高 迪，胡楚嬌，龍家寰，魏 進(jìn)，張 盈，段婷婷*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥衛(wèi)生管理學(xué)院，貴州 貴陽 550006)

吊瓜(TrivhosantneskirilouiiManim)，別名栝樓、瓜蔞等，葫蘆科栝樓屬植物，多年生攀援草木，雌雄異株，分布于我國遼寧、華東、華北、西南等地區(qū)[1]?！侗静菥V目》中有記載“瓜蔞仁，潤肺燥、降火、治咳嗽、利咽喉、止清渴”，無特殊味道，食用方式多樣。吊瓜仁富含脂肪油、三萜皂苷和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，具有優(yōu)良的保健與食用功能，因此吊瓜已經(jīng)成為市面上“藥食同源”的休閑食品新選擇[2]。伴隨著吊瓜田間種植面積的擴(kuò)大，其病蟲害問題日益凸顯出來。當(dāng)前吊瓜上的主要病蟲害有：根結(jié)線蟲病、炭疽病、病毒病、透翅蛾、菱斑食植瓢蟲和瓜藤天牛等[3-4]，目前并沒有在吊瓜上登記的農(nóng)藥，經(jīng)過文獻(xiàn)查詢并結(jié)合實(shí)地走訪發(fā)現(xiàn)，吊瓜病蟲害的防治藥劑主要是烯酰嗎啉、敵敵畏、乙基多殺菌素、三唑酮和戊唑醇等[5]，參照農(nóng)業(yè)部明令禁止使用的農(nóng)藥名單[6]，本試驗(yàn)選取烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇進(jìn)行研究。

目前，關(guān)于烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇在常見農(nóng)副產(chǎn)品上的殘留檢測多有相關(guān)報(bào)道，如草莓、葡萄、獼猴桃和辣椒等[7-10]，同時(shí)隨著這3種藥劑的使用范圍擴(kuò)大，其在中藥材上的農(nóng)藥殘留問題也逐漸得到重視，如三七、枸杞、人參等[11-13]。常見的檢測方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)等，當(dāng)前尚未見能同時(shí)檢測吊瓜上烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇的試驗(yàn)方法。由于吊瓜富含油脂和色素，基質(zhì)成分較復(fù)雜，現(xiàn)有的檢測方法無法滿足吊瓜上的農(nóng)藥殘留檢測條件，因此本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇3種農(nóng)藥在吊瓜上的殘留檢測方法；同時(shí)在貴州省息烽縣九莊鎮(zhèn)吊瓜種植基地進(jìn)行農(nóng)藥殘留田間試驗(yàn)，對試驗(yàn)后的吊瓜樣品進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS，UItimate 3000/TSQ Vantage)，美國Thermo Fisher公司)；Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.1 μm，美國Thermos Fisher公司)；CK 200型高通量組織研磨器(北京托摩根生物有限公司)；電子分析天平(精度0.0001 g，德國sartorius公司)，XW-80A 渦旋儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；TG 16-Ⅱ 離心機(jī)(湖南平凡科技有限公司)。

烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.7%，北京勤誠亦信科技開發(fā)有限公司)；乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品(純度94.2%，北京勤誠亦信科技開發(fā)有限公司)；戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.8%，北京勤誠亦信科技開發(fā)有限公司)；乙腈(分析純，天津市歐米克公司)、氯化鈉(分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)；甲酸(分析純，天津市歐米克公司)；無水硫酸鎂(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，德國默克公司)；無水乙酸(色譜純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)； PSA、GCB [安捷倫科技(中國)有限公司];0.22 μm有機(jī)系濾膜(日本島津公司)。

