田良良 葉洪麗 席寅峰 黃宣運(yùn) 王 媛 孔 聰 沈曉盛 蔡友瓊

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200090）

河鲀 （Tetraodontidae） 俗稱河豚魚 （Puffer fish）， 是硬骨魚綱鲀科魚類的統(tǒng)稱， 因肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富， 生食、 熟食皆宜， 自古以來被視為餐桌上的珍品。 民間有 “拼死吃河鲀” 的說法， 是因?yàn)楹喻凈~體內(nèi)含有河豚毒素 （Tetrodotoxin， TTX），若加工處理不當(dāng)會(huì)引起食物中毒， 甚至死亡。

河豚毒素呈無色針狀結(jié)晶體， 耐酸、 耐高溫，性質(zhì)穩(wěn)定， 是一種劇毒的生物堿類天然神經(jīng)毒素[1]，也是一種高特異性的電壓門控鈉通道阻滯劑[2]， 其在臨床與神經(jīng)學(xué)研究領(lǐng)域具有很多潛在的醫(yī)學(xué)研究價(jià)值， 目前被認(rèn)為是自然界所發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的神經(jīng)毒素之一[3]。 河豚毒素最早是1909 年由日本科學(xué)家從河鲀卵巢中提取得到， 1964 年在蠑螈[4]體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了河豚毒素， 后來在其他海洋生物[5～11]、 陸生生物[12～14]及細(xì)菌[15～16]體內(nèi)也檢測到了河豚毒素。河豚毒素在河鲀的卵巢、 內(nèi)臟、 魚皮、 魚肉等各個(gè)組織器官中都可能存在[17]， 我國在1990 年頒布的《水產(chǎn)品衛(wèi)生管理辦法》 中規(guī)定 “河豚魚有劇毒，不得流入市場， 應(yīng)剔出集中妥善處理， 因特殊情況需進(jìn)行加工食用的應(yīng)在有條件的地方集中加工”（該辦法于 2010 年廢止）。 2011 年 6 月 9 日， 原國家食品藥品監(jiān)督管理局在 《關(guān)于餐飲服務(wù)提供者經(jīng)營河鲀魚有關(guān)問題的通知》 中也明令 “在國家有關(guān)政策調(diào)整前， 嚴(yán)禁任何餐飲服務(wù)提供者加工制作河鲀”。

近年來隨著河鲀養(yǎng)殖技術(shù)的迅速發(fā)展， 養(yǎng)殖河鲀的毒性與野生河鲀相比大大降低， 經(jīng)加工處理后甚至可達(dá)到無毒水平[18～20]。 因此， 2016 年， 原農(nóng)業(yè)部和原國家食品藥品監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布了《關(guān)于有條件放開養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀加工經(jīng)營的通知》（農(nóng)辦漁〔2016〕53 號）， 對符合條件的養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀企業(yè)實(shí)行有條件放開。 2020 年全國養(yǎng)殖河鲀總產(chǎn)量為2.68萬t， 主要養(yǎng)殖省份為福建 （產(chǎn)量占比39.1%）、 廣東（產(chǎn)量占比28.7%）、 江蘇 （產(chǎn)量占比13.1%）、 河北（產(chǎn)量占比8.0%） 等[21]。 隨著養(yǎng)殖河鲀市場的放開， 養(yǎng)殖河鲀的食用安全性也引起人們的關(guān)注。 本文對2015－2021 年養(yǎng)殖河鲀中的河豚毒素含量進(jìn)行測定分析， 并對目前養(yǎng)殖河鲀的食用安全性進(jìn)行暴露評估。

隨著養(yǎng)殖河鲀養(yǎng)殖規(guī)模和市場需求的擴(kuò)大， 河鲀的消費(fèi)量會(huì)越來越大， 為了保證人們食用河鲀的安全性， 需要建立符合我國國情的河豚毒素限量標(biāo)準(zhǔn)。 本文通過分析毒理學(xué)數(shù)據(jù)對我國養(yǎng)殖河鲀中河豚毒素的限量值提出建議， 為監(jiān)管部門的日常監(jiān)控提供參考依據(jù)， 同時(shí)為廣大消費(fèi)者的食用安全提供保障。

