許李鋒，賈晨宇，陳福再，方夢園，劉孝丹，陳吉龍，李訓良

(福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)，福建省畜禽病原感染與免疫學重點實驗室，福建省-尼泊爾畜禽重大疫病防控聯(lián)合實驗室，福州 350002)

雞滑液囊支原體(，MS)屬于柔膜體綱支原體屬，直徑0.2～0.4 μm，以芽生方式或二分裂法繁殖，經(jīng)姬姆薩染色后可以更好地觀察其多形性，在電子顯微鏡下觀察呈圓形或梨形等；MS只有一個血清型，但不同基因型的菌株致病力卻存在差異，引起的癥狀也有所差異，部分菌株可能不產生或很少產生臨床癥狀。MS基因組的特點是G+C含量低，由于其有限的遺傳信息，支原體表達少量的細胞蛋白并且缺乏許多酶活性和代謝途徑。因此，它們的營養(yǎng)需求很復雜，許多營養(yǎng)素都依賴于宿主。MS主要引起雞等禽類的上呼吸道疾病、氣囊炎、滑膜炎、腱鞘炎和滑囊炎。MS感染與蛋殼頂端異常(EAA)有關，使蛋的品質下降和質量減輕，導致出現(xiàn)異常卵增多，蛋殼易脆等問題。MS感染在中國非常普遍，一年四季均可發(fā)生。MS既可以水平傳播也可以垂直傳播，對任何年齡的雞都可以造成感染。由于其感染隱蔽，不易根除，造成家禽生長遲緩、飼料利用率下降等，是目前導致養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟損失的重要因素。

為了減少因野生型MS菌株感染引起的疾病和經(jīng)濟損失，可以使用3種不同的措施用以預防和控制：雞場凈化，抗生素治療和預防接種。雞場凈化主要是檢測雞群MS的感染，通過淘汰患病雞群，培育無MS感染的種雞群。但由于中國禽業(yè)養(yǎng)殖場的規(guī)模和管理級別的不同，加之雞場凈化的成本高昂，很難建立和維護無MS感染的種雞群，因此這種方法采用較少。而抗生素的頻繁使用，不僅容易導致菌株產生耐藥性，而且存在藥物殘留影響食品安全的風險。目前，市場上存在兩種預防MS的減毒活疫苗，分別是對溫度敏感的弱毒MS-H疫苗株和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)非依賴性MS1疫苗株。MS-H疫苗株目前已在全世界廣泛使用，有效地控制了MS感染，降低了雞群死亡率，延長了產蛋期，提高了雞群產蛋量和飼料轉化率；MS1疫苗由Nobilis公司生產，目前，在該公司已經(jīng)找不到該疫苗的相關信息，該疫苗也未在我國農業(yè)農村部注冊。MS弱毒疫苗雖然可以減輕MS感染引起的臨床癥狀，提高雞的生產性能，但其也存在一些缺點，它只能應用于無MS感染的雞場，這在很大程度上限制了其應用。此外，MS弱毒疫苗具有水平傳播的風險，并可能在同一雞場的圈舍中相互傳播，導致未接種疫苗的禽感染MS。基因工程疫苗因其安全性高、易量產、生產成本低等優(yōu)點，已成為未來MS疫苗研發(fā)方向，因此篩選具有良好免疫效果的抗原就成為了研制基因工程疫苗的關鍵因素。

目前，MS基因工程亞單位疫苗的研究還處于起步階段，因此需要依托大量基因組數(shù)據(jù)為疫苗免疫保護性抗原的篩選提供信息，然而對MS基因組測序分析的文章仍然較為缺乏。因此本文對分離獲得的福建雞滑液囊支原體菌株MS-FJ01進行全基因組測序分析，利用COG、GO 和KEGG等數(shù)據(jù)庫進行了基因功能注釋和富集分析；與GenBank中公布的其他MS分離株的16S rRNA等基因進行進化樹分析比對；對該菌株的耐藥基因、毒力基因等關鍵基因進行分析。研究結果為該病原菌致病性相關分子機制的深入解析以及基因工程亞單位疫苗的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

病料來源于福州某雞場疑似感染MS的病雞腫脹跗關節(jié)腔內容物；改良Frey氏液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基購自青島海博生物公司；0.45 μm過濾器購自Biosharp 公司；SPF雛雞購自廣東新興大華農SPF實驗動物中心；核酸 Marker、2×PCR Master Mix購自Biomed公司；慶大霉素、鏈霉素、林可霉素、泰樂菌素、替米考星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素購自芊守生物科技有限公司。

