董 琨 宮曉平 李曉東 郭彥麗 冀 峰 崔璐璐

（1. 張家口市食品藥品檢驗中心， 河北張家口 075000； 2. 島津企業(yè)管理 （中國） 有限公司創(chuàng)新中心，北京 100020）

孔雀石綠 （MG） 和結晶紫 （GV） 均為人工合成的有機化合物， 屬于三苯甲烷型的染料， 同時也是殺菌和殺寄生蟲的化學制劑， 因價格低廉、 使用方便， 常用于魚類水霉病等寄生蟲病的防治或作為消毒劑用于鮮活魚類運輸過程中， 以延長魚類的存活時間[1]。 孔雀石綠和結晶紫在生物體內(nèi)分別代謝為隱性孔雀石綠和隱性結晶紫， 同時還發(fā)現(xiàn)孔雀石綠和結晶紫在光照條件下也容易降解[2]。 孔雀石綠、 結晶紫及其代謝物具有高殘留、 高毒性、 高致畸和高致癌性， 對人們的健康構成了潛在的威脅[3]。 我國于2002 年已將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》[4]。

目前， 國家標準中檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的方法主要有高效液相色譜（HPLC）法、熒光色譜法和高效液相色譜－串聯(lián)質譜法等[5～6]，但這些方法的前處理過程繁瑣。 超臨界流體既有與氣體相當?shù)母邼B透力和低黏度， 又兼有與液體相近的密度和對物質優(yōu)良的溶解能力[7]。 近年來， 超臨界流體色譜（SFC）法作為一種新的分析技術引起了研究人員的廣泛關注[8]。 由于SFC 法使用低黏度的CO2作為主要流動相， 其流速和分離速度均比HPLC法快。 同時， SFC 法僅使用少量的有機溶劑作為流動相的改性劑， 有機溶劑消耗量低于HPLC 法[8]。因此， 與其他色譜技術相比， SFC 技術的分離效率更高、 速度更快、 選擇性更好且消耗成本相對較低[9]。 超臨界流體萃取（SFE）技術是一種清潔、 高效并且有較好選擇性的新型綠色分離方法， 具有高回收率、 低能耗、 無污染、 操作簡便等優(yōu)點[10]。SFE 是國際上最先進的物理萃取技術， 是近代化工分離中出現(xiàn)的高新技術， 其利用超臨界CO2優(yōu)良的溶解力， 實現(xiàn)將基質與萃取物有效分離[11]。 這項技術可以避免有毒有機溶劑的使用、 耗能高及萃取率低等問題， 從而解決傳統(tǒng)提取技術導致的諸多問題[12]。 本研究采用在線超臨界流體萃取－超臨界流體色譜－串聯(lián)質譜 （Online SFE－SFC－MS/MS）法， 建立了快速測定水產(chǎn)品中孔雀石綠、 結晶紫及其代謝物殘留量的分析方法。

一、 材料與方法

（一） 試劑與儀器

1. 標準物質。 孔雀石綠 （純度 80.0%）、 結晶紫 （純度 91.6%）、 隱性孔雀石綠 （純度 96.8%）、隱性結晶紫 （純度 99.6%）、 氘代結晶紫 （純度99.7%）、 氘代隱性結晶紫 （純度 99.2%）， 均購自北京曼哈格生物科技有限公司； 氘代孔雀石綠 （純度99.8%） 和氘代隱性孔雀石綠 （純度99.9%） 均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

2. 試劑。 乙腈 （色譜純， 美國Fisher Scientific試劑公司）， 甲醇 （色譜純， 美國 Fisher Scientific試劑公司）。 超臨界流體萃取專用空白濾紙片（Miyazaki Hydro-Protect， 日本島津公司）。

3. 儀器。 Nexera UC 在線超臨界流體萃取/ 超臨界流體色譜串聯(lián)LCMS－8060 三重四極桿質譜儀（日本島津公司）； Shim-pack UC－X RP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm， 3 μm）； CPA225D 型十萬分之一精密電子天平 （德國賽多利斯集團）； ME203 型千分之一電子天平 （德國賽多利斯集團）。

（二） 標準溶液的制備

1. 標準品混合儲備液的制備。 精密稱取孔雀石綠、 結晶紫、 隱性孔雀石綠、 隱性結晶紫標準品10 mg 至100 mL 容量瓶中， 分別加入乙腈稀釋至刻度， 搖勻， 制成每1 mL 分別含孔雀石綠、 結晶紫、 隱性孔雀石綠、 隱性結晶紫 100 μg 的溶液，作為標準品儲備液。 分別精密量取上述標準儲備液各 100 μL 至同一 50 mL 容量瓶中， 用乙腈稀釋至刻度， 搖勻， 即得濃度均為200 ng/mL 的標準品混合儲備液。