一、 材料與方法

（一） 材料與試劑208 個(gè)河鲀樣本來源于2015－2021 年河鲀監(jiān)控項(xiàng)目和企業(yè)委托項(xiàng)目， 包括： 2015 年抽取的福建、 江蘇、 上海等養(yǎng)殖河鲀企業(yè)生產(chǎn)和銷售的115 個(gè)養(yǎng)殖河鲀樣品， 其中暗紋東方鲀91 個(gè)、 菊黃東方鲀8 個(gè)、 條紋東方鲀15 個(gè)和雜交河鲀 （菊黃東方鲀和暗紋東方鲀雜交） 1個(gè)； 2015 年 4－11 月， 每月分別抽取的江蘇省南通中洋集團(tuán)股份有限公司和上海阿順特養(yǎng)殖有限公司的暗紋東方鲀， 共計(jì)31 個(gè)樣品； 2016 年河鲀有條件放開后對魚源基地評審委托檢測的河鲀樣品，2017－2021 年共計(jì)62 個(gè)樣品， 其中暗紋東方鲀48個(gè)、 紅鰭東方鲀14 個(gè)， 樣品主要來自于江蘇（樣品數(shù)量占比29.0%）、 廣東 （樣品數(shù)量占比21.0%）、河北 （樣品數(shù)量占比14.5%）、 福建 （樣品數(shù)量占比11.3%）、 上海 （樣品數(shù)量占比11.3%） 等地。

河豚毒素免疫親和柱 （1 000 ng， 3 mL）， 江蘇美正生物科技有限公司； 河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品 （純度≥99%）， 成都曼思特生物科技有限公司； 乙腈（色譜純）， 美國 J.T.Baker 公司； 甲醇 （色譜純），美國 J.T.Baker 公司； 甲酸 （色譜純）， 美國 Supelco 公司； 冰乙酸、 氯化鈉、 十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、 氫氧化鈉 （分析純）， 中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

（二） 儀器與設(shè)備Thermo TSQ Quantum 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀， 配有電噴霧離子源 （ESI）， 美國Thermo 公司； 高速冷凍離心機(jī)， 美國Thermo 公司。

（三） 方法本文提取凈化方法、 色譜和質(zhì)譜儀器條件參考GB 5009.206－2016[22]標(biāo)準(zhǔn)方法中第二法。

1.提取凈化。 用水清洗魚體表面的污物， 濾紙吸干魚體表面的水分后用刀將魚體分解成肌肉、 肝臟、 皮和性腺等部分， 各部分組織分別用水洗去血污， 濾紙吸干表面的水分后將各組織切碎， 充分均質(zhì)。

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)混勻后的樣品5.00 g （精確到0.01 g） 于30 mL 具塞聚丙烯塑料離心管中， 加入10 mL 1%乙酸－甲醇溶液， 漩渦混勻2 min， 40℃超聲提取 15 min， 以 6 000 r/min 離心 5 min。

取7 mL 上清液于50 mL 塑料離心管中， 加入27 mL PBS 溶液 （0.05 mol/L， pH 7.3） 稀釋， 用 1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)整 pH 至 7 左右， 用 PBS 溶液定容至35 mL， 用玻璃纖維濾紙過濾。

取10 mL 過濾液過免疫親和柱， 4 mL 2%乙酸－甲醇溶液洗脫， 將洗脫液于40℃條件下氮?dú)獯蹈桑?用55%乙腈水溶液定容至1 mL， 混勻后用0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾至樣品瓶待測。

2.色譜條件。 色譜柱為 TSK－gel Amide－80 色譜柱 （100 mm×2.0 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相為乙腈－0.1%甲酸水溶液 （55∶45，V∶V）； 流速為 0.3 mL/min； 柱溫為 35℃； 進(jìn)樣量為 10 μL。

