任 宇，燕文荃，丁玥竹，扈孟雪，周杰瓏，吳培福，陳粉粉，劉莉莉

(西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650224)

牛奶中乳蛋白的含量約為3%～5%，是牛奶的主要成分之一。因其幾乎含有人體所需的全部必需氨基酸并易于吸收，滿足機(jī)體生長(zhǎng)和維持日常生命活動(dòng)的需要，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)牛奶價(jià)值的重要指標(biāo)之一。如何提高牛奶中乳蛋白水平并改善牛奶中乳蛋白致敏性一直是學(xué)術(shù)界的焦點(diǎn)，也是生產(chǎn)者、消費(fèi)者和乳品加工企業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)。因此，通過分子遺傳育種等現(xiàn)代手段改善牛奶中乳蛋白的品質(zhì)是奶牛育種的重要目標(biāo)之一。

乳蛋白主要是由酪蛋白和乳清蛋白組成，是由乳腺上皮細(xì)胞通過細(xì)胞膜上氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體吸收轉(zhuǎn)運(yùn)血液中游離氨基酸而合成。乳蛋白的合成主要在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上開始，然后由信號(hào)肽引導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)進(jìn)行磷酸化和糖基化等化學(xué)修飾，再由分泌泡轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮細(xì)胞頂膜，通過胞吐方式釋放到細(xì)胞外的腺泡腔。乳蛋白的合成受到多個(gè)信號(hào)通路及多種激素相互影響，如：氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白酪氨酸激酶2-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子5(janus tyrosine kinase 2-signal transducer and activator of transcription 5, Jak2-Stat5)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)等信號(hào)通路，胰島素、催乳素和生長(zhǎng)激素等。由此可見，各通路中的信號(hào)傳遞和激素進(jìn)入細(xì)胞后的信號(hào)傳遞過程至關(guān)重要。

28(vacuolar protein sorting 28)是一種液泡蛋白分選基因，是內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)裝置Ⅰ(endosomal sorting complex required for transport-Ⅰ，ESCRT-Ⅰ)的亞單位，與ESCRTs的穩(wěn)定性有關(guān)。泛素化是細(xì)胞中以單泛素蛋白和多泛素蛋白鏈為信號(hào)分子，將泛素蛋白結(jié)合到底物蛋白特定位點(diǎn)的一種翻譯后修飾過程。ESCRTs不僅能識(shí)別泛素化膜蛋白，將其轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體進(jìn)行降解，還參與蛋白酶體對(duì)胞質(zhì)中多泛素化蛋白的降解。在課題組前期研究中，發(fā)現(xiàn)28基因與奶牛乳蛋白率和乳蛋白量均存在極顯著關(guān)聯(lián)(<0.01)，并發(fā)現(xiàn)該基因在奶牛的乳腺組織中特異性高表達(dá)，但28基因?qū)θ榈鞍椎恼{(diào)控尚無相關(guān)研究。因此，本研究以28基因?yàn)槟膛Ｈ榈鞍仔誀畹闹匾蜻x基因，采用RNAi干擾技術(shù)和iTRAQ比較蛋白質(zhì)組學(xué)，分析并試圖闡明28基因調(diào)控乳蛋白合成的分子機(jī)制，為奶牛產(chǎn)奶性狀的分子育種研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)為原實(shí)驗(yàn)室凍存；DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(penicillin-streptomycin solution)購自美國Gibco公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；轉(zhuǎn)染試劑X-treme GENE siRNA Transfection Reagent、SYBR Green Mix購自美國Roche公司；溶酶體抑制劑氯喹CQ(chloroquine，C668)購自美國Sigma-Aldrich公司；蛋白酶體抑制劑環(huán)氧霉素Epox(epoxomicin，BU-4061T)購自美國MCE公司；泛素抗體(ubiquition，sc53509)購自美國Santa Cruz公司；β-actin抗體(66009-Ig)購自美國Proteintech公司；HRS標(biāo)記二抗(7076S)購自美國Cell Signaling Technology公司；蛋白酶體活性檢測(cè)試劑盒(Proteasome-GloChymo-trypsin-Like, Trypsin-Like and Caspase-Like Cell-Based Assays，G1180)購自美國Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將BMECs培養(yǎng)于DMEM/F12全培養(yǎng)基中(含有10%胎牛血清，100 U·mL青霉素-鏈霉素)，并將其置于溫度37 ℃，CO濃度5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到100%時(shí)，用0.25%胰酶進(jìn)行消化并將BMECs以2.5×10個(gè)·孔傳代接種至6孔板中，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.3 BMECs中VPS28基因的敲降

