馮 悅 潘燁燦 孟瑞媛 卯明彩 邱 靜 錢(qián)永忠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100081）

生姜是草本植物姜的根莖， 是常用的藥食兩用中藥材。 近年來(lái)， 國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)生姜具有抗炎鎮(zhèn)痛、 降血糖血脂、 抗抑郁、 止嘔等作用， 可以用于治療糖尿病、 關(guān)節(jié)炎、 神經(jīng)性炎癥、 術(shù)后嘔吐等疾病， 并且可以預(yù)防阿爾茨海默癥及部分癌癥[1]。生姜中重要的特征成分是姜辣素類化合物[2]， 其可分為姜酚類、 姜烯酚類、 姜酮類等不同類型， 主要成分有 6－姜酚、 8－姜酚、 10－姜酚、 6－姜烯酚、8－姜烯酚、 10－姜烯酚和6－姜二酮等[3]。

動(dòng)物模型是研究人類疾病的重要工具[4]。 近年來(lái)， 斑馬魚(yú)憑借其體積小、 生殖周期短、 基因組和人類基因組有高度同源性等優(yōu)勢(shì)， 已經(jīng)成為國(guó)際認(rèn)可的新型模式生物[5]。 目前， 斑馬魚(yú)已被應(yīng)用到評(píng)估抗血管生成藥物的模型系統(tǒng)中， 利用其胚胎研究抗血管生成劑的報(bào)道越來(lái)越多[6]。 斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因品系Tg（fli1∶EGFP）憑借其在熒光顯微鏡下清晰可見(jiàn)的血管， 已經(jīng)成為廣泛應(yīng)用于食品、 藥物研究領(lǐng)域的一種理想的抗血管生成高通量藥物篩選模型[7]，被用于評(píng)估化學(xué)合成小分子或天然產(chǎn)物的抗血管生成活性[8]。 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg（fli1∶EGFP）是將 friend leukemia integration 1 （Fli1） 轉(zhuǎn)錄因子與增效綠色熒光蛋白 （EGFP） 結(jié)合， 導(dǎo)致EGFP在胚胎的所有血管中普遍表達(dá)。 這些轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎血管系統(tǒng)的時(shí)間延遲成像顯示， 斑馬魚(yú)已經(jīng)存在的血管系統(tǒng)中有節(jié)段間血管 （ISV）、 腸下靜脈血管（SIV）和背縱吻合血管（DLAV）的萌芽[9]。 斑馬魚(yú)的血管發(fā)育與人類等高級(jí)脊椎動(dòng)物非常相似， 開(kāi)始于原腸胚形成時(shí)期， 并貫穿于整個(gè)生命過(guò)程[10]。 目前， 利用斑馬魚(yú)分析天然植物提取物是否具有抗血管生成作用已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)。 MUHAMMAD 等[11]通過(guò)斑馬魚(yú)胚胎實(shí)驗(yàn)測(cè)試， 發(fā)現(xiàn)天丹植物提取物會(huì)抑制斑馬魚(yú) ISV、 SIV 和 DLAV 的形成。 LAM 等[12]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)諾比列酮破壞斑馬魚(yú)ISV 的形成。 還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)， 肉桂[13]、 硫酸多糖[14]等一些天然提取物均會(huì)抑制斑馬魚(yú)新生血管的形成。

1971 年， FOLKMAN[15]通過(guò)研究提出血管是腫瘤發(fā)生和發(fā)展基礎(chǔ)的觀點(diǎn)， 他認(rèn)為腫瘤的生長(zhǎng)分為無(wú)血管期和血管期， 在后續(xù)研究中， 他進(jìn)一步提出， 通過(guò)抑制腫瘤血管生成來(lái)切斷腫瘤的血液和營(yíng)養(yǎng)成分供應(yīng)從而達(dá)到阻止腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的治療方法， 這種治療方式也稱為 “抗血管生成治療”。 目前， 大量的研究證實(shí)血管在腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵性作用[16]。 在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中， 需要周圍血管提供比正常組織更充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣， 同時(shí)也需要血管運(yùn)輸呼吸和代謝廢物。 因此， 腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展往往會(huì)刺激正常休眠的血管系統(tǒng)萌芽出新的血管， 來(lái)幫助和維持腫瘤的生長(zhǎng)， 并為部分腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供途徑。 以腫瘤血管為治療靶點(diǎn)， 抑制其生成或破壞其存在就可以切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，最終達(dá)到抑制腫瘤快速生長(zhǎng)、 轉(zhuǎn)移的目的。 目前，抑制腫瘤血管生成已經(jīng)成為腫瘤治療的新策略， 而且這種治療方式對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒副作用小[17]。