2. 內(nèi)標混合標準液的制備。 精密稱取氘代孔雀石綠、 氘代結晶紫、 氘代隱性孔雀石綠、 氘代隱性結晶紫標準品10 mg 至100 mL 容量瓶中， 分別加入乙腈稀釋至刻度， 搖勻， 制成每1 mL 分別含氘代孔雀石綠、 氘代結晶紫、 氘代隱性孔雀石綠、氘代隱性結晶紫100 μg 的溶液， 作為內(nèi)標標準儲備液。 分別精密量取上述內(nèi)標標準儲備液各50 μL至同一50 mL 容量瓶中， 用乙腈稀釋至刻度， 搖勻， 即得濃度均為100 ng/mL 的內(nèi)標混合標準液。

（三） 實驗條件

1. 萃取條件。 萃取劑 A 為超臨界 CO2， B 為含0.1%甲酸的甲醇， 萃取劑比例為95∶5 （V/V），萃取流速為3 mL/min， 萃取溫度為40℃， 萃取時背壓 A 為 14.8 MPa， 背壓 B 為 15 MPa， 采取先靜態(tài)萃取4 min， 再動態(tài)萃取3 min 的方式進行萃取。

2. 色譜條件。 色譜柱為Shim-pack UC－X RP C18色譜柱 （150 mm×4.6 mm， 3 μm）； 流動相 A為超臨界CO2， B 為含0.1%甲酸的甲醇， 流速為2 mL/min， 柱溫為 40℃， 采用 5%B （7 min） →30%B（10～15 min）→5%B （15.1～17 min） 的梯度洗脫程序， 洗脫時背壓 A 為 15 MPa， 背壓 B 為 40 MPa。

3. 質譜條件。 正離子檢測模式； 離子源為電噴霧離子源 （ESI）； 離子源溫度為 400℃； 脫溶劑管溫度為200℃； 加熱模塊溫度為400℃； 霧化氣流量為 3 L/min； 加熱氣流量為15 L/min； 干燥氣流量為5 L/min； 其他質譜參數(shù)見表1。

表1 多反應監(jiān)測 （MRM） 掃描模式的參數(shù)

（四） 樣品制備與測定魚去鱗、 去皮， 沿背脊取肌肉部分； 蝦去頭、 殼、 腸腺， 取肌肉部分。均質粉碎均勻 （糊狀）， 于－20 ℃保存， 待測。

將待測樣品解凍， 準確稱取1 g （精確到0.001 g）， 加入 50 μL 同位素內(nèi)標混合標準液， 使內(nèi)標最終測定質量為5 ng。 加入超臨界流體萃取試劑盒中脫水劑1 包， 攪拌均勻， 放入5 mL 規(guī)格超臨界流體萃取裝置的萃取罐中， 待上機測定。

以超臨界狀態(tài)的CO2為萃取劑， 加入體積分數(shù)為5%的含0.1%甲酸的甲醇作為夾帶劑， 按照上文的超臨界流體萃取條件及超臨界流體色譜條件進行萃取、 測定。

二、 結果與分析

（一） 流動相組成對檢測結果的影響超臨界流體色譜為達到更好的分離效果， 往往要在超臨界CO2流體中加入少量的改性劑。 由于乙醇的黏度相對較高， 導致系統(tǒng)壓力升高， 長期使用可能會影響色譜柱的使用壽命[13]。 本研究在建立色譜條件過程中考察了超臨界CO2－甲醇和超臨界CO2－乙腈兩種洗脫體系， 用乙腈作改性劑時， 孔雀石綠峰形出現(xiàn)分叉現(xiàn)象 （見圖1A）； 用甲醇作改性劑時， 4 種目標物質峰形尖銳對稱， 分離效果好， 且響應良好（見圖1B）。 最終， 確定甲醇作為改性劑進行梯度洗脫。

圖1 不同洗脫體系檢測結果色譜圖對比

（二） 萃取溫度對檢測結果的影響溫度會對萃取效果產(chǎn)生一定的影響， 一般情況下， 在超臨界流體萃取過程中， 萃取效果會隨著溫度的升高而增強。 在研究中保持其他條件一致， 根據(jù)環(huán)境溫度考察了35℃、 40℃下孔雀石綠、 隱性孔雀石綠、 結晶紫、 隱性結晶紫4 種目標物質的萃取效果， 結果見圖 2。 如圖 2 所示， 當萃取溫度為 40℃時， 4 種目標物質的響應值更高， 因此選擇40℃作為最佳萃取溫度條件。

圖2 不同萃取溫度下檢測結果色譜圖對比

（三） 改性劑比例對檢測結果的影響在確定甲醇作為改性劑后， 考察了甲醇在萃取劑中的不同比例對萃取效果的影響， 結果見圖3。 研究中保持其他條件一致， 甲醇的體積分數(shù)從2%升到5%時，孔雀石綠、 隱性孔雀石綠、 結晶紫、 隱性結晶紫4種目標物質的萃取效果顯著增強， 最終將甲醇的體積分數(shù)確定為5%來作為改性劑比例的最優(yōu)條件。