培養(yǎng)BMECs 24 h，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)使用siRNA串聯(lián)片段對(duì)28基因進(jìn)行敲降，首先，用150 μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium分別稀釋2 μg siRNA和20 μL X-treme GENE siRNA Transfection Reagent；然后將二者輕柔混勻并靜置20 min；最后，緩慢滴加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。6 h后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞。

1.4 VPS28基因及乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)量檢測(cè)

結(jié)合KEGG網(wǎng)站(KEGG-Table of Contents, http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html)，本研究選擇乳蛋白合成、泛素化-溶酶體和泛素化-蛋白酶體通路中11個(gè)基因作為候選基因，采用qRT-PCR方法檢測(cè)這11個(gè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的變化(具體基因和引物信息見表1)。以為內(nèi)參基因，采用比較Ct值法即2(△△Ct =目的基因△Ct值-內(nèi)參基因△Ct值)表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。采用美國ABI公司SYBR Green I進(jìn)行定量表達(dá)檢測(cè)。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照SYBR Green I說明書，在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。

表1 目的基因與引物信息

1.5 泛素蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

使用siRNA串聯(lián)片段對(duì)BMECs中28基因進(jìn)行敲降后，收集細(xì)胞提取總蛋白，利用Western blot技術(shù)檢測(cè)敲降前后BMECs中泛素蛋白的表達(dá)水平。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，按40 μg·孔上樣，70 V電泳0.5 h至分離膠處，調(diào)整電壓為120 V 繼續(xù)電泳1 h。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，200 mA 1 h。采用5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入泛素抗體(1∶200) 和β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次，5 min·次。二抗(1∶2 000)搖晃孵育1 h，1×TBST洗滌3次，5 min·次，用ECL發(fā)光液顯影，用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.6 蛋白酶體活性的檢測(cè)

利用蛋白酶體活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)28敲降組和未敲降對(duì)照組中胰蛋白酶樣、糜蛋白酶樣和半胱天冬酶樣蛋白酶活性。配制熒光素酶檢測(cè)液，室溫孵育30 min。將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液加入白壁96孔板中，并加入等體積的檢測(cè)液，室溫孵育10 min 后檢測(cè)相對(duì)熒光信號(hào)值。

1.7 BMECs中溶酶體和蛋白酶體的抑制

取10 mg溶酶體抑制劑氯喹CQ，加入0.387 7 mL超純水，充分混勻配置為50 mmol·LCQ處理液，置于-20 ℃保存；取100 μg蛋白酶體抑制劑Epox，溶于180.27 μL DMSO中，充分混勻配置為1 mmol·L的Epox處理液，置于-20 ℃保存。培養(yǎng)BMECs 24 h，當(dāng)6孔板中細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，在不同孔中分別加入2 μL CQ或20 μL Epox孵育細(xì)胞，24 h收集細(xì)胞。

1.8 比較蛋白質(zhì)組學(xué)的分析

使用siRNA串聯(lián)片段對(duì)BMECs28基因進(jìn)行敲降后，收集細(xì)胞提取總蛋白，利用iTRAQ比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析敲降前后BMECs的差異表達(dá)蛋白。利用在線軟件DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)分析得到的差異蛋白(≤0.8或≥ 1.25倍)進(jìn)行富集分析，并利用在線軟件STRING(https://www.string-db.org/)對(duì)差異蛋白進(jìn)行互作分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組數(shù)據(jù)差異使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，<0.05 時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 敲降VPS28基因后乳蛋白相關(guān)基因、泛素蛋白的表達(dá)水平及蛋白酶體活性