血管形成初期主要由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）介導(dǎo)， VEGF 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化、 增殖和遷移， 是血管生成的關(guān)鍵參與者。 抑制VEGF 等關(guān)鍵血管生成因子可以抑制新生血管的生成。 VEGF相關(guān)基因家族包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子 （PGF）[18]。 通常人們所說(shuō)的 VEGF 一般為 VEGF－A。 VEGF－A 不僅在正常胚胎血管發(fā)育和腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用[19]，還對(duì)維持成熟血管的穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)血管滲透性有關(guān)鍵作用[20]， 所有血管化組織均可表達(dá)VEGFA。 人類VEGFA基因由8 個(gè)外顯子組成， 經(jīng)過(guò)選擇性外顯子剪接， 得到由 121、 145、 165、 189 和 206 個(gè)氨基酸殘基組成的5 種異構(gòu)體， 分別命名為VEGF121、VEGF145、 VEGF165、 VEGF189、 VEGF206[21]。 在 斑 馬魚(yú)中， 存在人VEGFA基因的同源基因vegfaa和vegfab[22]。vegfb、vegfc和vegfd在早期斑馬魚(yú)胚胎中均有大量表達(dá)， 而vegfc[23]主要表達(dá)于斑馬魚(yú)的心臟、 腎臟、 肺和血管平滑肌細(xì)胞等。 Flt4 是一種Vegf 受體， 由特異性配體Vegfc 激活后產(chǎn)生的信號(hào)通路可以促進(jìn)血管生成和淋巴管生成[24]。

因此， 本文采用血管特異性轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚(yú)Tg（fli1∶EGFP）， 通過(guò)分析 8－姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)胚胎 SIV 生成、 活性氧 （ROS） 含量、 腺嘌呤核苷三磷酸 （ATP） 水平以及血管生成相關(guān)基因vegfaa、vegfc、flt4表達(dá)的影響， 來(lái)進(jìn)行 8－姜烯酚抗血管生成作用及機(jī)制研究， 以期尋找新的潛在的天然抗腫瘤成分。

一、 材料與方法

（一） 動(dòng)物、 材料與試劑轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)fli1∶EGFP購(gòu)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心。 將成年的雌雄斑馬魚(yú)分開(kāi)飼養(yǎng)在養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)， 養(yǎng)殖水為處理后的純水， 調(diào)節(jié) pH 與電導(dǎo)率后使用， 缸內(nèi)環(huán)境 pH 為7.5±1， 水溫維持在 （28.5±1）℃， 光暗周期為 14 h/10 h， 每日喂食斑馬魚(yú)豐年蝦2 次、 高蛋白固體飼料1 次。

8－姜烯酚標(biāo)準(zhǔn)品 （純度≥99.8%， 天津阿爾塔科技有限公司）； S0026 ATP 檢測(cè)試劑盒、 S0033M活性氧檢測(cè)試劑盒、 P0010S BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒 （碧云天生物技術(shù)有限公司）。

三氯甲烷、 異丙醇、 無(wú)水乙醇 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 二甲基亞砜 （DMSO， 北京百靈威科技有限公司）。

（二） 儀器與設(shè)備斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng) （中國(guó)海圣有限公司）； SZX2－ILLT 體式顯微鏡、 BX53 熒光顯微鏡 （日本 Olympus 公司）； RXM 智能型人工氣候箱 （中國(guó)江南儀器廠）； ST 16R 高速冷凍離心機(jī) （美國(guó) Thermo Fisher 公司）； SCDEALL VXIII 多管渦旋振蕩儀 （北京踏錦科技有限公司）；Q800R3 超聲波儀 （美國(guó)Qsonica 公司）； 熒光定量PCR 儀 （上海宏石醫(yī)療器械有限公司）。

