郭子涵，秦春力，張芳芳，趙 娜，王 彬，賀稚非，李洪軍,5，呂景智*

(1.西南大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生物飼料與分子營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715； 2. 四川省巴中市巴州區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，巴中 636000； 3. 四川省巴中市巴州區(qū)畜牧站，巴中 636000； 4. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715； 5. 川渝共建特色食品重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

近年來，肉兔作為畜產(chǎn)品、寵物和科研實(shí)驗(yàn)動物的重要來源，出欄量逐年提高，對運(yùn)輸?shù)男枨笠蚕鄳?yīng)加大。道路運(yùn)輸是畜禽常見的一種應(yīng)激源，粗暴裝籠、混群、斷水?dāng)嗍?、不良?xì)馕丁⒃胍?、擁擠和遠(yuǎn)途等惡劣的運(yùn)輸條件給家畜帶來了諸多應(yīng)激。在運(yùn)輸途中，肉兔血液中皮質(zhì)酮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、葡萄糖、紅細(xì)胞壓積、肌酸激酶、乳酸、乳酸脫氫酶、總蛋白等的濃度隨之發(fā)生變化。運(yùn)輸還提高了肌肉的滴水損失，影響肌肉的構(gòu)形參數(shù)與肉色，但不影響pH、吸水力和剪切力。另外，道路運(yùn)輸應(yīng)激還提高了家畜的站立、排尿和排糞等行為的頻次和持續(xù)時間，降低了興奮性，使家畜表現(xiàn)出抑郁樣行為。一般來說，家畜被運(yùn)輸?shù)酵涝讏龊蟛⒉恢苯油涝?，而是在屠宰場入欄靜養(yǎng)一段時間，這樣有助于家畜從應(yīng)激中恢復(fù)。屠宰前禁食與肉質(zhì)、胴體重和肉類安全性有關(guān)，是目前動物生產(chǎn)中常用的措施。運(yùn)輸后禁食可提高肉色、pH和系水力。研究表明，屠宰前48 h內(nèi)禁食能最大限度地減少不良微生物的生長。然而，有學(xué)者認(rèn)為屠宰前的禁食和非禁食與胴體微生物感染無關(guān)，胴體污染可能是由不同的肉類包裝工廠的工藝和操作不同所導(dǎo)致的。屠宰前禁食增加了DFD肉的發(fā)生率，降低了胴體質(zhì)量。同時，運(yùn)輸前禁食會使動物饑餓，沮喪、疲勞和興奮增加，家畜裝載時抗拒和喊叫更加明顯，而在屠宰場入欄期間提供飲食可以一定程度上緩解家畜的應(yīng)激。所以，探索合理的運(yùn)輸后處理方式，尋找緩解肉兔運(yùn)輸后應(yīng)激的措施是非常必要的。本試驗(yàn)從肉兔血清生化指標(biāo)、肉品質(zhì)、應(yīng)激基因表達(dá)和行為等方面探究運(yùn)輸后禁食、非禁食對肉兔應(yīng)激的影響，希望能提高肉兔的福利水平，減少運(yùn)輸應(yīng)激造成的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)動物

將80只體重(2.5±0.5) kg的伊拉公兔隨機(jī)分為8個組：對照組(不運(yùn)輸)、運(yùn)輸后0 h組(運(yùn)輸后與對照組一起立即屠宰)、禁食6 h組、禁食24 h組、非禁食6 h組、非禁食24 h組、禁食行為觀察組(不屠宰)和非禁食行為觀察組(不屠宰)，每組10只肉兔。預(yù)試期為7 d。運(yùn)輸籠的大小為750 mm × 550 mm × 270 mm，裝載密度為10 只·籠。在試驗(yàn)當(dāng)日6:00，將肉兔經(jīng)貨車以80 km·h的平均時速運(yùn)輸2 h后返回兔場后，并被轉(zhuǎn)移至兔籠中。禁食組不采食飼料，非禁食組自由采食，但均可自由飲水。除行為觀察組外，在運(yùn)輸后0、6、24 h將其余各組的肉兔分批屠宰。使用?？低?200萬高清星光攝像頭攝像記錄2個行為觀察組運(yùn)輸后36 h內(nèi)的行為變化。