圖3 不同比例改性劑的檢測結果色譜圖對比

（四） 方法的標準曲線線性精密吸取標準品混合儲備液 50、 100、 200、 300、 500、 800、 1 000 μL， 用乙腈稀釋至 1.0 mL， 搖勻， 配制成系列標準曲線工作液 （10、 20、 40、 60、 100、 160、 200 ng/mL）。 以超臨界流體萃取專用空白濾紙片為基質， 放入5 mL 規(guī)格超臨界流體萃取裝置的萃取罐中， 分別精密吸取上述系列標準曲線工作液及內(nèi)標混合標準液各50 μL 于基質表面， 使內(nèi)標最終測定質量為5 ng。 按照本研究選取的超臨界流體萃?。R界流體色譜－串聯(lián)質譜法檢測條件進行測定。以峰面積為縱坐標， 標準品質量（ng）為橫坐標， 進行線性回歸， 得到各組分的回歸方程及相關系數(shù)（見表2）。 由表2 可見， 方法在試驗范圍內(nèi)線性關系良好。

表2 各組分線性關系測定結果

（五） 方法的定量限以空白蝦肉樣品作基質，稱取1.0 g， 用乙腈稀釋標準品混合儲備液， 取稀釋后的標準品溶液及內(nèi)標混合標準液各50 μL 分別于上述空白基質表面， 混勻， 按照本研究選取的在線超臨界流體萃取－超臨界流體色譜－串聯(lián)質譜法檢測條件測定， 記錄峰面積。 在信噪比S/N 約為10 時測得最低檢測濃度為0.5 μg/kg， 即定量限為0.5 μg/kg。

（六） 方法的回收率與精密度分別以空白蝦肉和空白魚肉樣品作基質， 稱取1.0 g， 分別精密吸取濃度為10、 40、 100 ng/mL 的標準曲線工作液及內(nèi)標混合標準液各50 μL 于空白基質表面， 使內(nèi)標最終測定質量為5 ng， 混勻。 按照本研究選取的超臨界流體萃?。R界流體色譜－串聯(lián)質譜法檢測條件提取測定， 將峰面積代入回歸方程進行計算加樣回收率， 結果見表3。 結果顯示， 在0.5～5 ng/g 的加標范圍內(nèi)， 水產(chǎn)品中孔雀石綠、 結晶紫、隱形孔雀石綠、 隱性結晶紫的回收率范圍分別為89.7%～97.7%、 96.3%～99.9%、 90.4%～96.8%、94.7%～99.9%， 相對標準偏差（RSD）范圍分別為5.3%～7.1%、 4.9%～7.9%、 5.2%～8.9%、 5.7%～6.6%。 Online SFE－SFC－MS/MS 色譜圖見圖 4。

表3 樣品回收率及精密度結果 （n＝6）

圖4 樣品中孔雀石綠、 結晶紫、 隱形孔雀石綠、 隱性結晶紫的回收率Online SFE－SFC－MS/MS 色譜圖 （添加濃度為 0.5 μg/kg）

（七） 實際樣品分析應用本研究建立的方法對35 份魚樣品和15 份蝦樣品中孔雀石綠、 結晶紫及其代謝物進行測定， 僅有1 份樣品檢出孔雀石綠， 反映出近年來經(jīng)過有關部門的大力監(jiān)管， 水產(chǎn)品中孔雀石綠、 結晶紫的使用明顯減少， 人民飲食安全得到了較好的保障。

三、 討論與結論

目前， 國內(nèi)檢測孔雀石綠、 結晶紫及其代謝物的國家標準方法[6]中， 樣品在加入內(nèi)標后， 需用乙腈超聲、 勻漿提取兩次后再經(jīng)固相萃取柱凈化， 凈化液旋蒸后定容方可用液相色譜－串聯(lián)質譜測定。提取過程還需洗滌勻漿刀頭以避免提取過程中的損失， 整個實驗過程通常耗費4～5 h， 處理過程繁瑣， 耗時較長。 本研究建立了在線超臨界流體萃取－超臨界流體色譜－串聯(lián)質譜法來快速自動化檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠、 結晶紫及其代謝物的殘留量， 樣品只需簡單粉碎后加入脫水劑及內(nèi)標物即可直接上機， 簡化了樣品前處理操作， 且整個檢測過程僅需要30 min 左右。 同時使用分流閥， 在孔雀石綠、 結晶紫及其代謝物4 種目標物質到達質譜儀之前將部分流動相切換為廢液， 通過方法優(yōu)化， 只將目標分析物送入質譜儀， 從而進一步防止未經(jīng)凈化的樣品進入質譜造成污染。

與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比， 本研究選用的流動相為超臨界CO2和含0.1%甲酸的甲醇。 實驗過程中僅加入少量甲醇， 方法具有綠色環(huán)保、 試劑成本低的優(yōu)點。 而在流動相中加入適量甲酸， 可在離子化過程中得到更加豐富的離子碎片信息， 提高測定的靈敏度。 定量方法則采用內(nèi)標法， 加入穩(wěn)定的同位素內(nèi)標物氘代孔雀石綠 （D5－MG）、 氘代隱性孔雀石綠（D6－LMG）、 氘代結晶紫 （D6－CV）、氘代隱性結晶紫 （D6－LCV） 進行校正， 降低了由于超臨界萃取過程中4 種目標化合物萃取不充分所帶來的偏差， 從而提高了定量測定的準確性， 加標回收率的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均符合食品理化檢測規(guī)范的要求。