3. 質(zhì)譜條件。 離子源為電噴霧離子源 （ESI），正離子模式； 掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測 （SRM），選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子 （m/z） 320.2， 子離子 （m/z）302.2、 162.2， 碰撞能量 26、 36eV； 噴霧電壓為3 500 V； 碰撞氣 （氬氣） 壓力為 0.2 Pa。

（四） 采用食品安全指數(shù)進(jìn)行暴露評估由于河豚毒素的毒害作用與其進(jìn)入人體的絕對量有關(guān)，因此評價(jià)其安全性以人體對河豚毒素的實(shí)際攝入量與其急性參考劑量相比較的方式更為科學(xué)合理， 所以對河鲀中河豚毒素的暴露評估通過導(dǎo)出可以用來評價(jià)食品中某種化學(xué)物質(zhì)殘留對消費(fèi)者健康影響的食品安全指數(shù) （IFS）[23]來進(jìn)行。

養(yǎng)殖河鲀中河豚毒素對消費(fèi)者健康影響的食品安全指數(shù)計(jì)算方法見公式 （1）。

公式（1）中， EDI 為河豚毒素的一餐實(shí)際攝入量估算值（μg）； ARfD 為急性參考劑量， 即一餐攝入對人類健康沒有任何影響的河豚毒素量 （μg/kg）；bw 為平均體重 （kg）， 缺省值為 60。

采用公式 （1） 來計(jì)算河豚毒素的食品安全指數(shù)， 根據(jù)計(jì)算結(jié)果可以得出其對食品安全的影響程度。 可以預(yù)期的結(jié)果是： IFS<<1， 河豚毒素對食品安全沒有影響； IFS ≤1， 河豚毒素對食品安全影響的風(fēng)險(xiǎn)是可以接受的； IFS>1， 河豚毒素對食品安全影響的風(fēng)險(xiǎn)超過了可接受的限度。

二、 結(jié)果

（一） 檢測方法線性范圍、 準(zhǔn)確度、 精密度河豚毒素系列梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液采用基質(zhì)空白溶液配制，以峰面積為縱坐標(biāo)， 以濃度為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 計(jì)算相關(guān)系數(shù)。 結(jié)果顯示， 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為 0.5～60 ng/mL， 相關(guān)系數(shù) （R2）＞0.999。

以空白基質(zhì)加標(biāo)， 信噪比 （S/N）≥3 和信噪比（S/N）≥10 所對應(yīng)的河豚毒素的濃度求得方法檢出限和定量限， 方法檢出限和定量限分別為1 μg/kg和 3 μg/kg。

以空白基質(zhì)加標(biāo)， 進(jìn)行3 個(gè)濃度水平分別為3、 10、 20 μg/kg 的添加回收實(shí)驗(yàn)， 重復(fù) 6 次實(shí)驗(yàn)計(jì)算精密度。 在上述添加水平下河豚毒素的回收率范圍為87%～108%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3%～10%。結(jié)果表明， 采用本方法測定河鲀中河豚毒素得出的結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。

（二） 養(yǎng)殖河鲀專項(xiàng)監(jiān)測結(jié)果2015 年， 對在福建省、 江蘇省和上海市等河鲀主產(chǎn)區(qū)的養(yǎng)殖企業(yè)和銷售市場中抽取的115 個(gè)養(yǎng)殖河鲀樣品進(jìn)行了河豚毒素檢測， 其中所有樣品均進(jìn)行了肌肉中河豚毒素的檢測； 44 個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行了皮和肝臟中河豚毒素的檢測； 41 個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行了性腺 （包括18個(gè)卵巢和23 個(gè)精巢） 中河豚毒素的檢測。 各類養(yǎng)殖河鲀樣品中河豚毒素的檢出結(jié)果見表1。 檢測結(jié)果顯示， 115 份肌肉樣品中有2 個(gè)暗紋東方鲀的肌肉檢出河豚毒素， 檢出值分別為2.28 μg/kg 和3.69 μg/kg； 18 份卵巢樣品中有1 個(gè)菊黃東方鲀和1 個(gè)條紋東方鲀的卵巢檢出河豚毒素， 檢出值分別為22.31 μg/kg 和 3.62 μg/kg； 44 份皮樣品、 44 份肝臟樣品和23 份精巢樣品均未檢出河豚毒素。