1.2 雞滑液囊支原體的分離

采集疑似感染MS病雞的關節(jié)液及內容物，接種于改良Frey氏液體培養(yǎng)基中，置37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，待菌液變?yōu)辄S色時，用0.45 μm過濾器過濾后按1∶10的比例重新接種到新的液體培養(yǎng)基，收取第2代菌液用于病原菌鑒定。

1.3 雞滑液囊支原體的鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)觀察 取分離的第2代菌液接種于改良Frey氏固體培養(yǎng)基上，并置于體積分數(shù)為5%的CO培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下培養(yǎng)7 d，于顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.3.2 菌體L型鑒定 菌體L型鑒定方法參照丁美娟2014年《雞滑液囊支原體的分離和鑒定研究》。

1.3.3 活菌計數(shù) 取15支裝有0.9 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基的EP管，在第1管中加入0. 1 mL第2代菌液，充分混勻后從第1管吸出0.1 mL液體加入第2管，再混勻，吸出0.1 mL加入第3管，依次類推，直到第15管。另取2支含1 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基的EP管作為對照，置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，做3組重復。2周后觀察培養(yǎng)基顏色變化，并判定結果。

1.3.4 人工感染鑒定 取分離的第2代菌液0.5 mL，滴鼻點眼0.4 mL，腳墊內注射0.1 mL接種于5日齡SPF雛雞，持續(xù)觀察雞的生長及發(fā)病情況。

1.3.5 分子生物學鑒定 根據(jù)GenBank中登錄的MS基因全序列，使用Primer 5軟件設計合成一對特異性引物，分別為MS-JD506-1：5′-CTTCTATGCTTAAACTTTCC-3′，MS-JD506-2：5′-TAAAGATATTACAACGACAT-3′，預期擴增的目的片段大小為506 bp。并根據(jù)文獻[15]合成目的片段大小為208 bp的一對引物，MS-208-F：5′-GAAGCAAAATAGTGATATCA-3′，MS-208-R：5′-GTC-GTCTCCGAAGTTAACAA-3′。用MS特異性引物PCR擴增此分離株。采用20 μL PCR體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，無菌水8 μL，上下游引物各0.5 μL，菌液1 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。

1.4 最小抑菌濃度(MIC)測定

參考Hannan推薦的微量稀釋法測定分離株MIC。

1.5 MS-FJ01總基因組的提取

取MS-FJ01菌液5 mL接種于含45 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基的離心管中，在37 ℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)期后，在15 000 ×4 ℃條件下離心30 min 收集MS-FJ01沉淀物，超純水清洗1遍后，再次離心收集MS-FJ01沉淀物。參照OMEGA細菌基因組抽提試劑盒步驟提取MS-FJ01的總DNA，利用微量紫外分光光度計測定DNA濃度。

1.6 MS-FJ01測序、組裝

使用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，將檢驗合格的基因組DNA隨機打斷、消化、修復，之后使用0.45X的PB磁珠進行二次篩選純化，獲得測序文庫。對文庫質量進行檢測，結果達到要求后，使用PacBio Sequel Ⅱ 進行文庫的測序，然后使用SMRT LINK 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，并使用Illumina二代測序進行補充和準確性復核。

采用Microbial Assembly(smrtlink8)、HGAP4軟件(smrtlink8)和Canu(v1.6)軟件對純三代數(shù)據(jù)結果進行組裝，通過 Glimmer(v3.02)軟件對組裝結果進行基因模型預測。

1.7 基因功能的注釋

利用tRNAscan-SE(v2.0)，RNAmmer(v1.2)進行細菌基因組的tRNA、rRNA的預測；使用trf409.legacylinux64軟件預測基因組中串聯(lián)重復序列(TRF)；利用MinCED(v0.3.2)對細菌基因組進行成簇規(guī)律間隔的短回文重復序列(CRISPR)結構預測；利用軟件IslandPath-DIOMB預測基因組的基因島；采用PhiSpy(v2.3)軟件預測基因組中的前噬菌體結構；預測到的編碼序列利用NR(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db)、SwissProt(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)、COG(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/COG)、KEGG(http://www.kegg.jp/orhttp://www.genome.jp/kegg/)、GO(http://www.geneontology.org)、CARD(http://arpcard.mcmaster.ca)、CAZy(http://www.cazy.org/)、PHI(http://www.phi-base.org/index.jsp)、VFDB(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)、TCDB(http://www.tcdb.org/)、RMS(http://rebase.neb.com/rebase/rebase)進行比對，注釋功能基因。使用軟件EffectiveT3(v2.0.2)進行T3SS效應蛋白的注釋。

