李艷華， 張樹逍， 楊 陽， 徐廣健， 鄧啟文

銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌，在自然界分布廣泛，可致肺囊性纖維化和對免疫功能低下的患者有致死性[1-2]。因其具有較強(qiáng)形成生物膜的能力，使它成為臨床上難治性病原體之一。生物膜是嵌在細(xì)胞外聚合物基質(zhì)中的微生物群落。隨著生物膜的形成，這些病原體表現(xiàn)出對抗生素的極端耐受性，并保護(hù)其逃避宿主免疫清除[3-6]。

棘白菌素類抗真菌藥物包括卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈，被認(rèn)為是治療與生物膜形成相關(guān)的念珠菌血癥的一線藥物[7-8]。這些抗真菌藥物對β- （1， 3） -D-葡聚糖合成酶具有非競爭性的抑制作用。β- （1， 3） -D-葡聚糖合成酶催化UDP-葡萄糖聚合成 β-（1， 3） -D-葡聚糖，為真菌細(xì)胞壁和念珠菌生物膜細(xì)胞外聚合基質(zhì)的主要成分[9-10]。而在銅綠假單胞菌感染患者的血清中檢測到β- （1，3）-D-葡聚糖，對比研究證實(shí)，高濃度米卡芬凈可抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成[9，11-12]。前期研究表明，米卡芬凈對銅綠假單胞菌無抑菌和殺菌作用，但可明顯抑制多重耐藥銅綠假單胞菌生物膜的形成，而且還能清除成熟的生物膜，清除率達(dá)15.43%～30.87%[13]。本研究以米卡芬凈為基礎(chǔ)，探索聯(lián)合具有抑菌、殺菌作用的抗生素頭孢他啶是否可增強(qiáng)對銅綠假單胞菌生物膜感染的治療效果，為臨床治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 選取4株銅綠假單胞菌生物膜強(qiáng)陽性菌株，均分離于華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院臨床送檢的痰標(biāo)本（實(shí)驗(yàn)室編號：銅綠假單胞菌04、05、27、40），經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS， Germany）鑒定。質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853，菌株均保存于－80℃超低溫冰箱。

1.1.2 儀器與試劑 MALDI-TOF MS、酶標(biāo)儀購自法國生物梅里埃公司，LB培養(yǎng)基購自青島日水生物技術(shù)有限公司，結(jié)晶紫購自上海斯信科技有限公司，米卡芬凈（商品目錄號：M888201）、頭孢他啶（商品目錄號：C832496）購自中國MCE公司，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞刮棒購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性試驗(yàn) 根據(jù)CLSI M100-S27文件在陽離子調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton肉湯（CAMHB）中采用肉湯微量稀釋法測定抗菌藥物對浮游細(xì)菌和生物膜的MIC。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。抗菌藥物使用前先用無菌蒸餾水溶解，然后用CAMHB培養(yǎng)基稀釋。生物膜相細(xì)菌通過24孔細(xì)胞培養(yǎng)板構(gòu)建生物膜，37℃靜置培養(yǎng)4 d，每24小時(shí)更換一次新鮮LB培養(yǎng)基，然后用無菌生理鹽水沖洗3次后， 細(xì)胞刮棒刮取培養(yǎng)板表面生物膜細(xì)胞，收集于50 mL無菌塑料管中[14]，輕輕混合稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?。重懸后的生物膜用革蘭染色檢查生物膜結(jié)構(gòu)，見圖1。

1.2.2 藥物單用與聯(lián)合對細(xì)菌生物膜形成的作用 將銅綠假單胞菌菌株傳代2次，取單個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)基，振搖過夜，用LB培養(yǎng)基1∶200稀釋后加入96孔培養(yǎng)板（100 μL/孔），37℃靜態(tài)培養(yǎng)6 h后，添加含不同藥物的新鮮LB培養(yǎng)基（100 μL/孔）。設(shè)米卡芬凈組（米卡芬凈終濃度：10、20、40、80、160、320、640、1 280、2 560、5 120、10 240 mg/L），頭孢他啶組（頭孢他啶終濃度 ：1/32×MIC、1/16×MIC、1/8×MIC、1/4×MIC、1/2×MIC），米卡芬凈聯(lián)合頭孢他啶組（頭孢他啶終濃度同單藥組，米卡芬凈終濃度 10 000 mg/L[9，11-12]），對照組加入生理鹽水；37℃靜態(tài)培養(yǎng)24 h后，棄上清液，生理鹽水漂洗培養(yǎng)板3次，室溫晾干，加99%甲醇固定15 min，去除甲醇后晾干，加0.5%的結(jié)晶紫染色10 min，棄染液，無菌生理鹽水漂洗3次，室溫晾干，加95%乙醇（200 μL/孔）溶解染料20 min，轉(zhuǎn)移各孔溶液150 μL/孔至新的96孔板，通過酶標(biāo)儀測定570 nm吸光度值（D）檢測生物膜的量，比較生物膜變化情況[15]。根據(jù)D值計(jì)算抑制率：抑制率（%）=（對照組D570nm－藥物組D570nm） /對照組D570nm。

1.2.3 藥物單用與聯(lián)合對成熟生物膜的清除作用 同上述稀釋的菌懸液200 μL接種至96孔培養(yǎng)板，37℃靜置培養(yǎng)，每24小時(shí)更換等體積的新鮮LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d后，用無菌生理鹽水洗滌3次，加入含不同藥物的新鮮LB培養(yǎng)基（200 μL/孔），設(shè)米卡芬凈組同上、頭孢他啶組（頭孢他啶終濃度 ：1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC），米卡芬凈聯(lián)合頭孢他啶組（頭孢他啶終濃度同單藥組，米卡芬凈終濃度 10 000 mg/L[9，11-12]），通過結(jié)晶紫染色半定量法檢測米卡芬凈和頭孢他啶對銅綠假單胞菌成熟生物膜清除作用，根據(jù)D值計(jì)算清除率： 清除率（%）=（對照組D570nm－干預(yù)組D570nm） /對照組D570nm。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間方差齊采用Student-t檢驗(yàn)，方差不齊采用近似t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性試驗(yàn)