1.2 飼養(yǎng)管理

將兔舍定期清掃并嚴(yán)格消毒，兔舍采用自然光照、定時通風(fēng)，室內(nèi)溫度為(22±2)℃。每個兔籠裝兩只肉兔。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 血清生化指標(biāo)的測定 將肉兔頸部脫臼處死后倒掛，用10 mL離心管收集血液。血液在室溫靜置30 min后，3 500 r·min離心10 min后采集血清，在-80 ℃冰箱保存。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、總蛋白(TP)、葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)等的含量在Olympus AU400全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.3.2 血清激素水平測定 用雙抗體夾心法原理測定血清中皮質(zhì)醇的含量，試劑盒來自武漢華美生物工程有限公司。

1.3.3 肉品質(zhì)測定 將肉兔屠宰后取背最長肌，裝在自封袋中，保存在4 ℃冰箱中，于24 h后測定肌肉的pH、肉色、失水率、蒸煮損失率和剪切力。使用pH-STAR直測儀測定pH，使用UltraScan PRO測色儀測定肉色，用GR-150 Warner-Bratzler剪切力儀測定剪切力，指標(biāo)的測定方法參照NY/T 1333—2007《畜禽肉質(zhì)的測定》。

1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR 在采樣時，用錫箔紙包裹肝組織樣品后，快速投入液氮中冷凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱。通過GenBank查找并設(shè)計(jì)、-3基因的引物序列(表1)，由華大基因科技服務(wù)有限公司合成。RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABM生物科技有限公司，熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司。25 μL的PCR反應(yīng)體系為Hotstart Fluo-PCR mix 12 μL、 上游和下游引物(25 μmol·L)各1 μL、cDNA 1 μL和ddHO 10 μL。用BIO-RAD CFX實(shí)時熒光定量PCR儀測定基因表達(dá)水平，儀器設(shè)置的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。每個樣品設(shè)3個技術(shù)重復(fù)。

表1 引物序列

1.3.5 兔行為學(xué)觀測 用攝像頭全程記錄行為觀察組肉兔在運(yùn)輸后的行為，行為定義參考Prebble等的方法。為掌握肉兔運(yùn)輸后36 h內(nèi)的行為變化，于每天7:00、13:00、18:00和24:00進(jìn)行觀察，每次持續(xù)30 min，記錄并計(jì)算觀察期內(nèi)各行為發(fā)生累計(jì)時間或頻次占總觀察時間或頻次的百分率。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，其中行為學(xué)數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，其他試驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素ANOVA法進(jìn)行分析，分析結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，后用Duncan法進(jìn)行多重比較。<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 運(yùn)輸后禁食與非禁食對肉兔應(yīng)激水平的影響

如表2所示，運(yùn)輸后0 h組兔血清TP濃度相對于對照組顯著降低(<0.05)，而血清皮質(zhì)醇濃度相對于對照組顯著升高(<0.05)。禁食6 h組兔血清LDH水平(<0.01)和禁食24 h組兔血清CK水平(<0.05)顯著高于對照組，禁食24 h組兔血清Glu水平顯著低于對照組(<0.05)。與禁食組相比，非禁食6 h組兔的血清LDH水平(<0.01) 和非禁食24 h組兔血清CK水平(<0.05)顯著降低，而非禁食24 h組血清Glu濃度顯著升高(<0.05)。

2.2 運(yùn)輸后禁食與非禁食對肉兔肌肉品質(zhì)的影響

表3所示，和對照組相比，運(yùn)輸后0 h背最長肌pH顯著上升(< 0.05)，肌肉值顯著降低(<0.05)，值極顯著下降(<0.01)，值則無顯著變化(>0.05)。運(yùn)輸后6 h和運(yùn)輸后0 h相比，pH、值和剪切力顯著下降(<0.05)，禁食6 h 組和非禁食6 h組之間的pH、、和值差異不顯著(>0.05)，但非禁食24 h組的、和值顯著高于禁食24 h組(<0.05)。各處理組之間背最長肌失水率和蒸煮損失率的差異并不顯著(>0.05)。背最長肌的剪切力隨著時間的增長而依次顯著降低(<0.05)，但禁食組與非禁食組間無顯著差異(>0.05)。

2.3 運(yùn)輸后禁食與非禁食對JNK通路mRNA表達(dá)的影響

如圖1所示，運(yùn)輸后0 h組和-3的mRNA表達(dá)量顯著高于對照組(<0.05)。非禁食組的mRNA表達(dá)量顯著低于禁食組(<0.05)， 但禁食與非禁食組間的-3 mRNA 的表達(dá)水平并無顯著差異(>0.05)。

柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Column with different lowercase letters mean significant differences among treatments (P<0.05)圖1 非禁食和禁食對運(yùn)輸后肉兔肝JNK和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.1 Effects of non-fasting and fasting on the expression of JNK and Caspase-3 mRNA in liver of rabbits after transportation

