薛 偉 康少英 郭洪生 王培霞 王振興 詹金華 張英民 王華軍

1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院骨三科，河北邯鄲 056001；2.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)與運動醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州 510630

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨重塑為特征的退行性疾病[1-3]。代謝綜合征與OA 密切相關(guān)，我國糖尿病患者人數(shù)預(yù)計到2035 年將增加到1.43 億[4]。糖尿病患者患有OA 的概率是非糖尿病患者的3.8 倍[5]，但糖尿病對于OA 的影響機制仍然未知。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要調(diào)控作用[6-8]。有研究證明lncRNAs H19 參與軟骨下骨成骨分化和骨再生的調(diào)控過程[9-10]。同時，有研究證明糖尿病會導(dǎo)致H19 的表達異常[11]，因此闡明H19 在糖尿病OA 中的異常表達及其對軟骨下骨造成的影響，為臨床治療糖尿病OA 提供理論基礎(chǔ)和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取2017 年1 月至2019 年6 月于河北省邯鄲市中心醫(yī)院就診行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)治療的糖尿病OA患者（DM-OA 組）與非糖尿病OA 患者（OA 組），各3 例，以及對照組3 名（同期體檢）。樣本均取自脛骨平臺病變部位軟骨下骨。OA 診斷按照Kellgren &Lawrence[12]分級為Ⅲ級或Ⅳ級，所有患者年齡50～80 歲。取樣符合河北省邯鄲市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會標(biāo)準并得到了批準，且取樣獲得患者或家屬的知情同意。

1.2 獲取軟骨下骨

取得脛骨平臺標(biāo)本后，沖洗標(biāo)本，并在裝有青霉素-鏈霉素-兩性霉素B 混合溶液（三抗）（購自北京謹明生物科技有限公司，PS0752）的磷酸鹽緩沖液的無菌平皿中浸泡10 min，2～3 次。將標(biāo)本上表面的軟骨清理干凈，獲得的即是軟骨下骨標(biāo)本。

1.3 qRT-PCR 檢測lncRNAs 及miRNA 表達水平

為檢測lncRNAs H19 及miR-141、miR-22 表達水平，合成對應(yīng)的探針引物進行qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10.5 μl（購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，RR820A）、PCR 正反向引物各0.5 μl、cDNA 0.5 μl、單蒸水8 μl，總反應(yīng)體系20 μl。反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40 個循環(huán)。－20℃保存。以NADPH 為內(nèi)參對照，取三復(fù)孔進行平均，對照組設(shè)為100%，對DM-OA組和OA組進行相對定量。H19正向引物：5’-CGTTCCTTTAGTCTCCTGAC-3’，反向引物：5’-AGT-CCGTGTTCCAAGTCC-3’；miR-141正向引物：5’-TCCATCTTCCAGTGCAGTGTR-3’，反向引物：5’-GAACATGTCTGCGTATCT-3’；miR-22 正向引物：5’-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3’，反向引物：5’-AGUUCUUCAACUGGCAGCUUUU-3’；NADPH 正向引物：5’-CGGACAGGATTGACAGATTGATAGC-3’，反向引物：5’-TGCCAGAGTCTCGTTCGTTATCG-3’。

1.4 熒光素酶報道基因

設(shè)計引物擴增lncRNAs H19 的3’UTR 區(qū)序列，將其克隆到PmirGLO 載體，構(gòu)建PmirGLO-H19-WT質(zhì)粒；設(shè)計相應(yīng)的H19 突變質(zhì)粒，構(gòu)建PmirGLOH19-MUT 質(zhì)粒。GenePharm 吉瑪公司合成miR-22、miR-141 的mimic 及inhibitor 片段，轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒及miR-22、miR-141 片段。48 h 后裂解細胞，檢測熒光素酶活性。

1.5 qRT-PCR 及蛋白免疫印跡檢測β-catenin 與Runx2 表達水平

采用qRT-PCR 及蛋白免疫印跡檢測β-catenin與Runx2 表達水平。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10.5 μl、PCR 反向引物各0.5 μl、cDNA 0.5 μl、單蒸水8 μl，總反應(yīng)體系20 μl。反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40 個循環(huán)。-20℃保存。以內(nèi)參為對照，取三復(fù)孔進行平均，對照組設(shè)為100%，對DM-OA 組和OA 組進行相對定量。參照蛋白免疫印跡檢測步驟進行操作，依次選取目的條帶，分析得出光密度數(shù)值，以β-catenin 蛋白與NADPH 密度的比值，計算出各組目的蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組軟骨下骨組織中H19 及miR-141、miR-22表達水平比較

