賈 若 王永清 楊雨民 李艷華 蘇寶科 劉立新

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院急診科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院老年病科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

肺纖維化是一種以累及肺間質(zhì)、肺泡和/或細(xì)支氣管為基本病變特點(diǎn)的疾病，有慢性進(jìn)展性、致死性等特點(diǎn)，治療困難，預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅了患者的健康[1-5]。研究證實(shí)，肺纖維化因過(guò)多細(xì)胞外基質(zhì)沉積（extracellular matrix，ECM）而成。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是纖維化啟動(dòng)和進(jìn)程的關(guān)鍵因子[6-11]，Smad3 是TGF-β1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中最重要的分子，可調(diào)節(jié)反向基因的轉(zhuǎn)錄[12-13]，TGF-β1/Smad 信號(hào)通路被激活，對(duì)肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MB）的形成、肺泡上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）、ECM 的沉積均有重要影響[14]。纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N），對(duì)于肺纖維化的發(fā)生發(fā)展起著非常重要的作用[15]，骨橋蛋白（osteopontin，OPN）可促進(jìn)TGF-β1 的活化，促進(jìn)纖維化的進(jìn)展[16]。本研究以TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路為切入點(diǎn)，研究蒙藥阿嘎如-25 治療肺纖維化的具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

主要試劑：TGF-β1（貨號(hào)：ER31210，HUABIO）；p-Smad3（貨號(hào)：ET1609-41，HUABIO）；FN（貨號(hào)：ET1702-25，HUABIO）；OPN（貨號(hào)：AF0227，Affinity）。

實(shí)驗(yàn)藥物：博來(lái)霉素（bleomycin，BLM）（invitrogen，貨號(hào)：R250-1）；養(yǎng)陰益肺通絡(luò)丸（北京康益德中西醫(yī)結(jié)合肺科醫(yī)院，批號(hào)京藥制字：20100002）；吡非尼酮膠囊（北京康蒂尼藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：H2013376）；蒙藥阿嘎如-25（內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院制劑中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠72 只[斯貝福北京生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，合格證號(hào)：110324200102508615]，平均體重（20±2）g，飼養(yǎng)于SPF 級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)室溫度為22～25℃，濕度44%～49%，本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（20190927-1）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立 隨機(jī)選取10 只健康SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠作為正常組，其余62 只小鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 ml/kg）麻醉，管內(nèi)注入BLM 稀釋液（按3.5 mg/kg劑量稀釋?zhuān)軇?.9%氯化鈉注射液）50 μl建立肺纖維化模型，確定肺間質(zhì)纖維化及肺泡炎的程度參照文獻(xiàn)[12-13]的方法。

1.3.2 分組及給藥 造模后第28 天，死亡7 只，其余小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（n=10）、西藥組（吡非尼酮膠囊）（n=9）、中藥組（養(yǎng)陰益肺通絡(luò)丸）（n=9），蒙高組（n=9）、蒙中組（n=9）、蒙低組（n=9）。

實(shí)驗(yàn)藥物制備：蒙藥阿嘎如-25 屬于《蒙醫(yī)金匱》[17]經(jīng)典名方，將其制成膠囊，每粒含生藥0.4 g。使用時(shí)將藥物烊化溶于其中。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃給藥劑量按人鼠體表面積折算，配置濃度依次為13、6.5、3.25 mg/ml 溶液。吡非尼酮膠囊用超純水制成濃度為0.0046 mg/ml的混懸液。灌胃給予吡非尼酮膠囊10 mg/（kg·d），給藥體積均為1 ml/（100g·d）。按人日用臨床劑量0.5 mg/d 計(jì)算，經(jīng)人小鼠體表面積比值折算成小鼠的日用藥量。模型及正常組給予等體積生理鹽水灌胃，各組每日固定時(shí)間灌胃，1 次/d，均灌胃8 周。

1.3.3 檢測(cè)方法 連續(xù)灌胃8 周后小鼠脫頸處死，取小鼠肺組織進(jìn)行組織固定及冷凍處理。免疫組織化學(xué)染色及Masson 染色觀察小鼠肺組織病理改變及纖維化，Western blot 法檢測(cè)肺組織中TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白的表達(dá)，Tunel 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒙藥阿嘎如-25 對(duì)小鼠肺組織病理形態(tài)及纖維化的影響

正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，未見(jiàn)明顯病理改變。模型組肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，支氣管上皮細(xì)胞部分脫落，部分肺泡萎縮，肺泡壁內(nèi)可見(jiàn)大量紅細(xì)胞，組織中可見(jiàn)彌散性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（單核細(xì)胞為主）。蒙高組、蒙中組、蒙低組肺組織病理形態(tài)均較模型組改善明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織免疫組織化學(xué)染色（200×）

