌屬的_UCG-014和梭菌科的_unclassified屬于腸道益生菌，可抑制有害菌的生長(zhǎng)。同時(shí)梭菌科的某些細(xì)菌可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，維持大腸的正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能。因此，RHPS-1-1調(diào)節(jié)腸道菌群可能是促進(jìn)了腸道有益菌的生長(zhǎng)，抑制了有害菌的生長(zhǎng)。

另外，腸道菌群失調(diào)后還會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，進(jìn)而引起內(nèi)源性感染和內(nèi)毒素血癥，造成多器官衰竭。本研究發(fā)現(xiàn)，器官指數(shù)在自愈組相比正常對(duì)照組只有肝臟指數(shù)顯著下降，其他臟器無變化；進(jìn)一步的組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，各主要組織器官無明顯的病理?yè)p傷。有文獻(xiàn)報(bào)道，腸道菌群失調(diào)會(huì)誘發(fā)肝硬化等肝疾病，至于本研究中所建立的抗生素雞尾酒致菌群失調(diào)模型是否在分子水平和代謝水平上對(duì)肝及其他臟器造成影響還有待進(jìn)一步深入研究。經(jīng)RHPS-1-1治療后，R1T-25組的肝臟指數(shù)顯著上升，說明RHPS-1-1具有一定的保護(hù)肝的作用或通過其他途徑恢復(fù)了肝組織的功能。

4 結(jié) 論

本研究純化所得RHPS-1-1為一種植物葡聚糖，且給藥劑量為25 mg·kg時(shí)，對(duì)抗生素雞尾酒誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群紊亂，在提高腸道菌群穩(wěn)定性和多樣性、促進(jìn)腸道益生菌增殖、有效抑制有害菌過度繁殖等方面具有顯著調(diào)節(jié)作用；同時(shí)此劑量的RHPS-1-1可以回調(diào)由抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)所致的肝臟指數(shù)下降。