吊瓜樣品采自貴州息烽九莊鎮(zhèn)吊瓜基地，試驗(yàn)按照1.4節(jié)進(jìn)行。

1.2 樣品前處理

稱取5.0 g均質(zhì)吊瓜瓜子仁于50 mL塑料離心管，加入10 mL含1%乙酸的乙腈溶液和10 mL蒸餾水，渦旋振蕩15 min，加入4.0 g無水MgSO4、2.0 g NaCl混勻，渦旋振蕩5 min后于5000 r/min條件下離心5 min，移取1.5 mL上清液于裝有10 mg GCB、100 mg PSA、和150 mg無水MgSO4的2 mL離心管中，渦旋1 min，離心5 min，取上清液過0.22 μm的有機(jī)系濾膜，待測。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱，100 mm×2.1 mm，2.1 μm，流動相及梯度洗脫條件見表1。柱溫∶40 ℃；進(jìn)樣量∶5 μL，自動進(jìn)樣器進(jìn)樣；進(jìn)樣盤溫度∶10 ℃。

表1 流動相及梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離源模式：電噴霧離子化(ESI)；離子源極性∶烯酰嗎啉、乙基多殺菌素、戊唑醇均為ESI+；霧化氣：氮?dú)猓磺蕷饬魉伲?5 arb，輔助氣流速：10 arb；噴霧電壓：3 200 V；毛細(xì)管溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：330 ℃。3種農(nóng)藥具體保留時(shí)間、檢測離子對、錐孔電壓和碰撞能量表等參數(shù)見表2。

表2 3種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 田間試驗(yàn)樣品殘留檢測

參照NY/T 788-2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》，于2020年8月下旬在貴州省貴陽市息烽縣九莊鎮(zhèn)吊瓜種植基地進(jìn)行烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇在吊瓜上的殘留試驗(yàn)，吊瓜品種為越蔞3號。選取合適的種植地，將4株劃分為一個(gè)小區(qū)，共計(jì)8個(gè)小區(qū)，在6個(gè)小區(qū)各噴施20%烯酰嗎啉懸浮劑(900倍液)、60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑(30 mL/667m2)和430 g/L戊唑醇懸浮劑(17 mL/667m2)各一次，每個(gè)藥劑設(shè)置2個(gè)平行，剩余2個(gè)小區(qū)設(shè)置為空白對照。待吊瓜成熟后，于收獲期采樣，按照1.2節(jié)的前處理方式和1.3節(jié)的儀器條件進(jìn)行3種農(nóng)藥的殘留檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

在殘留檢測常用的提取劑有丙酮、甲醇和乙腈等，其中液相色譜法常用的提取劑以乙腈為主，而加入少量冰乙酸能使整體提取液偏弱酸性，提高烯酰嗎啉和戊唑醇的穩(wěn)定性，同時(shí)降低提取的雜質(zhì)，因此本試驗(yàn)選擇了1%冰乙酸乙腈作為提取劑。

目前常用的樣品凈化劑有PSA、GCB，主要用于去除樣品中的油脂和色素等雜質(zhì)，這恰好是吊瓜樣品中最主要的兩種雜質(zhì)，而無水MgSO4則常用于去除樣品中的水分，因此本試驗(yàn)將選擇PSA和GCB作為凈化劑。為了驗(yàn)證其凈化效果，本試驗(yàn)嘗試了3種凈化劑：凈化劑1 (100 mg PSA+150 mg無水MgSO4)、凈化劑2 (100 mg PSA+10 mg GCB)、凈化劑3 (100 mg PSA+150 mg無水MgSO4+10 mg GCB)。對空白樣品中進(jìn)行添加水平為0.1 mg/kg的回收率檢測試驗(yàn)(如表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用凈化劑1進(jìn)行前處理時(shí)，乙基多殺菌素(-L)的回收率約為121%，使用凈化劑2進(jìn)行前處理時(shí)，烯酰嗎啉的回收率約為68%，使用凈化劑3時(shí)，3種農(nóng)藥的回收率均在80%～105%之間，符合NY/T 788-2018標(biāo)準(zhǔn)要求的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，因此將使用凈化劑3(100 mg PSA+150 mg無水MgSO4+10 mg GCB)對后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行樣品前處理。