正常組肺組織無(wú)明顯的纖維蛋白沉積，而模型組藍(lán)染區(qū)域增多，小鼠肺泡壁的間質(zhì)纖維化局灶性纖維組織增生，肺纖維程度進(jìn)一步加強(qiáng)，各蒙藥組小鼠肺組織藍(lán)色區(qū)域較模型組明顯減少，肺纖維化程度明顯減輕。模型組膠原纖維面積百分比高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各蒙藥組膠原纖維面積百分比低于模型組，蒙高組膠原纖維面積百分比低于其他蒙藥組，且蒙中組低于蒙低組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表1。

圖2 各組小鼠肺組織Masson 染色（200×）

表1 各組小鼠肺組織纖維化情況比較（%，）

表1 各組小鼠肺組織纖維化情況比較（%，）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蒙低組比較，cP＜0.05；與蒙中組比較，dP＜0.05

2.2 蒙藥阿嘎如-25 對(duì)小鼠肺組織TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白表達(dá)的影響

模型組TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 表達(dá)高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各蒙藥組TGFβ1、p-Smad3、FN、OPN 表達(dá)均低于模型組，蒙高組低于其他蒙藥組，且蒙中組低于蒙低組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

表2 各組小鼠肺組織TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白表達(dá)情況比較（）

表2 各組小鼠肺組織TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白表達(dá)情況比較（）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蒙低組比較，cP＜0.05；與蒙中組比較，dP＜0.05。TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；FN：纖維連接蛋白；OPN：骨橋蛋白

圖3 各組小鼠肺組織TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白的表達(dá)

2.3 蒙藥阿嘎如-25 對(duì)小鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響

模型組細(xì)胞凋亡率高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各蒙藥組細(xì)胞凋亡率低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；蒙高組細(xì)胞凋亡率低于其他蒙藥組，且蒙中組低于蒙低組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4、表3。

圖4 各組小鼠肺組織TUNEL 染色（400×）

表3 各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況比較（%，）

表3 各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況比較（%，）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蒙低組比較，cP＜0.05；與蒙中組比較，dP＜0.05

3 討論

研究證明，TGF-β1 可誘導(dǎo)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)，最終導(dǎo)致纖維化[18-20]。本研究顯示，蒙藥阿嘎如-25 可有效改善肺纖維化小鼠的肺組織病理改變及纖維蛋白沉積情況，抑制TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路，抑制FN、OPN 蛋白的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡，且其高劑量組效果更優(yōu)，不失為治療肺纖維化的有效藥物。

蒙醫(yī)學(xué)說(shuō)中，三根為生來(lái)固有的“赫依、希拉、巴達(dá)干”，維持機(jī)體達(dá)到“平衡狀態(tài)”，而五源學(xué)說(shuō)以及寒熱屬性中，赫依因具有輕、糙、動(dòng)為主秉性成分，歸屬氣源，呈寒熱兩重性[21-24]。赫依以循行之道遍布全身，上行赫依位于胸部，熱癥未痊愈殘留于肺，遷延時(shí)久，赫依偏盛紊亂，傷及肺體素，肺通氣受阻而致病。常有干咳，尤其在赫依時(shí)辰（拂曉前及夜幕降臨時(shí)）為著，無(wú)痰或咳少量泡沫痰，疲乏無(wú)力，快速活動(dòng)后氣短，心悸，脈象空、芤，舌質(zhì)紅、粗糙。治宜在強(qiáng)身潤(rùn)肺，鎮(zhèn)赫依的前提下，以對(duì)癥治療為原則。蒙藥方劑阿嘎如-25（蒙藥名）[25]，主治：上下內(nèi)外各種赫依病，尤其偏于清鎮(zhèn)內(nèi)赫依病病證。對(duì)于上下內(nèi)外各種赫依病均有裨益。

綜上所述，肺纖維化嚴(yán)重威脅著人們的健康，吡非尼酮價(jià)格昂貴，治療不易堅(jiān)持，中藥和蒙藥較西藥都有價(jià)格便宜、容易堅(jiān)持等特點(diǎn)，但蒙藥藥劑在本研究中體現(xiàn)了更好的治療效果，明確了蒙藥阿嘎如-25調(diào)控肺間質(zhì)細(xì)胞干預(yù)促肺纖維化/抗肺纖維化耦聯(lián)治療肺纖維化的效應(yīng)及分子途徑，構(gòu)建“清鎮(zhèn)赫依（蒙藥阿嘎如-25）-順氣化痰（清鎮(zhèn)肺赫依）-抗肺纖維化（干預(yù)促肺纖維化/抗肺纖維化耦聯(lián)）”的藥效關(guān)系模型，為臨床治療提供了依據(jù)。