表1 上海市、 福建省和江蘇省等地區(qū)養(yǎng)殖河鲀中河豚毒素的檢出結(jié)果

（三） 不同時(shí)間抽樣的暗紋東方鲀樣品中河豚毒素檢出結(jié)果從江蘇和上海兩個(gè)河鲀養(yǎng)殖公司共抽取31 個(gè)暗紋東方鲀樣品， 對其進(jìn)行肌肉中河豚毒素的檢測， 取樣月份、 樣品數(shù)量及檢測結(jié)果見表2。 結(jié)果顯示， 4－10 月的河鲀樣品中均未檢出河豚毒素， 11 月抽取的河鲀肌肉中檢出了河豚毒素，檢出值為3.69 μg/kg， 這也與文獻(xiàn)報(bào)道的冬季河豚毒素的檢出水平是最高的結(jié)論相一致[24]， 樣品總體檢出率為3.23%。

表2 不同月份養(yǎng)殖河鲀樣品中河豚毒素檢測結(jié)果 （個(gè)）

（四） 河鲀魚源基地評審委托的河鲀樣品檢測結(jié)果2017－2021 年， 筆者工作單位作為養(yǎng)殖暗紋東方鲀和養(yǎng)殖紅鰭東方鲀魚源基地評審的技術(shù)機(jī)構(gòu)， 對養(yǎng)殖企業(yè)送檢的48 個(gè)暗紋東方鲀樣品和14個(gè)紅鰭東方鲀樣品進(jìn)行了肌肉和皮中河豚毒素的檢測， 同時(shí)也對部分樣品的肝臟和性腺等組織進(jìn)行了河豚毒素的檢測。 48 個(gè)暗紋東方鲀樣品和14 個(gè)紅鰭東方鲀樣品的檢測結(jié)果見表3。 結(jié)果顯示， 62 個(gè)樣品中有4 個(gè)暗紋東方鲀和1 個(gè)紅鰭東方鲀的組織中檢測出河豚毒素 （見表4）， 樣品總體檢出率為8.06%， 肌肉、 皮、 肝臟、 性腺均有檢出， 不同組織檢出率分別為1.61%、 4.84%、 4.44%、 42.86%，檢出值為2.97～28.88 μg/kg， 其中性腺中的河豚毒素檢出率最高和檢出值最大。

表3 不同品種河鲀的不同組織中河豚毒素檢出結(jié)果

表4 河豚毒素陽性樣品的檢出值 （μg/kg）

三、 分析與討論

（一） 3 種來源養(yǎng)殖河鲀中河豚毒素綜合結(jié)果分析通過分析以上3 種來源的養(yǎng)殖河豚中河豚毒素的檢測結(jié)果得出， 不同來源樣品的不同組織中河豚毒素的檢出率表現(xiàn)不同， 其中河鲀肌肉 （1.61%～3.23%）、 皮 （0～4.84%） 和肝臟 （0～4.44%）的檢出率差異不大， 性腺 （4.88%～42.86%） 檢出率差異較大。 性腺中河豚毒素檢出率差異大主要是因?yàn)楹喻冃韵俚陌l(fā)育與季節(jié)有關(guān)， 很多樣品檢測時(shí)其性腺還未發(fā)育， 所以較小的樣本量 （魚源基地評審性腺樣品只有7 個(gè)） 造成了較大的差異。 樣本量較大的養(yǎng)殖河鲀專項(xiàng)和魚源基地評審的河鲀肌肉樣本中河豚毒素檢出率 （1.74%與1.61%） 很接近，說明不同來源、 不同產(chǎn)地的河鲀中河豚毒素的檢出情況幾乎無差異， 所以3 種來源的所有河鲀樣品的綜合情況具有一定的代表性。