（三） 實(shí)驗(yàn)方法

1. 活性成分暴露液的配制。 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果， 稱取適量8－姜烯酚標(biāo)準(zhǔn)品， 用DMSO 溶解至終濃度2 000 mg/L， 將藥液裝至10 mL 棕色玻璃瓶中， 做好濃度、 名稱和時(shí)間等標(biāo)記， 放置于－20℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 斑馬魚(yú)胚胎的篩選和暴露。 試驗(yàn)前一天晚上將4～6 月性成熟的雌雄轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)fli1∶EGFP以1∶1 的比例放入帶隔板的產(chǎn)卵缸中， 次日早上9 點(diǎn)開(kāi)燈后抽去隔板， 約2 h 后收集胚胎， 胚胎用純水沖洗3 次后在體式顯微鏡下挑選發(fā)育正常且處于同一發(fā)育時(shí)期的斑馬魚(yú)胚胎， 放置在6 孔板中， 每孔30 枚胚胎及 3 mL 斑馬魚(yú)培養(yǎng)水。 分別設(shè)置空白對(duì)照組（僅有3 mL 培養(yǎng)水）、 溶劑對(duì)照組（DMSO 的最終濃度為0.1%）、 8－姜烯酚不同濃度實(shí)驗(yàn)組 （8－姜烯酚最終濃度為 50、 200、 500、1 000 mg/mL）、 陽(yáng)性藥對(duì)照組 （PTK－787 最終濃度為1 μg/mL）。 給藥后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24 h 更換培養(yǎng)水重新給藥。

3. 抗血管生成效果觀察。 給藥 3 d 后， 在不同實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)fli1∶EGFP中分別隨機(jī)選取10 條幼魚(yú)， 用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)fli1∶EGFP幼魚(yú)血管的發(fā)育情況， 拍照并記錄， 以分析8－姜烯酚對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)fli1∶EGFP胚胎血管生成的影響。

4. 評(píng)估8－姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)發(fā)育的毒性作用。在受精后 48、 72、 96 h （hpf）， 使用體式顯微鏡觀察各實(shí)驗(yàn)組胚胎發(fā)育情況， 對(duì)胚胎是否受精卵凝固、 是否缺乏體節(jié)形成、 是否尾部不脫落、 是否無(wú)心跳活力、 是否存在大體形態(tài)缺陷進(jìn)行目視檢查。

5. ROS 含量測(cè)定。 每組實(shí)驗(yàn)組取 30 條幼魚(yú)（72 hpf， 質(zhì)量約 10 mg）， 置于 1.5 mL 離心管內(nèi)，加入 100 μL 磷酸鹽緩沖液 （PBS）， 在 0℃下超聲破碎 5 min， 4℃條件下 8 000 g 離心 10 min， 置冰上待用。 在 1.5 mL 離心管內(nèi)， 取 95 μL 上清液，最后加入 5 μL 稀釋 100 倍（100 μmol/L）后的探針。錫箔紙避光， 轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管內(nèi)， 置于恒溫振蕩器上， 37℃條件下 150 r/min 孵育 30 min。 孵育結(jié)束之后再轉(zhuǎn)移至96 孔板內(nèi)， 使用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、 發(fā)射波長(zhǎng)525 nm 處進(jìn)行測(cè)定。

6. ATP 水平測(cè)定。 每組實(shí)驗(yàn)組取 30 條幼魚(yú)（72 hpf， 質(zhì)量約 10 mg）， 置于 1.5 mL 離心管內(nèi)，每組加入 100 μL 裂解液， 在 0℃下超聲破碎 10 min， 裂解后在 4 ℃條件下 12 000 g 離心 5 min，取上清液， 用于后續(xù)的測(cè)定。 加入 100 μL ATP 檢測(cè)工作液到檢測(cè)管內(nèi)。 室溫放置3～5 min， 以使本底性的ATP 全部被消耗掉， 在檢測(cè)孔或檢測(cè)管內(nèi)加入20 μL ATP 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品， 迅速用移液槍混勻， 至少間隔2 s 后， 使用多功能酶標(biāo)儀的luminometer 功能進(jìn)行檢測(cè)。 使用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)樣品蛋白量， 以消除樣品制備時(shí)由于蛋白量的差異而造成的誤差。