1.8 比較基因組學

在全基因組測序的基礎上，將MS-FJ01的Eno和16S rRNA基因分別登錄NCBI，通過BLAST與GenBank中的已知序列比對，選取HN01、G3、A4、WVU1853等十幾株相似性高的MS相應基因序列，利用MEGA7軟件構建系統(tǒng)進化樹。將MS-FJ01的基因信息與NCBI上已公布的15個完整菌株進行比對。使用MUMmer軟件對MS-FJ01和中國流行株HN01和5-9基因組進行共線性比較。

2 結 果

2.1 雞滑液囊支原體的分離鑒定

取過濾后的菌種接種于改良Frey氏固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后在顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)細小、光滑、致密的小菌落，表現(xiàn)為“煎蛋樣”，半凹陷于培養(yǎng)基內(圖1)。菌體L型鑒定的結果顯示為陰性；活菌計數(shù)不低于10CCU·mL。

圖1 雞滑液囊支原體菌落圖Fig.1 Colony diagram of Mycoplasma synoviae in chicken

取過濾后的菌種攻毒SPF雛雞，25 d后可發(fā)現(xiàn)感染雞出現(xiàn)精神沉郁、跛行、癱瘓、膝關節(jié)發(fā)炎腫大、關節(jié)和氣囊內有干酪樣沉積物等明顯的病變(圖2)。

圖2 雞滑液囊支原體攻毒至SPF雞后出現(xiàn)的病變Fig.2 Pathological changes of Mycoplasma synoviae in SPF Chickens

用MS特異性引物PCR擴增此分離株，能擴增出約506和208 bp的特異性片段(圖3)。通過以上各項鑒定結果表明，所分離的菌株符合MS特性。收集60～100 mL培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液，離心收集菌體沉淀物，并進行凍干保存，送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏。所述的雞滑液囊支原體其分類命名為MS-FJ01，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC No.: M 2021210。

M.DNA相對分子質量標準；1.本研究設計引物的鑒定結果；2.引用參考文獻[15]的引物鑒定結果M.DNA Marker; 1. The identification results of primers designed in this study; 2. The identification result of primers quoted from references [15]圖3 雞滑液囊支原體核酸電泳鑒定圖Fig.3 Electrophoretic identification of Mycoplasma synoviae in chicken

2.2 MS-FJ01對抗菌藥物敏感性試驗

通過微量肉湯稀釋法，測得泰樂菌素、替米考星素等8種抗菌藥物對MS-FJ01的MIC。試驗結果表明，MS-FJ01對氟喹諾酮類耐藥，而四環(huán)素和泰樂菌素對其則有較好的抑制作用。

2.3 MS-FJ01的基本信息

MS-FJ01總DNA提取濃度≥50 ng·μL，樣品純度：OD/OD=1.85，OD/OD=2.0。使用三代測序得到MS-FJ01的基因組全長為795 381 bp，GC含量為28.39%，編碼基因704個，34個 tRNA以及7個rRNA。MS-FJ01基因組的圈圖如圖4所示。

圈圖從外到內第1圈為基因組大?。坏?圈散在分布的點為限制性修飾酶分布情況；第3圈和第4圈分別為正鏈和負鏈的堿基修飾；第5圈和第6圈分別為正鏈和負鏈上的CDS；第7圈為tRNA和rRNA的分布；第8圈為GC-skew值，一般前導鏈GC-skew>0，后滯鏈GC-skew<0，也可以輔助判斷復制起點(累計偏移最小值)和終點(累計偏移最大值)，尤其對環(huán)狀基因組最為重要；最內圈為GC含量，向外部分表示該區(qū)域的GC含量高于基因組的平均水平，向內部分表示該區(qū)域的GC含量低于基因組的平均水平The first circle of the circle from outside to inside is genome size; The scattered points in the second circle are the distribution of restrictive modification enzymes. The third and fourth circles are the base modification of plus and minus chains respectively. The fifth and sixth circles are CDS on the positive and negative chains respectively; The seventh circle is the distribution of tRNA and rRNA. The eighth circle is GC-skew value, generally leading chain GC-skew>0, lag chain GC-skew<0, which can also assist in determining the starting point (minimum cumulative offset) and end point (maximum cumulative offset) of replication, especially for circular genomes. The innermost circle is GC content, with the outward part indicating that GC content in this region is higher than the average level of the genome, and the inward part indicating that GC content in this region is lower than the average level of the genome圖4 MS-FJ01基因組圈圖Fig.4 Genome circle of MS-FJ01