本文自 2015－2021 年， 共對 208 個(gè)養(yǎng)殖河鲀樣品進(jìn)行了檢測， 其中暗紋東方鲀170 個(gè)、 紅鰭東方鲀14 個(gè)、 菊黃東方鲀8 個(gè)、 條紋東方鲀15 個(gè)和雜交河鲀1 個(gè)； 檢測組織樣本量為451 份， 其中肌肉 208 份、 皮 106 份、 肝臟 89 份、 性腺 48 份。208 個(gè)河鲀樣品中共有10 個(gè)樣品檢出河豚毒素，樣品總體檢出率為4.81%； 檢出河豚毒素的組織樣本為肌肉 4 份、 皮 3 份、 肝臟 2 份、 性腺 5 份， 不同組織的檢出率分別為1.92%、 2.83%、 2.25%、10.42%， 不同組織的檢出最高值分別為 6.08、13.92、 4.40、 28.88 μg/kg。

（二） 食用養(yǎng)殖河鲀的河豚毒素暴露評估河豚毒素中毒潛伏期短， 一般食用后0.5～3 h 內(nèi)發(fā)病， 輕度中毒口唇、 舌尖、 手指會(huì)出現(xiàn)麻木感， 重度中毒會(huì)全身麻木、 呼吸困難甚至死亡， 死亡率高。 雖然連續(xù)口服低劑量的河豚毒素對腎臟和心臟有一定的有害影響[25]， 但主要危害是一次食用量過多帶來的生命危險(xiǎn)， 所以采用急性參考劑量（ARfD） 進(jìn)行暴露評估。

由于目前缺乏人體的河豚毒素毒理學(xué)數(shù)據(jù)， 而河豚毒素的種間差異是有限的[26]， 所以直接使用小鼠的毒理學(xué)數(shù)據(jù)也相對準(zhǔn)確， 監(jiān)測小鼠2 h 后確定的急性口服無可見不良作用劑量 （NOAEL） 為75 μg/kg （TTX/ 體重）[27]， 即將河豚毒素的急性參考劑量 （ARfD） 按 75 μg/kg 計(jì)。 養(yǎng)殖河鲀不同組織的河豚毒素食品安全指數(shù)計(jì)算結(jié)果見表5。 如表5所示， 肌肉、 皮、 肝臟、 性腺的食品安全指數(shù)均小于 0.01 （IFS<<1）， 說明養(yǎng)殖河鲀肌肉、 皮、 肝臟、性腺中的河豚毒素對食品安全均沒有影響， 即養(yǎng)殖河鲀中河豚毒素對食品安全沒有影響。

表5 養(yǎng)殖河鲀不同組織的河豚毒素食品安全指數(shù)

養(yǎng)殖河鲀的肌肉、 皮、 肝臟的河豚毒素檢出率均小于3%， 性腺檢出率相對較高， 也僅為10.42%，而通過食品安全指數(shù)評估結(jié)果顯示， 養(yǎng)殖河鲀中河豚毒素對食品安全沒有影響， 所以目前養(yǎng)殖河鲀的食用是安全的。

（三） 河鲀中河豚毒素安全限量制定的建議河豚毒素是目前世界上備受各國重視的毒素， 歐洲食品安全局 （EFSA） 就海洋雙殼類和腹足類動(dòng)物體內(nèi)TTX 及其類似物對公共健康的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)布了科學(xué)意見[28]。 根據(jù)歐盟現(xiàn)行立法要求 （第853/2004/EC號法規(guī)和第854/2004/EC 號法規(guī)）， 不得將含TTX的漁業(yè)產(chǎn)品投放市場； 而在日本， 制定了 2.2 mg/kg 的監(jiān)管限量值[29]； 最近 TTX 正式納入了荷蘭魚類監(jiān)測計(jì)劃， 該計(jì)劃確定了貝類中河豚毒素的安全濃度為44 μg/kg[24]； 我國也開始重視河鲀中河豚毒素的安全限量問題， 但目前缺乏河豚毒素限量標(biāo)準(zhǔn)。