采用串聯(lián)片段的siRNA對(duì)BMECs中28基因進(jìn)行敲降，在成功敲降72%后(圖1A、1B)，檢測(cè)了11個(gè)候選基因的表達(dá)趨勢(shì)，結(jié)果如圖1C所示，酪蛋白基因1S1、2、3、核糖體蛋白8、泛素蛋白基因及蛋白酶體相關(guān)基因3、5表達(dá)水平均顯著上調(diào)(<0.05)，12表達(dá)水平顯著下調(diào)(<0.05)，13、2L差異不顯著；泛素蛋白表達(dá)水平及蛋白酶體活性如圖1D、1E所示，在敲降28基因后，泛素蛋白顯著上調(diào)(<0.05)，蛋白酶體活性下調(diào)。結(jié)果提示，28基因可能通過泛素-蛋白酶體及泛素-溶酶體信號(hào)通路改變細(xì)胞中核糖體合成乳蛋白的水平。

A. 空白細(xì)胞(10×)；B. BMECs中轉(zhuǎn)染siRNAs敲降VPS28基因(10×)；C. 敲降VPS28基因后BMECs中乳蛋白相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平；D. 敲降VPS28基因后BMECs中泛素蛋白的相對(duì)表達(dá)水平；E. 敲降VPS28基因后BMECs中蛋白酶體相對(duì)活性A. Blank cells (10×); B. Knockdown of VPS28 gene by transfection of siRNAs in BMECs (10×); C. Relative expression levels of milk protein-related genes in BMECs after knockdown of the VPS28 gene; D. Relative expression levels of ubiquitin proteins in BMECs after knockdown of the VPS28 gene; E. Relative proteasome activity in BMECs after knockdown of the VPS28 gene圖1 敲降BMECs中VPS28基因及檢測(cè)乳蛋白相關(guān)基因、泛素蛋白的表達(dá)水平及蛋白酶體活性Fig.1 The knockdown of the VPS28 gene with siRNAs in BMECs and detection of the mRNA expression levels of milk protein related genes, ubiquitin protein, and proteasome activity

2.2 抑制蛋白酶體和溶酶體活性后乳蛋白相關(guān)基因表達(dá)水平

為驗(yàn)證28基因可以通過泛素-溶酶體及泛素-蛋白酶體信號(hào)通路改變細(xì)胞中乳蛋白的合成，本研究通過蛋白酶體抑制劑Epox及溶酶體抑制劑CQ抑制細(xì)胞中蛋白酶體及溶酶體活性，并檢測(cè)乳蛋白及核糖體相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示，抑制細(xì)胞中蛋白酶體活性后，細(xì)胞中酪蛋白基因11、2、3的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(<0.05)，核糖體蛋白13的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(<0.05)；抑制細(xì)胞中溶酶體活性后酪蛋白相關(guān)基因表達(dá)不顯著，核糖體相關(guān)基因8顯著上調(diào)(<0.05)。結(jié)果表明，泛素-溶酶體及泛素-蛋白酶體信號(hào)通路確實(shí)可以改變核糖體活性及乳蛋白的合成。

圖2 抑制BMECs中蛋白酶體及溶酶體活性后乳蛋白相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Relative mRNA expression levels of milk protein-related genes after inhibition of proteasome and lysosome activities in BMECs