本研究預測TRF有79個，TRF的長度變化范圍從1～500 bp不等，表現(xiàn)出種屬組成特異性，可作為物種的遺傳性狀、進化關系的研究。預測CRISPR序列2個，CRISPR序列存在于許多細菌和古細菌中，其與CRISPR相關基因構成CRISPR-Cas系統(tǒng)，目前的研究證明，該系統(tǒng)很可能是原核細菌抵御外來入侵者重要的防御系統(tǒng)。

基因島與多種生物功能相關，因此一直以來都是研究的熱點，本研究預測到3個基因島。前噬菌體序列的存在可能會允許一些細菌獲取抗生素抗性，增強對環(huán)境的適應性，提高黏附力或使細菌成為致病菌，本研究預測出1個前噬菌體結構。MS-FJ01全基因組數(shù)據(jù)已收錄GenBank，收錄號為CP079705。

2.4 基因功能注釋分析

為進一步解析MS-FJ01基因組的功能，將其基因組序列在COG、GO和KEGG共3個數(shù)據(jù)庫中進行注釋。

2.4.1 COG數(shù)據(jù)庫注釋 COG數(shù)據(jù)庫按照基因功能分為25大類，每一個COG類別均由直系同源序列構成。因此，通過序列相似性比對，可以將某個蛋白序列歸類于某一COG簇中，從而可以推測該序列的功能。作者將預測基因的蛋白序列比對到COG庫。如圖5所示，在MS-FJ01基因組中與翻譯、核糖體結構和生物起源相關的基因最多，有133個基因；與復制、重組和修復相關的基因次之，有50個基因；與細胞運動和次生代謝產物生物合成、轉運和分解代謝相關的基因最少，各僅有1個基因；但仍有7個功能未知的基因。

C. 能量的產生和轉化；D. 細胞周期調控、細胞分裂和染色體分區(qū)；E. 氨基酸的轉運和代謝；F. 核苷酸的轉運和代謝；G. 碳水化合物的運輸和代謝；H. 輔酶的運輸和代謝；I. 脂質運輸和代謝；J. 翻譯、核糖體結構和生物發(fā)生；K. 轉錄；L. 復制、重組和修復；M. 細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生；N. 細胞運動；O. 翻譯后修飾、蛋白質更新和伴侶蛋白；P. 無機離子的運輸與代謝；Q. 次生代謝產物生物合成、轉運和分解代謝；R. 一般功能預測；S. 未知功能；T. 信號轉導機制；U. 細胞內運輸、分泌和囊泡運輸；V. 防御機制；X. 噬菌體和轉座子C. Energy production and conversion; D. Cell cycle control. cell division, chromosome partitioning; E. Amino acid transport and metabolism; F. Nucleotide transport and metabolism; G. Carbohydrate transport and metabolism; H. Coenzyme transport and metabolism; I. Lipid transport and metabolism; J. Translation, ribosomal structure and biogenesis; K. Transcription; L. Replication, recombination and repair; M. Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N. Cell motility; O. Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P. Inorganic ion transport and metabolism; Q. Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; R. General function prediction only; S. Function unknown; T. Signal transduction mechanisms; U. Intracellular trafficking secretion, and vesicular transport; V. Defense mechanisms; X. Mobilome: prophages, transposons圖5 MS-FJ01基因組COG注釋統(tǒng)計Fig.5 COG annotation statistics of MS-FJ01 genome