7. 總 RNA 提取。 加 1 mL 的 Trizol Reagent 至勻漿管， 置于冰上預(yù)冷， 另取 100 mg 組織， 加入勻漿管中， 使用勻漿儀充分研磨直至無(wú)可見(jiàn)組織塊后振蕩混勻， 靜置 1 min， 以 12 000 r/min 離心 10 min 后取上清液。 加入 250 μL 三氯甲烷， 顛倒離心管 30s， 充分混勻， 靜置 5min， 在 4℃下以 12 000 r/min 離心15 min， 將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入0.8 倍體積的異丙醇， 顛倒混勻后在－20℃冰箱放置 20 min。 在 4℃下以 12 000 r/min 離心 10 min， 得到的管底白色沉淀為RNA。 吸去多余液體，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀， 在4℃下以12 000 r/min 離心 5 min。 重復(fù)洗滌 1 次， 將多余液體吸除干凈， 將離心管置于超凈臺(tái)上靜置1 min 后加入適量 RNase free water 溶解。 最后， 在 55℃ 孵育 5min。檢測(cè)RNA 濃度及純度， 并對(duì)濃度過(guò)高的RNA 進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋， 使其終濃度達(dá)到1 000 ng/μL。

8. 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)血管生成相關(guān)基因的表達(dá)。 依據(jù)說(shuō)明書(shū)用cDNA 合成試劑盒反向轉(zhuǎn)錄RNA， 然后使用熒光定量PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。 以cDNA 為模板， 加入相關(guān)引物用熒光定量PCR 儀擴(kuò)增各目的基因。 擴(kuò)增結(jié)束后，以β－actin為內(nèi)參基因， 用 2－ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算各基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。 引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列

（四） 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 25.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析， 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、 結(jié)果與分析

（一） 8-姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)胚胎SIV生成的抑制作用通過(guò)用不同濃度的8－姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)Tg（fli1∶EGFP） 胚胎進(jìn)行處理， 確定了當(dāng) 8－姜烯酚劑量為500、 1 000 mg/mL 時(shí)， 斑馬魚(yú)胚胎的 SIV具有較為明顯的抑制作用 （見(jiàn)圖1）， 且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。 如圖1 所示， 與空白對(duì)照組相比， 當(dāng)劑量為500 mg/mL 時(shí)， 斑馬魚(yú)腸下靜脈血管新生面積明顯縮小。 當(dāng)劑量為1 000 mg/mL 時(shí)， 實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)腸下靜脈血管生成出現(xiàn)缺失。 此外， 溶劑對(duì)照組胚胎的SIV 是完好無(wú)損， 發(fā)育正常的。 實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性藥對(duì)照組的斑馬魚(yú)腸下靜脈血管均出現(xiàn)了形態(tài)的異?；蛉笔?， 抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)。

圖1 8-姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)Tg（fli1∶EGFP） 腸下靜脈血管生成的抑制作用

（二） 8-姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育毒性對(duì)本文實(shí)驗(yàn)濃度下8－姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)胚胎是否具有發(fā)育毒性進(jìn)行了觀測(cè)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 用8－姜烯酚處理后的斑馬魚(yú)胚胎中沒(méi)有觀察到明顯的發(fā)育異常（見(jiàn)圖 2）。 如圖 2 所示， 在 48、 72、 96 hpf 時(shí)， 實(shí)驗(yàn)組胚胎的發(fā)育和表型與空白對(duì)照組胚胎相似， 各劑量實(shí)驗(yàn)組均無(wú)明顯的致胚胎死亡和畸形的趨勢(shì)。因此， 使用本文實(shí)驗(yàn)濃度進(jìn)行8－姜烯酚抗血管治療時(shí)， 不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性作用。