2.3 敲降BMECs中VPS28基因后的蛋白譜分析

為進(jìn)一步確定28基因通過泛素化途徑調(diào)控BMECs中乳蛋白合成的調(diào)控水平及通路，本研究利用iTRAQ技術(shù)對(duì)敲降28基因后的BMECs進(jìn)行了蛋白譜分析。通過與未敲降的對(duì)照組相比，共發(fā)現(xiàn)129個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中75個(gè)顯著下調(diào)(下調(diào)倍數(shù)≤0.8倍)，54個(gè)顯著上調(diào)(上調(diào)倍數(shù)≥1.25倍)。對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO分析，如圖3A、B所示，在生物學(xué)過程中，下調(diào)蛋白主要富集在細(xì)胞質(zhì)翻譯(GO:0002181)、高密度脂蛋白粒子組裝(GO:0043691)、膽固醇反向運(yùn)輸(GO:0043691)及翻譯(GO:0006412)，上調(diào)蛋白主要富集在基因表達(dá)正向調(diào)控(GO:0010628)及過時(shí)氧化還原過程(GO:0055114)；在細(xì)胞組分中，下調(diào)蛋白主要富集在乳糜微粒(GO:0042627)、胞質(zhì)大核糖體亞基(GO:0022625)、粘著斑(GO:0005925)、細(xì)胞膜(GO:0016020)及細(xì)胞核(GO:0005730)，上調(diào)蛋白主要富集在細(xì)胞外空間(GO:0005615)、漿膜的重要組成部分(GO:0005887)、膜結(jié)構(gòu)組分(GO:0016021)、胞外外泌體(GO:0070062)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜組分(GO:0005789)；在分子功能中，下調(diào)蛋白主要富集在核糖體結(jié)構(gòu)組成(GO:0003735)、rRNA結(jié)合(GO:0019843)、磷脂酰膽堿固醇-甾醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶活化劑(GO:0060228)、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(GO:0017127)、膽固醇酯化的正向調(diào)節(jié)(GO:0010873)及膽固醇結(jié)合(GO:0015485)，上調(diào)蛋白主要富集在核苷酸結(jié)合(GO:0000166)、ATP結(jié)合(GO:0005524)、poly-A-RNA結(jié)合(GO:0044822)及金屬離子結(jié)合(GO:0005506)。對(duì)差異蛋白進(jìn)行KEGG通路分析，如圖3C所示，下調(diào)蛋白主要富集在核糖體(bta03010)、溶酶體通路(bta04142)、剪切體(bta03040)等信號(hào)通路，上調(diào)蛋白主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工(bta04141)、加壓素調(diào)控的水重吸收(bta04962)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(bta04962)和阿爾茲海默癥(bta05010)等通路中。對(duì)差異蛋白進(jìn)行STRING互作分析，如圖3D所示，差異蛋白主要集中在核糖體相關(guān)蛋白的互作上。結(jié)果表明，在BMECs中敲降28基因可以顯著降低核糖體中蛋白質(zhì)的翻譯及溶酶體的功能，同時(shí)可以提高細(xì)胞中基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工合成及泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程。

A. 上調(diào)差異表達(dá)蛋白的GO功能注釋；B. 下調(diào)差異表達(dá)蛋白的GO功能注釋；C. 差異表達(dá)蛋白的KEGG通路分析；D. 差異表達(dá)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析A. GO functional annotation of up-regulated differentially expressed proteins; B. GO functional annotation of down-regulated differentially expressed proteins; C. Analysis of the KEGG pathway of differentially expressed proteins; D. Analysis of interaction networks of differentially expressed proteins圖3 VPS28干擾前后BMECs中差異表達(dá)蛋白的富集分析Fig.3 Enrichment analysis of differentially expressed proteins in BMECs before and after VPS28 interference

3 討 論

本研究以28基因?yàn)橛绊懩膛Ｈ榈鞍仔誀畹闹匾δ芎蜻x基因，在細(xì)胞水平對(duì)該基因進(jìn)行功能研究，試圖解釋28基因調(diào)控乳蛋白合成的重要作用，為該基因的功能研究及奶牛乳蛋白性狀相關(guān)分子遺傳標(biāo)記的篩選提供重要理論依據(jù)。