生物膜形成后，頭孢他啶對3株銅綠假單胞菌的MIC增加了4～8倍；當(dāng)米卡芬凈存在時(shí)，頭孢他啶對3株銅綠假單胞菌的MIC降低50%，見表1。

表1 銅綠假單胞菌對抗菌藥物敏感性試驗(yàn)Table1 Antimicrobial susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa

2.2 米卡芬凈對生物膜的作用

米卡芬凈對所有細(xì)菌的生物膜形成均有明顯的抑制和清除活性，但有效濃度各不相同（見圖2、圖3），對生物膜形成和成熟生物膜活性均有劑量依賴性，隨藥物濃度增加，抑制率和清除率逐步提高，抑制率最高可達(dá)64.86%～72.30%，清除率最高可達(dá)62.13%～64.48%，見表2。

表2 米卡芬凈對銅綠假單胞菌生物膜的抑制和清除Table 2 The inhibition and eradication rates of micafungin on Pseudomonas aeruginosa biofilm （%）

2.3 藥物聯(lián)合對生物膜的作用

亞抑菌濃度的頭孢他啶對銅綠假單胞菌被膜的形成有明顯的抑制作用，但與米卡芬凈聯(lián)用表現(xiàn)出拮抗作用，對被膜形成的抑制效果低于米卡芬凈單用（見表3、圖4）；高濃度頭孢他啶對成熟被膜也有明顯的清除作用，但與米卡芬凈聯(lián)合僅1株（PA04）表現(xiàn)出協(xié)同作用，清除效果高于米卡芬凈單用，對其余3株菌表現(xiàn)拮抗作用，效果低于米卡芬凈單用（見表4、圖5）。

表3 頭孢他啶對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制率Table 3 The inhibition rate of ceftazidime on P. aeruginosa biofilm formation （%）

表4 頭孢他啶對銅綠假單胞菌成熟生物膜的清除率Table 4 The eradication rate of ceftazidime on the mature biofilm formed by P. aeruginosa （%）

3 討論

米卡芬凈通過非競爭性抑制 β-（1， 3）-D-葡聚糖的合成而發(fā)揮抗真菌作用，而銅綠假單胞菌生物膜基質(zhì)中存在周質(zhì)葡聚糖， 其中高度甘油磷酸化β-（1→3）葡聚糖，具有封閉抗生素、減慢或阻止抗生素分子擴(kuò)散到其活性位點(diǎn)的作用[16-17]。而此成分與侵襲性真菌感染的外周血β-（1→3）葡聚糖反應(yīng)性試驗(yàn)存在交叉反應(yīng)，因此，米卡芬凈很有可能具有潛在的抗銅綠假單胞菌生物膜作用。研究結(jié)果證實(shí)高濃度米卡芬凈能明顯抑制銅綠假單胞菌生物膜形成[9，11-12]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)低濃度的米卡芬凈對銅綠假單胞菌生物膜也有抑制作用，并呈濃度依賴性，隨著米卡芬凈濃度增加，抑制作用逐步增大。但這種抗生物膜作用的濃度依賴性仍需體內(nèi)試驗(yàn)和臨床研究的驗(yàn)證。同時(shí)，在研究中還發(fā)現(xiàn)米卡芬凈可以提高銅綠假單胞菌生物膜對頭孢他啶的敏感性，這可能與米卡芬凈破壞了生物膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了抗菌劑通過受損的生物膜滲透有關(guān)[9，11-12]。因此，這使得米卡芬凈聯(lián)合抗生素治療銅綠假單胞菌生物膜感染成為可能。

頭孢他啶是一種重要的抗假單胞類細(xì)菌的抗生素，研究證實(shí)亞抑菌濃度的頭孢他啶通過降低銅綠假單胞菌黏附和多糖基質(zhì)合成的lecA、lecB、pel和psl基因的表達(dá)，從而抑制其生物膜的形成，并呈現(xiàn)藥物濃度依賴性[18-19]。在本研究中也觀察到了這種藥物濃度依賴性；此外，我們還研究了頭孢他啶對成熟生物膜的清除能力，但其對成熟生物膜的清除能力弱于對生物膜形成的抑制能力，這可能提示應(yīng)用頭孢他啶治療早期銅綠假單胞菌感染可防止生物膜在體內(nèi)定植。

本研究發(fā)現(xiàn)，米卡芬凈與亞抑菌濃度的頭孢他啶聯(lián)合抑制銅綠假單胞菌生物膜形成表現(xiàn)出拮抗作用，聯(lián)合用藥抑制生物膜效果差于米卡芬凈單用，且與高濃度頭孢他啶聯(lián)合時(shí)有3株也表現(xiàn)出拮抗作用，對成熟生物膜的清除效果弱于米卡芬凈單用，但有1株菌（PA04）表現(xiàn)出聯(lián)合后的協(xié)同作用，這與Kissoyan等[12]報(bào)道一致，但Kissoyan等僅研究了1株臨床菌株，造成此種差異作用可能與米卡芬凈與頭孢他啶聯(lián)合的作用機(jī)制及不同菌株可能存在的耐藥機(jī)制不同有關(guān)，目前尚無相關(guān)機(jī)制報(bào)道，仍需進(jìn)一步深入研究。