河豚毒素的毒理資料表明， 口服半致死劑量（LD50） 為 232 μg/kg （TTX/ 體重）[27]。 按照該 LD50計(jì)算， 不確定系數(shù)取100， 如果成年人體重為60 kg， 那么當(dāng)河豚毒素通過口部攝入量達(dá)139.2 μg時(shí)就存在安全隱患。 日本厚生勞動(dòng)省于2005 年發(fā)布的 《食品衛(wèi)生檢查指針》 中規(guī)定河鲀中的河豚毒素應(yīng)低于 10 MU/g （約為 2.2 mg/kg）， 我國農(nóng)辦漁〔2016〕 53 號文規(guī)定河鲀產(chǎn)品的河豚毒素含量不得超過2.2 mg/kg （以鮮品計(jì)）， 中日兩國規(guī)定值一致。 但由于不同國家對于河鲀的食用方式不同， 其限量的安全性也不同。 比如日本食用河鲀的方式為生魚片， 且每次限量供應(yīng)， 這種食用方式?jīng)Q定了每次的食用量有限， 只要每次食用少于20 g， 2.2 mg/kg 的限量是可以保證其食用安全的； 而我國居民的飲食習(xí)慣則不同， 每個(gè)人每次的食用量有可能會(huì)達(dá)到400 g[30]， 如果河鲀中河豚毒素含量達(dá)到了2.2 mg/kg， 一次性食用 400 g 河鲀可攝入 880 μg的河豚毒素， 超過 139.2 μg 的 6 倍， 所 以 2.2 mg/kg 的限量規(guī)定存在很大的安全隱患。 隨著養(yǎng)殖河鲀養(yǎng)殖規(guī)模和消費(fèi)需求的擴(kuò)大， 為了保證人們食用的安全性， 也為了河鲀產(chǎn)業(yè)的健康有序發(fā)展， 迫切需要建立符合我國實(shí)際國情的河豚毒素限量值。

根據(jù)河豚毒素的毒理學(xué)數(shù)據(jù)， 急性口服河豚毒素?zé)o可見不良作用劑量 （NOAEL） 為 75 μg/kg（TTX/體重）[27]， 成年人平均體重以 60 kg 計(jì)， 如果每個(gè)人一次最多可以食用1 kg 河鲀， 安全系數(shù)取100， 那么安全值為 45 μg/kg， 所以建議河鲀中河豚毒素的限量值定為45 μg/kg。

四、 結(jié)論

通過對2015－2021 年養(yǎng)殖河鲀中河豚毒素的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析， 發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖河鲀中河豚毒素的樣品總體檢出率為4.81%， 檢出值范圍為2.28～28.88 μg/kg。 采用食品安全指數(shù)對養(yǎng)殖河鲀中的河豚毒素進(jìn)行暴露評估， 發(fā)現(xiàn)肌肉、 皮、 肝臟甚至性腺的食品安全指數(shù)均小于0.01 （IFS<<1）， 說明養(yǎng)殖河鲀中的河豚毒素對食品安全沒有影響， 所以養(yǎng)殖河鲀的食用是安全的。 隨著養(yǎng)殖河鲀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展， 市場對于河鲀的需求會(huì)越來越大， 由于缺乏河鲀中河豚毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)， 相關(guān)監(jiān)管部門的監(jiān)管工作會(huì)存在很大的障礙， 所以亟需建立符合我國國情的河鲀中河豚毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)， 為監(jiān)管工作提供法律依據(jù)， 以保障我國消費(fèi)者生命安全， 促進(jìn)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。 本文通過對河豚毒素毒理學(xué)數(shù)據(jù)的分析、 討論及計(jì)算， 提出了 45 μg/kg 的限量建議， 為河豚毒素限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。