表3 3種凈化劑對3種農(nóng)藥的平均添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2 線性范圍及基質(zhì)效應(yīng)

中國、日本、美國、歐盟、CAC等國家和機(jī)構(gòu)暫沒有制定吊瓜上關(guān)于烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇的農(nóng)藥殘留最大限量(MRL)，根據(jù)歐盟規(guī)定的暫無MRL值的參考值(0.01 mg/kg)，本試驗(yàn)將0.01 mg/kg作為參考MRL，分別配置0.001、0.005、0.01、0.05和0.1 mg/L等5個(gè)濃度的溶劑標(biāo)溶液和基質(zhì)標(biāo)溶液，其中基質(zhì)為空白樣品最終凈化的溶液。經(jīng)過UPLC-MS/MS檢測后，分別以峰面積和濃度為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，統(tǒng)計(jì)得到對應(yīng)的線性回歸方程(表4)。結(jié)果表明，在0.001～0.1 mg/L的線性范圍內(nèi)，3種農(nóng)藥的線性關(guān)系良好，同時(shí)相關(guān)系數(shù)均大于0.99，故此條件能滿足檢測要求。

表4 3種農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)

質(zhì)譜檢測中經(jīng)常出現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)或減弱的基質(zhì)效應(yīng)，為提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，一般都會采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比(K)來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)[12]。結(jié)果表明，3種農(nóng)藥在吊瓜仁中基質(zhì)效應(yīng)在0.54～0.64之間，表現(xiàn)為中等基質(zhì)抑制效應(yīng)，為減少基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響，后續(xù)試驗(yàn)將采用基質(zhì)標(biāo)曲線進(jìn)行藥劑定量分析。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度

分別在空白吊瓜樣品中設(shè)置4個(gè)添加水平0.001、0.01、0.05和0.1 mg/kg的烯酰嗎啉、乙基多殺菌素、戊唑醇，每個(gè)添加水平5次重復(fù)。使用1.2節(jié)的前處理方式和1.3節(jié)的儀器條件進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)得到相應(yīng)各濃度的平均回收率和RSD，詳細(xì)結(jié)果如表5。

表5 4個(gè)添加水平下3種農(nóng)藥的平均添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

結(jié)果表明，檢測結(jié)果均符合NY/T 788-2018標(biāo)準(zhǔn)要求的回收率和RSD。因此烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇3種農(nóng)藥的最低添加濃度即為其對應(yīng)的定量限(LOQ)和檢出限(LOD)，即0.001 mg/kg，低于本試驗(yàn)設(shè)定的參考MRL(0.01 mg/kg)，因此本試驗(yàn)建立的檢測方法可運(yùn)用于吊瓜上烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇的農(nóng)藥殘留相關(guān)檢測。

2.4 實(shí)際樣品分析

采用本文的試驗(yàn)方法對收獲期吊瓜樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在吊瓜上施用20%烯酰嗎啉懸浮劑、60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑和430 g/L戊唑醇懸浮劑后，僅戊唑醇有殘留檢出，檢出量約為0.002 mg/kg，其余兩種農(nóng)藥在吊瓜瓜子仁上的殘留量均低于LOD(0.001mg/kg)。檢測結(jié)果證實(shí)：上述3種農(nóng)藥在吊瓜上的殘留檢出量均低于歐盟規(guī)定的暫無MRL值的參考值(0.01 mg/kg)。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測吊瓜上烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇3種農(nóng)藥的檢測方法。該方法簡便、快速、高效，可廣泛運(yùn)用在吊瓜中農(nóng)藥殘留的相關(guān)研究中。通過對田間按照推薦劑量施用過20%烯酰嗎啉懸浮劑、60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑和430 g/L戊唑醇懸浮劑的吊瓜樣品進(jìn)行殘留檢測發(fā)現(xiàn)，施藥后40 d采收的吊瓜瓜子仁農(nóng)藥殘留檢測均未超過MRL值，可安全采收食用。