2.4.2 GO數(shù)據(jù)庫注釋 GO數(shù)據(jù)庫將蛋白序列分為3大類：生物過程、分子功能和細胞組分，分別用來描述基因編碼的產物所參與的生物過程、所具有的分子功能及所處的細胞環(huán)境。如圖6所示，MS-FJ01基因組中，在生物過程大類中，與代謝過程(基因數(shù) 249)和細胞過程(基因數(shù) 237)相關的基因最多。在細胞組分大類中，被注釋最多的是細胞(基因數(shù) 170)、細胞部件(基因數(shù) 170)、膜(基因數(shù) 95)以及膜部件(基因數(shù) 91)。在分子功能途徑大類中，與催化活性(基因數(shù) 219)和結合(基因數(shù) 228)相關的基因最多。

圖6 MS-FJ01基因組GO注釋統(tǒng)計Fig.6 GO annotation statistics of MS-FJ01 genome

2.4.3 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋 KEGG是系統(tǒng)分析基因產物和化合物在細胞中的代謝途徑以及這些基因產物功能的數(shù)據(jù)庫；它整合了基因組信息、化合物和小分子信息以及生化反應系統(tǒng)等方面數(shù)據(jù)，主要包括代謝通路、藥物、疾病、功能模型、基因序列及基因組等信息。如圖7所示，MS-FJ01基因主要分為細胞過程、環(huán)境信息加工、遺傳信息加工、人類疾病、代謝及機體系統(tǒng)6大分類。其中，在新陳代謝和遺傳信息處理中占的基因比例較高。在這些類別中，基因富集最多的類別是代謝(基因數(shù)占比34.8%)，主要包括碳水化合物代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝以及核苷酸代謝等。遺傳信息加工富集的基因次之(基因數(shù)占比29.1%)，其中翻譯(基因數(shù) 78)富集的基因最多。六大類中富集最少的是機體系統(tǒng)，僅占全部富集基因數(shù)的1.6%。

圖7 MS-FJ01基因組KEGG注釋統(tǒng)計Fig.7 KEGG annotation statistics of MS-FJ01 genome

2.5 特定功能注釋

將只整合某一類功能相關的數(shù)據(jù)庫和注釋方法劃分到特定功能注釋模塊，該模塊包含耐藥基因(CARD)、碳水化合物相關酶(CAZy)、病原與宿主互作(PHI)、致病菌毒力因子(VFDB)、膜轉運蛋白分類(TCDB)、限制性修飾系統(tǒng)(RMS)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應蛋白(T3SS)。

2.5.1 MS-FJ01基因組CARD數(shù)據(jù)庫注釋 CARD(The Comprehensive Antibiotic Resistance Database)是目前使用最為廣泛的細菌耐藥基因數(shù)據(jù)庫。因此使用CARD數(shù)據(jù)庫做耐藥基因注釋，本研究在CARD庫注釋到了40個細菌耐藥基因。其中對四環(huán)素具有抗性的基因最多(基因數(shù)7)，此外，基因具有多抗生素耐藥性。詳見表1。

2.5.2 MS-FJ01基因組CAZy數(shù)據(jù)庫注釋 CAZy全稱為Carbohydrate-Active enZYmes Database，碳水化合物酶相關的專業(yè)數(shù)據(jù)庫，內容包括能催化碳水化合物降解、修飾、以及生物合成的相關酶系家族。其包含6個主要分類：輔助氧化還原酶(auxiliary activities，AAs)、糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)、糖基轉移酶(glycosyl transferases，GTs)、多糖裂解酶(polysaccharide lyases, PLs)和糖類酯解酶(carbohydrate esterases, CEs)。本研究中，在CAZy庫共注釋到4個基因，其中，3個為糖苷水解酶，1個為糖類酯解酶。

2.5.3 MS-FJ01基因組PHI數(shù)據(jù)庫注釋 PHI全稱為Pathogen Host Interactions Database，病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫， PHI是目前現(xiàn)醫(yī)療、農業(yè)真菌和卵菌候選靶向位點的重要在線資源。在 PHI 數(shù)據(jù)庫中注釋到了136個與宿主互作的基因，97個基因在突變后會導致病原菌致病性的減弱或喪失，15個基因在突變后會使得病原菌的致病性增強。

2.5.4 MS-FJ01基因組VFDB數(shù)據(jù)庫注釋 VFDB數(shù)據(jù)庫全稱為Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，用于專門研究致病細菌、衣原體和支原體致病因子的數(shù)據(jù)庫。在本研究MS-FJ01共有47個基因與細菌毒力相關，其中，序列相似度在40%以上的基因只有3個，分別為膽堿激酶、脂酸蛋白連接酶和ABC(ATP結合盒)轉運體CylA，其他基因序列相似度均低于40%。另外,作者還挖掘到DnaK、PDHA、PDHB、Eno、GapA、PK、FBA、NOX等多個與細菌黏附相關的基因。