圖2 8－姜烯酚對(duì) 48 hpf、 72 hpf、 96 hpf 斑馬魚(yú)Tg（fli1∶EGFP） 生長(zhǎng)發(fā)育的影響

（三） 8-姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)胚胎中ROS 產(chǎn)生的抑制作用為明確8－姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)SIV 的抗血管作用機(jī)制， 對(duì)給藥后72 hpf 的斑馬魚(yú)Tg（fli1∶EGFP） 胚胎的ROS 含量進(jìn)行了檢測(cè)， 結(jié)果見(jiàn)圖3A。 由圖 3A 可知， 與空白對(duì)照組相比， 500 mg/mL、 1 000 mg/mL 8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組均會(huì)抑制斑馬魚(yú)胚胎中的ROS 生成， 8－姜烯酚濃度高時(shí)， 斑馬魚(yú)胚胎中的ROS 降低趨勢(shì)更明顯。 與空白對(duì)照組相比， 500 mg/mL、 1 000 mg/mL 8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組 ROS 相對(duì)含量極顯著下降 （P＜0.01）， 陽(yáng)性藥對(duì)照組 ROS 相對(duì)含量顯著升高 （P＜0.05）。 ROS 相對(duì)含量的下降表明8－姜烯酚可能通過(guò)ROS－Vegf 信號(hào)通路發(fā)揮抑制血管生成的作用， 因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)8－姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)胚胎中血管生成相關(guān)基因表達(dá)的影響進(jìn)行了研究。

圖3 8-姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)胚胎中ROS （A） 含量和ATP （B） 水平的影響

（四） 8-姜烯酚對(duì)ATP 消耗和線粒體功能障礙的抑制作用為進(jìn)一步研究8－姜烯酚是否對(duì)線粒體功能具有保護(hù)作用， 本文對(duì)給藥后的斑馬魚(yú)胚胎的ATP 水平進(jìn)行了檢測(cè)。 每組取30 個(gè)胚胎， 在6 hpf 將溶解在DMSO 中的8－姜烯酚加到胚胎培養(yǎng)水中， 使其最終工作濃度為500、 1 000 mg/mL，在28℃下處理胚胎72 h。 ATP 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3B。如圖3B 所示， 與空白對(duì)照組相比， 8－姜烯酚有效提高了斑馬魚(yú)胚胎的ATP 水平， 1 000 mg/mL 8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組 ATP 相對(duì)水平顯著上升 （P＜0.05）。該研究結(jié)果說(shuō)明8－姜烯酚可能對(duì)線粒體功能具有保護(hù)作用， 但仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)證明。

（五） 8-姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)胚胎中血管生成相關(guān)基因表達(dá)的影響研究發(fā)現(xiàn)， 8－姜烯酚會(huì)抑制斑馬魚(yú)胚胎中ROS 的生成， 為了驗(yàn)證8－姜烯酚是否通過(guò)ROS－Vefg 途徑抑制斑馬魚(yú)胚胎的SIV 生成，本文采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)血管生成相關(guān)基因vegfaa、vegfc、flt4的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)圖4。 由圖4A 可知， 與溶劑對(duì)照組相比， 500 mg/mL 8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組vegfaamRNA相對(duì)表達(dá)量下調(diào)， 1 000 mg/mL 8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性藥對(duì)照組vegfaamRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào) （P＜0.05）。 由圖 4B 可知， 與溶劑對(duì)照組相比，500 mg/mL 8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組、 1 000 mg/mL 8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組vegfcmRNA 相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)（P＜0.01）， 陽(yáng)性藥對(duì)照組vegfcmRNA 相對(duì)表達(dá)量高度顯著下調(diào) （P＜0.001）。 由圖 4C 可知， 500 mg/mL 8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組、 1 000 mg/mL 8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組flt4mRNA 相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào) （P＜0.01）， 陽(yáng)性藥對(duì)照組flt4mRNA相對(duì)表達(dá)量高度顯著下調(diào) （P＜0.001）。 結(jié)果顯示， 與溶劑對(duì)照組相比， 各組mRNA 相對(duì)表達(dá)量均下降， 且具有濃度依賴性。 該結(jié)果表明， 8－姜烯酚能夠抑制斑馬魚(yú)胚胎血管生成相關(guān)基因的表達(dá)。

圖4 8-姜烯酚對(duì)斑馬魚(yú)Tg（fli1∶EGFP） 血管生成相關(guān)基因 vegfaa （A）、 vegfc （B）、 flt4 （C） 表達(dá)的影響