DM-OA 組的H19 表達水平高于OA 組及對照組，miR-141、miR-22 表達水平低于OA 組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；OA 組的H19 表達水平高于對照組，miR-141、miR-22 表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 各組軟骨下骨組織中H19 及miR-141、miR-22 表達水平比較（n=3）

2.2 熒光素酶報道基因檢測H19 靶向吸附miR-141、miR-22 情況

過表達H19 WT 和miR-141、miR-22 片段后，熒光素酶報道的熒光信號明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。miR-141 mimic、miR-22 mimic 相似物對突變質(zhì)粒的熒光信號不產(chǎn)生影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖2。

圖2 熒光素酶報道基因檢測H19 靶向吸附miR-141、miR-22 情況

2.3 各組軟骨下骨組織中β-catenin、Runx2 的mRNA及蛋白表達水平比較

DM-OA 組的β-catenin mRNA、Runx2 mRNA 表達水平高于OA 組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；OA 組的β-catenin mRNA、Runx2 mRNA 表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。DMOA 組的β-catenin 蛋白、Runx2 蛋白 表達水平高于OA 組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；OA 組的β-catenin 蛋白、Runx2 蛋白表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 各組軟骨下骨組織中β-catenin、Runx2 的mRNA 及蛋白表達水平比較（n=3）

3 討論

OA 是中老年人最常見的慢性退化性的關(guān)節(jié)疾病[13-14]，其中軟骨下骨的病變是OA 發(fā)生及發(fā)展的重要影響因素[15-17]。然而，關(guān)于OA 以及糖尿病OA 的發(fā)病機制卻一直未能被完全揭示[18]。近年來發(fā)現(xiàn)，lncRNAs 在諸多生命活動及疾病發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[19-20]。lncRNAs H19 位于人類染色體11p15.5，是最著名印記基因之一[21-23]。研究表明，miR-141 和miR-22 兩種miRNA 過表達可以導(dǎo)致人骨髓間充質(zhì)干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs）中βcatenin 的表達水平顯著降低[24]。而H19 可以拮抗這兩個miRNA 的功能，最終激活Wnt/β-catenin 信號通路，促進hMSCs 向成骨細胞分化，從而促進骨生成。本研究結(jié)果顯示，OA 患者的軟骨下骨中l(wèi)ncRNAs H19 表達量要高于非OA 患者，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，H19可以通過海綿作用吸附miR-141 和miR-22，且通過熒光素酶報道基因及突變實驗證明了H19 可靶向調(diào)控miR-141 和miR-22。同時，糖尿病患者軟骨下骨中l(wèi)ncRNAs H19 以及成骨細胞標(biāo)志物的表達量均要高于非糖尿病患者，這不僅僅解釋了糖尿病患者OA的發(fā)病率較高、病情發(fā)展更加迅速外，同時也進一步提示lncRNAs H19 和β-catenin 之間確實存在一定的關(guān)系。

Wnt 信號通路是多細胞真核生物在進化過程中一條非常保守的信號通路。當(dāng)抑制Wnt/β-catenin 通路后，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin 濃度增加并進入細胞核內(nèi)與T 細胞轉(zhuǎn)錄因子/淋巴增強因子形成復(fù)合體，通過與DNA 結(jié)合，進而誘導(dǎo)c-myc、cyclinD 和Runx2 等靶基因的轉(zhuǎn)錄，使成骨細胞的細胞周期由G1期進入S 期，而成骨細胞的分化增殖也得到增強[25]。lncRNAs H19導(dǎo)致β-catenin 上調(diào)，通過依賴β-catenin 的經(jīng)典Wnt信號通路促進hMSCs 向成骨細胞分化，導(dǎo)致OA 軟骨下骨中骨吸收和骨生成的平衡失調(diào)，骨生成增多，導(dǎo)致OA 患者軟骨峽谷的硬化，加重OA 的進程。

本研究表明，lncRNAs H19 在OA 患者軟骨下骨中的表達水平高于非OA 患者，H19 可直接海綿吸附抑制miR-141 和miR-22，上調(diào)β-catenin 蛋白，激活Wnt/β-catenin 通路，從而使OA 軟骨下骨中的骨生成增多，軟骨下骨硬化。同時本研究創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)，糖尿病會進一步上調(diào)OA 患者軟骨下骨中H19 的表達，這可能是糖尿病患者OA 發(fā)病率高的原因，同時也會加速疾病的發(fā)展，為研究OA、糖尿病OA 的發(fā)病機制以及臨床治療提供了實驗基礎(chǔ)和新思路。