2.4 運(yùn)輸后禁食與非禁食對肉兔行為的影響

由表4和表5可知，非禁食組肉兔進(jìn)食頻次極顯著高于禁食組、食糞行為頻次極顯著低于禁食組(<0.01)，非禁食組進(jìn)食行為和飲水行為的持續(xù)時間顯著高于禁食組(<0.05)，而食糞行為的持續(xù)時間顯著低于禁食組(<0.05)。

表4 非禁食和禁食對運(yùn)輸后肉兔行為頻次的影響

表5 非禁食和禁食對運(yùn)輸后肉兔行為時間的影響

3 討 論

3.1 運(yùn)輸后非禁食對血清生化和血清激素的影響

運(yùn)輸過程中產(chǎn)生的系列應(yīng)激使動物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和代謝遭到破壞，導(dǎo)致血液中ALT、AST、CK、皮質(zhì)醇、Glu、TP、乳酸等的濃度產(chǎn)生波動。公路運(yùn)輸常會導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)活動增加，血液中皮質(zhì)醇的增加是衡量家畜心理壓力的一個指標(biāo)，是高度可變的。Kannan等發(fā)現(xiàn)，綿羊血清皮質(zhì)醇在運(yùn)輸后0 h上升，靜養(yǎng)一段時間后又顯著下降，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。運(yùn)輸過程中的捕獲、裝載和應(yīng)激造成家畜肌肉融合不良、缺氧、疲勞，導(dǎo)致了肌膜通透性增加，細(xì)胞中AST、ALT、CK和LDH流失，而本試驗(yàn)中肉兔血清ALT、AST和CK在運(yùn)輸前后并沒有顯著的變化，可能是由于運(yùn)輸前未禁食，營養(yǎng)相對充足，肉兔沒有饑餓感，抗拒較少的原因。在本試驗(yàn)中，非禁食24 h組肉兔血清 CK濃度、禁食6 h組血清的LDH濃度顯著低于禁食組，而非禁食24 h組血清Glu顯著高于禁食組。CK催化高能磷酸鍵從ATP轉(zhuǎn)移到肌酸上的可逆反應(yīng)，可以在能量匱乏期間維持適當(dāng)?shù)腁TP/ADP比例以提供短期活動的能量。LDH作為糖酵解的關(guān)鍵酶會在運(yùn)動后上升，也與細(xì)胞損傷有關(guān)。葡萄糖參與能量代謝，也可以作為量化應(yīng)激的有效指標(biāo)。糖異生與糖皮質(zhì)激素的增加有關(guān)，在應(yīng)激條件下糖原分解增加，血液中葡萄糖的濃度也隨之增加。本研究，肉兔血清CK、LDH和葡萄糖的數(shù)據(jù)表明，非禁食顯著改善了肉兔運(yùn)輸后的能量匱乏與機(jī)體損傷。Parker等發(fā)現(xiàn)，家畜在運(yùn)輸過程中脫水時，運(yùn)輸后血液TP的濃度會增加。但本試驗(yàn)中運(yùn)輸卻導(dǎo)致TP濃度顯著下降，可能是由于試驗(yàn)當(dāng)天溫度(15～20 ℃)適宜，與de la Fuente等描述的運(yùn)輸中高溫脫水導(dǎo)致的血液中TP上升的狀況不同，血清TP水平隨著血清皮質(zhì)醇水平的降低逐漸升高。本試驗(yàn)中，血清CK、LDH的變化趨勢與血清皮質(zhì)醇相一致，TP的變化趨勢卻與血清皮質(zhì)醇相反，對于它們之間的聯(lián)系還有待研究。

3.2 運(yùn)輸后非禁食對肌肉肉品質(zhì)的影響

屠宰前的應(yīng)激會影響兔肉的品質(zhì)。肌肉pH是衡量疲勞的有效指標(biāo)，也與肉的嫩度、色澤密切相關(guān)。肌肉的糖原濃度隨著運(yùn)輸應(yīng)激的增加而不斷降低，屠宰后24 h肌肉pH取決于肌肉最初糖原的含量，肌糖原含量越低，pH越高。本試驗(yàn)中肉兔在運(yùn)輸應(yīng)激下，肌糖原快速消耗導(dǎo)致肌肉pH顯著升高(<0.05)。Brown等發(fā)現(xiàn)，長途運(yùn)輸后肌肉的pH增高，并在屠宰前仍保持較高的水平，與本試驗(yàn)中運(yùn)輸后6、24 h后肌肉pH仍較高的結(jié)果一致。然而，本研究中運(yùn)輸后禁食、非禁食對肌肉pH影響并不顯著。有研究發(fā)現(xiàn)，持水力依賴于肌肉的pHu(屠宰后24 h的pH)，當(dāng)5.2