三、 討論

生姜是人們生活中常用的調(diào)味品， 也是一種中藥材。 研究表明， 生姜的化學(xué)成分復(fù)雜， 具有抗炎、 抗菌、 抗氧化、 抗腫瘤等多種藥理作用[25]。 目前有關(guān)于生姜抗腫瘤作用的研究主要集中在姜辣素成分， 且多集中于其中的姜酚、 姜烯酚、 姜酮等[26]。6－姜酚作為姜酚類最主要的成分[27]， 其在抗腫瘤領(lǐng)域被廣泛研究[28]， 但國(guó)內(nèi)外關(guān)于生姜其他成分抗腫瘤的相關(guān)研究很少， 8－姜烯酚抗腫瘤作用的研究更是未見(jiàn)報(bào)道。 本文中， 8－姜烯酚處理導(dǎo)致血管特異性轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚(yú)SIV 生成被抑制， 從而證明了8－姜烯酚具有抗血管生成功能。

與哺乳動(dòng)物相似， Vegfaa 對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)的血管生成發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[29]， 抑制vegfaa基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)軸向血管及節(jié)段間血管不能正常生長(zhǎng)發(fā)育[30]。 本文中高濃度8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組vegfaa、vegfc、flt4mRNA 相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)， 說(shuō)明 8－姜烯酚可以通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體基因flt4， 以及內(nèi)皮細(xì)胞之外的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子配體基因vegfaa和vegfc的表達(dá)， 來(lái)產(chǎn)生抗血管生成的作用。 有研究表明，flt4不僅在斑馬魚(yú)早期發(fā)育過(guò)程中參與了血管的形成和造血的發(fā)生， 還在各種癌組織中存在不同程度的異常表達(dá)，并與臨床腫瘤分期、 病理分級(jí)、 腫瘤淋巴管生成等均有密切關(guān)系[17]。 通過(guò)對(duì)人各種癌癥腫瘤組織檢查發(fā)現(xiàn)FLT4表達(dá)水平和VEGFC表達(dá)聯(lián)系密切， 與癌癥的臨床轉(zhuǎn)移和病人的生存緊密相關(guān)[17]。VEGF－C、 FLT4 增強(qiáng)了癌細(xì)胞的移動(dòng)性和侵襲性，促進(jìn)了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[31]。 本文中500 mg/mL 8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組和1 000 mg/mL 8－姜烯酚實(shí)驗(yàn)組的vegfc、flt4基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)， 證明8－姜烯酚具有潛在抗腫瘤作用。

目前， VEGF 受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注。 根據(jù)研究， ROS 是人的 VEGFR－2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中介物[32]， 可以刺激誘導(dǎo) VEGF 分泌[33]。ZHANG 等[34]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， G－Rh2 可以以劑量依賴的方式去除KB 細(xì)胞的ROS， 通過(guò)減少ROS 的產(chǎn)生抑制血管生成的信號(hào)， 從而阻斷抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。 細(xì)胞內(nèi)高水平的ROS 不僅會(huì)參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡， 也是腫瘤及其他許多疾病的共同發(fā)病機(jī)制， 而且與線粒體損傷關(guān)系密切[34]。 本文結(jié)果顯示， 高、 中濃度的 8－姜烯酚均會(huì)抑制斑馬魚(yú)胚胎中的ROS 生成， 并有效提高斑馬魚(yú)胚胎的ATP 水平。 這說(shuō)明8－姜烯酚會(huì)通過(guò)抑制ROS 生成來(lái)減少ATP 的消耗， 同時(shí)也說(shuō)明8－姜烯酚可能對(duì)線粒體功能具有保護(hù)作用， 但仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)證明。

四、 結(jié)論

綜上所述， 8－姜烯酚具有明顯的抗斑馬魚(yú)血管生成的作用， 可以降低斑馬魚(yú)胚胎ROS 的含量，并能有效提高斑馬魚(yú)胚胎中的ATP 水平， 通過(guò)減少 ROS 的產(chǎn)生，vegfaa、vegfc、flt4基因的表達(dá)水平下降， 血管生成的信號(hào)被抑制， 腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移可以被阻斷。 因此， 8－姜烯酚可以通過(guò)ROSVefg 信號(hào)通路發(fā)揮抑制血管生成的作用， 從而可能具有潛在的抗癌效果。