2.5.5 MS-FJ01基因組TCDB數(shù)據(jù)庫注釋 TCDB是對膜轉運蛋白(Membrane Transport Protein)進行分類的一個數(shù)據(jù)庫，它制定了一套轉運蛋白分類系統(tǒng)(Transporter Classification), 簡稱TC System，TC系統(tǒng)除了對膜轉運蛋白進行分類，同時還提供了其功能和進化信息。本研究共注釋到106個與膜轉運蛋白相關的基因，其中,與初級活性轉運體相關的基因最多(基因數(shù) 64)。

2.5.6 MS-FJ01基因組RMS數(shù)據(jù)庫注釋 RMS主要由限制性內切酶(restriction enzymes)及甲基化轉移酶(methyltransferase)兩部分所構成。限制修飾系統(tǒng)按照組成功能上的差異主要分為基本的四種類型，分別是Type I systems、Type II systems、Type III systems、Type IV systems。該系統(tǒng)對自身基因組某些Motif的修飾可能會對其基因表達及生長代謝調控有非常重要的作用。REBASE包含大量限制修飾系統(tǒng)的分類、識別修飾、識別切割位點等信息。在本研究,中Ⅲ型甲基化轉移酶(基因數(shù) 8)和Ⅲ型限制性內切酶(基因數(shù) 7)注釋的基因數(shù)最多。

2.6 比較基因組學分析

2.6.1 進化樹分析 MS的烯醇化酶(Eno)是一種重要的黏附相關因子，對宿主細胞的黏附、定植和侵襲有著重要作用。因此作者使用MS的和16S rRNA基因的DNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。參考菌株與MS-FJ01的16S rRNA序列構建的進化樹拓撲結構顯示，MS-FJ01與2020年分離的中國寧夏菌株5-9親緣關系最近，而與2018年分離的河南菌株HN01、韓國菌株G3、A4和模式MS菌株WVU1853等親緣關系則較遠，在基于的進化樹拓撲結構中顯示出的結果也表明MS-FJ01與MS 5-9菌株親緣關系最近(圖8)。

A. MS-FJ01的16S rRNA系統(tǒng)進化樹；B. MS-FJ01的Eno系統(tǒng)進化樹A. 16S rRNA phylogenetic tree of MS-FJ01；B. Eno phylogenetic tree of MS-FJ01圖8 MS-FJ01的系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of MS-FJ01

2.6.2 MS-FJ01與MS菌株基因組基本信息對比 本研究將MS-FJ01相關基因信息與GenBank中已公布的15個MS菌株的完整基因組序列進行比較分析，該菌株基因信息與已公布的MS參考菌株基本相似，只有編碼基因的數(shù)目少于其他菌株。

2.6.3 基因組共線性分析 MS-FJ01與中國流行株HN01和5-9基因組進行比對，確認基因組序列之間的共線性關系及結構變異情況，由圖9可知MS-FJ01與5-9基因組共線性程度明顯高于HN01基因組；相比于5-9基因組，HN01存在較多基因倒置、缺失和分布不同。

A.MS-FJ01和HN01基因組共線性分析；B. MS-FJ01和5-9基因組共線性分析A.Genomic collinearity analysis of MS-FJ01 and HN01；B. Genomic collinearity analysis of MS-FJ01 and 5-9圖9 MS-FJ01共線性分析Fig.9 MS-FJ01 collinearity analysis

3 討 論

本研究通過三代聯(lián)合二代測序技術，對MS-FJ01進行了全基因組精細測序，并對該基因組的基本特征進行了分析。MS目前已有15個完整基因組被公布，但相同物種的不同菌株在基因和蛋白結構上仍存在差異。本研究將MS-FJ01基因組預測基因的蛋白序列比對到NR數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)所有蛋白序列匹配的同源蛋白相似度最高分別是支原體屬(53.9%)和雞滑液囊支原體 (34.54%)。之后又將預測基因的蛋白序列比對到SwissProt數(shù)據(jù)庫進行驗證，發(fā)現(xiàn)相似度最高的物種仍然是雞滑液囊支原體(29.6%)，剩余的相似性大部分都屬于支原體屬，包括肺炎支原體、生殖支原體等。