3.3 運(yùn)輸后非禁食對肝JNK和Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

在運(yùn)輸應(yīng)激造成機(jī)體損傷的過程中，應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路發(fā)揮了重要的作用。c-Jun N末端激酶(JNK)是MAPK家族的應(yīng)激激活蛋白激酶，響應(yīng)多種應(yīng)激信號，與多種細(xì)胞事件有關(guān)，通過不同的下游效應(yīng)物介導(dǎo)自噬與凋亡。-3是JNK下游重要的效應(yīng)因子，觸發(fā)細(xì)胞調(diào)亡。本試驗(yàn)中運(yùn)輸后0 h肉兔肝組織-3的mRNA表達(dá)量顯著高于對照組(<0.05)，在6、24 h后-3 mRNA相對表達(dá)量逐漸下降，而禁食與非禁食組間沒有顯著差異。-3 mRNA的表達(dá)與血清皮質(zhì)醇的濃度變化相一致，表明運(yùn)輸應(yīng)激激增導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，應(yīng)激的緩解會降低細(xì)胞凋亡。但是，的mRNA相對表達(dá)量與-3和皮質(zhì)醇的mRNA表達(dá)量變化趨勢并不一致，說明JNK通路還可能介導(dǎo)了其他細(xì)胞活動如自噬的發(fā)生。自噬是循環(huán)利用細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物使機(jī)體適應(yīng)饑餓的一種機(jī)制，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。自噬主要由mTOR通路調(diào)節(jié)，mTOR可以激活MAPK8/9，MAPK8/JNK1通過磷酸化BCL2，破壞了BCL2與BECN1的相互作用(BECN1與自噬相關(guān))，并啟動BECN1依賴的自噬。本試驗(yàn)中非禁食組肝組織中mRNA的相對表達(dá)量顯著低于禁食組，表明非禁食比長時間禁食更能有效減少機(jī)體由于細(xì)胞自噬和凋亡造成的損傷。

3.4 運(yùn)輸后非禁食對肉兔行為的影響

行為是機(jī)體最重要的適應(yīng)機(jī)制之一，是動物適應(yīng)應(yīng)激的身體防御，有助于減輕應(yīng)激，也有可能因應(yīng)激過強(qiáng)而導(dǎo)致機(jī)制性死亡。應(yīng)激與行為緊密相連，刻板行為比如啃咬、籠子里踱步、過度修飾通常表明動物的無聊與應(yīng)激。根據(jù)動物不正常行為的描述，家兔過度的社交、啃咬籠具和聞嗅行為都屬于刻板行為。本試驗(yàn)中禁食組和非禁食組肉兔的社交、啃咬籠具和聞嗅行為并無顯著差異，表明非禁食并不能顯著改善肉兔的刻板行為，這與表3中血清皮質(zhì)醇的結(jié)果相互印證，說明非禁食并沒有通過降低應(yīng)激的方式改變刻板行為。禁食組食糞行為顯著提升，食糞行為是中小型食草動物在長期的適應(yīng)性進(jìn)化過程中為了滿足低營養(yǎng)條件下代謝需要的生理機(jī)制，正常的食糞行為能提高肉兔對蛋白質(zhì)的消化吸收效率，減少腸道菌群及其所含的特殊蛋白質(zhì)的流失，禁止食糞抑制肝脂質(zhì)的合成，不利于家兔生長發(fā)育。本試驗(yàn)中禁食組食糞行為比非禁食組多的原因一方面是對進(jìn)食不足的替代，與表3中禁食組和非禁食組血清TG濃度變化的結(jié)果相印證，即禁食組肉兔通過食糞補(bǔ)充血液中脂質(zhì)合成；另一方面是禁食組肉兔饑餓的表現(xiàn)，與禁食組JNK介導(dǎo)細(xì)胞自噬通路的顯著激活結(jié)果一致。非禁食則避免了饑餓，有利于提升肉兔的福利水平。

4 結(jié) 論

和禁食相比，運(yùn)輸后24 h非禁食降低了肉兔的應(yīng)激水平，提高了肌肉品質(zhì)，并一定程度改善肉兔的福利水平。