VPS28是真核細(xì)胞中內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)裝置ESCRTs的亞單位，屬于ESCRT-Ⅰ的頂端帽子結(jié)構(gòu)。VPS28可以通過GLUE結(jié)構(gòu)域直接識(shí)別膜蛋白上的泛素蛋白并與之相結(jié)合，然后召集ESCRT-0、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ組合形成超級(jí)復(fù)合體ESCRTs，再通過多囊體將泛素化的膜蛋白運(yùn)輸至溶酶體中進(jìn)行降解，由此構(gòu)成泛素-溶酶體通路，完成細(xì)胞中膜蛋白的泛素化降解過程。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，泛素-溶酶體通路可以通過泛素化影響泛素-蛋白酶體通路的活性，對(duì)細(xì)胞中泛素-蛋白酶體通路介導(dǎo)的胞質(zhì)泛素化蛋白降解起到一定調(diào)控作用，尤其是當(dāng)細(xì)胞中蛋白酶體活性受限后，泛素-溶酶體信號(hào)通路可被激活以補(bǔ)償、維持細(xì)胞中蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。泛素化是由泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)介導(dǎo)的，將泛素蛋白結(jié)合到底物蛋白特定位點(diǎn)的一種翻譯后修飾過程，可以控制細(xì)胞中蛋白質(zhì)的半衰期和表達(dá)水平。泛素化不僅可以作為信號(hào)傳遞過程中的重要調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞應(yīng)答及新陳代謝等多種細(xì)胞活動(dòng)，還可以直接識(shí)別并標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，使其被有效降解。Mercier和Gaye在1982年研究發(fā)現(xiàn),乳蛋白的合成主要在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體開始，然后由信號(hào)肽引導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)進(jìn)行磷酸化和糖基化等化學(xué)修飾，再由分泌泡轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮細(xì)胞頂膜，最后通過胞吐方式釋放到腺泡腔。28基因可能通過泛素-溶酶體和泛素-蛋白酶體信號(hào)通路影響核糖體的合成過程和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工過程，進(jìn)而影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白的合成。Liu和Zhang等指出，血液中游離的氨基酸、脂肪酸、甘油等物質(zhì)通過主動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入乳腺上皮細(xì)胞，為保證進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)正確，這些物質(zhì)需要通過ESCRTs的分選。綜合以上研究推測(cè)，泛素化信號(hào)通路在調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞合成乳蛋白和乳脂的作用機(jī)制相同。

為驗(yàn)證28基因可能通過泛素-溶酶體和泛素-蛋白酶體信號(hào)通路影響核糖體中乳蛋白的合成，本研究首先利用RNAi干擾技術(shù)對(duì)BMECs中的28基因進(jìn)行有效敲降，然后檢測(cè)酪蛋白、核糖體和蛋白酶體等相關(guān)基因的表達(dá)水平以及泛素蛋白的表達(dá)水平和蛋白酶體活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降28基因后可顯著改變細(xì)胞中酪蛋白和核糖體相關(guān)基因的表達(dá)水平，并可顯著提高泛素蛋白的表達(dá)水平和降低蛋白酶體的活性，與前期研究結(jié)果相同，這表明28基因被敲降后可以通過下調(diào)蛋白酶體活性而提高泛素蛋白在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，這也提示了28基因可能是通過泛素化影響了蛋白酶體活性，進(jìn)而調(diào)控核糖體中乳蛋白的合成。為驗(yàn)證這一結(jié)果，本研究利用溶酶體抑制劑和蛋白酶體抑制劑抑制BMECs中溶酶體和蛋白酶體的活性，再次檢測(cè)酪蛋白和核糖體相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了相同的趨勢(shì)，說明28基因確實(shí)可以通過泛素-溶酶體和泛素-蛋白酶體信號(hào)通路影響B(tài)MECs中乳蛋白的合成。