作者在MS-FJ01基因組的編碼基因中預測到長度為1 010 bp的煙酸磷酸核糖基轉移酶和長度為674 bp的3-磷酸甘油?；D移酶，Yongjun等在韓國分離株的基因組中發(fā)現(xiàn)這兩種編碼序列僅存在于NAD非依賴性MS的基因組中。Yagihashi等在日本發(fā)現(xiàn)的菌株也具有NAD非依賴性。MS-FJ01是否具有NAD非依賴性還有待后續(xù)試驗進行驗證，如果MS-FJ01等中國菌株具有NAD非依賴性，那么NAD非依賴性則可能是亞洲MS菌株的共同特征，這一發(fā)現(xiàn)不僅可以降低MS的培養(yǎng)成本，還可以引起人們對亞洲MS菌株的研究興趣在CARD數(shù)據(jù)庫，作者預測到、等多個氟喹諾酮類耐藥基因，MIC結果也驗證了MS-FJ01對其耐藥，這可能是由于臨床上常使用大環(huán)內酯類、氟喹諾酮類抗生素對MS感染進行治療，從而導致MS對氟喹諾酮類抗生素耐藥性嚴重。此外，作者注釋到MsbA具有多藥耐藥性，MsbA是一種多藥耐藥轉運蛋白同源物，屬于含有三磷酸腺苷結合盒的轉運蛋白超家族，該盒也被稱為核苷酸結合域(NBD)。MsbA是革蘭陰性菌中必不可少的ATP結合盒轉運蛋白，可將脂質A和脂多糖從細胞質小葉運輸?shù)絻饶さ闹苜|小葉，而脂質A是細菌細胞外膜的主要成分，也是唯一對細胞活力至關重要的細菌ABC轉運蛋白，可以作為新抗生素的可行靶點進行深入研究。

在CAZy庫，作者注釋到4個基因，其中,3個為糖苷水解酶，研究表明，糖苷水解酶通過水解糖苷鍵，釋放糖類產物，用于生物體代謝途徑。糖基轉移酶參與細胞內多種生命活動，將體內活性物質的單糖部分轉移到蛋白質、脂質、糖和核酸中形成糖基化。這些酶在生物體的次級代謝活動中起著不可替代的作用。

支原體的侵襲性由表面的黏附素、輔助蛋白、莢膜多糖、侵襲性酶和生物被膜介導；而黏附是支原體感染過程中的初始步驟，也是確保它們在宿主體內定植和傳播的重要步驟。

在MS-FJ01基因組中挖掘出、、、、、、、等與黏附素相關的基因，這些都與其他支原體相同，如肺炎支原體、牛支原體、豬肺炎支原體、雞毒支原體等。在VFDB數(shù)據(jù)庫，注釋到相似度最高的33號基因(基因相似性41.67%)編碼磷酸膽堿，磷酸膽堿可以作為HepI或HepIII的末端部分摻入并修飾脂多糖，通過與上皮細胞上的血小板激活因子 (PAF) 受體結合而增加了對抗菌肽(人導管素LL-37)的抗性與黏附性；由于磷酸膽堿表達是相位可變的，因此可以促進逃避抗原特異性宿主免疫防御，并在不同宿主微環(huán)境中定植。

4 結 論

從福州雞場疑似感染雞滑液囊支原體的病雞中分離到一株福建雞滑液囊支原體菌株MS-FJ01，通過三代聯(lián)合二代測序技術對MS-FJ01進行全基因組測序，經(jīng)過拼接后得到細菌基因組完成圖，測序結果顯示MS-FJ01全長為795 381 bp，GC含量為28.39%；預測編碼基因數(shù)為704個，GC含量為28.64%；共鑒定出34個tRNA和7個rRNA；通過數(shù)據(jù)庫對組裝基因進行COG、GO和KEGG富集及分析，其中，在COG數(shù)據(jù)庫注釋到476個基因，GO數(shù)據(jù)庫注釋到382個基因，KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到425個基因。在抗生素抗性基因中發(fā)現(xiàn)的多藥耐藥基因MsbA可能成為新抗生素的潛在靶點；在毒力基因中發(fā)掘到多個與黏附相關的基因，其在MS入侵宿主中可能有著至關重要的作用；對這些基因的注釋將有助于全面認識MS致病相關基因及其與宿主互作過程中的致病性。