為進(jìn)一步確定28基因通過泛素化作用對(duì)BMECs中乳蛋白合成的調(diào)控水平及調(diào)控機(jī)制，本研究利用iTRAQ技術(shù)對(duì)敲降前后的BMECs進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。GO分析表明，下調(diào)蛋白主要集中在核糖體翻譯、細(xì)胞質(zhì)翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)等過程中，而上調(diào)蛋白主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞外，具有多種結(jié)合活性。KEGG分析表明，差異表達(dá)蛋白富集在核糖體、溶酶體、剪接體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工、加壓素調(diào)控的水重吸收和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)通路中，其中，下調(diào)蛋白主要富集在核糖體和溶酶體。核糖體不僅是細(xì)胞中翻譯蛋白的主要場(chǎng)所，還積極參與了蛋白質(zhì)的折疊過程，對(duì)于各種功能性蛋白質(zhì)的合成至關(guān)重要。溶酶體是細(xì)胞中酸性的單層膜細(xì)胞器，不僅含有多種水解酶，用于降解細(xì)胞中的膜蛋白質(zhì)、脂類、核酸和多糖等物質(zhì)，還參與了細(xì)胞的胞吞、胞吐和外泌體分泌等過程。當(dāng)細(xì)胞中溶酶體的功能受到抑制可導(dǎo)致線粒體應(yīng)激，由此引發(fā)細(xì)胞中蛋白質(zhì)失衡，同時(shí)顯著降低細(xì)胞的代謝活性，此外，有研究表明，溶酶體可以代償性發(fā)揮蛋白酶體的泛素化胞質(zhì)蛋白的降解功能，維持細(xì)胞中的蛋白質(zhì)平衡和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，因此，溶酶體可能在游離氨基酸向乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、乳蛋白合成和頂漿分泌過程中均起到重要調(diào)節(jié)和決定性作用。RNA剪接是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一，是“中心法則”的關(guān)鍵步驟之一，而負(fù)責(zé)執(zhí)行這一過程的是細(xì)胞核內(nèi)一個(gè)巨大的且高度動(dòng)態(tài)變化的分子機(jī)器—剪接體(spliceosome)。剪接體在真核生物進(jìn)化中極為保守，對(duì)于真核生物維持正常的生命活動(dòng)至關(guān)重要。一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄出的前體mRNA可以通過RNA剪接形成若干種mRNA，極大地豐富真核生物蛋白質(zhì)組的多樣性，其在乳蛋白的功能性蛋白質(zhì)合成中起到重要作用。因此，本研究表明，敲降28基因可能通過下調(diào)核糖體、溶酶體和剪接體相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少乳蛋白的合成和分泌。

加壓素主要調(diào)控細(xì)胞中水的重吸收，可以調(diào)控細(xì)胞器及細(xì)胞膜的通透性，參與乳蛋白的分泌及胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^程。RNA轉(zhuǎn)運(yùn)指RNA的核漿穿梭過程，RNA不同的亞細(xì)胞定位決定了其不同的生物學(xué)功能。研究表明，RNA轉(zhuǎn)運(yùn)參與了mRNA翻譯、蛋白合成和基因調(diào)控等多種生物學(xué)過程，因此該通路與乳蛋白的合成調(diào)控密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由單層膜構(gòu)成的囊狀、泡狀和管狀系統(tǒng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工是影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊的途徑，正確折疊的蛋白質(zhì)被包裝成運(yùn)輸囊泡，轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)則被泛素分子標(biāo)記，進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體或蛋白酶體進(jìn)行降解。因此，本研究在敲降28基因后，發(fā)現(xiàn)BMECs中加壓素介導(dǎo)水分重吸收、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)及泛素化介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解等通路的相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，與前人研究結(jié)果一致。但28基因?qū)?xì)胞中線粒體活性及細(xì)胞中所有代謝產(chǎn)物的具體影響還需要后續(xù)深入研究。

4 結(jié) 論

本研究以28基因?yàn)槟膛Ｈ榈鞍仔誀畹闹匾蜻x基因，采用RNAi干擾技術(shù)和iTRAQ比較蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，敲降28基因后發(fā)現(xiàn)酪蛋白、核糖體和蛋白酶體等相關(guān)基因及泛素蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，蛋白酶體活性下調(diào)；抑制蛋白酶體后酪蛋白相關(guān)基因發(fā)生同樣變化趨勢(shì)；進(jìn)一步采用iTRAQ比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白主要富集在核糖體、溶酶體、剪接體等通路中，表明敲降28基因可以通過泛素化信號(hào)通路影響B(tài)MECs中乳蛋白的合成，本研究結(jié)果也為奶牛產(chǎn)奶性狀的分子育種研究提供了理論基礎(chǔ)。