李 磊，方 云，夏詠梅，范夢琦，樊 曄

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，2.化學(xué)與材料工程學(xué)院,合成與生物膠體教育部重點實驗室,無錫 214122）

囊泡尤其是脂肪酸囊泡（FAV）對研究生命起源現(xiàn)象具有極其重要的理論意義［1～3］，并對藥物傳輸系統(tǒng)具有重要的應(yīng)用價值［4］. 但脂肪酸僅在其表觀pKa附近極窄的pH區(qū)間內(nèi)形成脂肪酸囊泡［5］，不利于理論研究和實際應(yīng)用. 添加其它雙親分子與脂肪酸共組裝［6］及脂肪酸化學(xué)改性［7］均可增強脂肪酸囊泡的穩(wěn)定性，但外加多官能團小分子的方式更為簡便. 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些堿性小分子（如膽堿［8］、核酸堿基［9］、精氨酸［10］以及賴氨酸［11］等）會影響脂肪酸囊泡，短鏈胺（如二乙烯三胺）會使油酸囊泡（OAV）的pH窗口向堿性拓寬［12］，中長鏈伯胺與脂肪酸形成復(fù)合脂肪酸囊泡［13］，而長鏈季銨鹽則與脂肪酸形成所謂陰-陽離子囊泡［14，15］. 相關(guān)研究較多報道共存小分子對脂肪酸囊泡穩(wěn)定性的客觀影響，但尚未深入和系統(tǒng)地比較共存小分子結(jié)構(gòu)對脂肪酸囊泡形成及穩(wěn)定性的影響，以及其機理和規(guī)律. 綜上所述，由于各種胺類小分子與脂肪酸及其囊泡的分子間相互作用信息尚不夠明晰，因而對其作用機理有各種推測. 由于各種胺類分子結(jié)構(gòu)影響脂肪酸形成脂肪酸囊泡的形貌和尺度各不相同，因而對其影響脂肪酸囊泡pH窗口的能力也尚未進行比較. 此外，發(fā)現(xiàn)短鏈多元醇的碳橋長度和羥基數(shù)目均會影響脂肪酸囊泡的形成［16］，推測短鏈胺的碳橋長度和氨基多寡也會影響脂肪酸囊泡. 因此，本文將以油酸作為囊泡砌塊，選用乙二胺等3種不同碳橋長度的二元胺，以及二乙烯三胺等3種不同氨基數(shù)目的多元胺，探究兩者間相互作用對油酸囊泡pH窗口的影響，并與4種長鏈伯胺或季銨鹽與油酸形成的共組裝囊泡進行比較，以探討胺類分子結(jié)構(gòu)對油酸囊泡pH窗口的影響.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

油酸（OA，A. R. 級），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二胺（A. R. 級）、1，3-丙二胺（純度≥99%）、1，4-丁二胺（A. R. 級）、二乙烯三胺（DETA，C. P. 級）、三乙烯四胺（C. P. 級）、四乙烯五胺（C. P. 級）和十二烷基三甲基溴化銨（DTAB，純度≥99%），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；辛胺（純度≥99%）和十二胺（DA，純度≥98%），上海麥克林生化科技有限公司；十八胺（純度≥96%），北京伊諾凱科技有限公司；N，N-二羥乙基甘氨酸（Bicine，純度≥99%，Ruibio進口分裝），合肥博美生物科技有限公司；其它試劑均為分析純；實驗用水均為超純水，電阻率18.2 MΩ·cm.

FE-20型pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DDSJ-308A 型電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；VHX-1000C 型超景深三維顯微鏡，Keyence（香港）有限公司；TU1950型雙光束紫外-可見分光光度計（UV-Vis），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MicroCal VP-ITC型等溫滴定量熱儀（ITC），英國Malvern Panalytical儀器有限公司.

1.2 油酸囊泡的pH窗口判斷及形貌表征

用0.01 mol/L 的NaOH 溶液分別配制油酸（5 mmol/L）及二乙烯三胺（0.5 mmol/L）溶液，25 ℃下用0.1 mol/L 的鹽酸溶液分別滴定，獲得pH 滴定曲線. 用0.1 mol/L 的NaOH 溶液分別配制各種二元胺、多元胺以及長鏈胺系列儲備液，再用其配制油酸濃度為5 mmol/L的樣品分散液，參照文獻［17，18］中丁達爾效應(yīng)的方法判斷pH窗口. 取5 μL處于上述pH窗口兩端的樣品分散液滴于載玻片上，用超景深三維顯微鏡（2500倍）觀察組裝體的形貌.

1.3 油酸囊泡凍融穩(wěn)定性測試

用0.1 mol/L Bicine-NaOH 緩沖液（pH=8.7）配制油酸及二元胺/多元胺-油酸分散液并測定凍融性能［19］，將二元胺/多元胺-油酸分散液于-18 ℃下冷凍24 h后，轉(zhuǎn)移至40 ℃下靜置24 h，循環(huán)3次，用超景深三維顯微鏡表征其形貌.

1.4 等溫滴定量熱測試

向樣品池內(nèi)注入1.4 mL 的油酸緩沖溶液（pH=8.1，4 mmol/L；pH=10.2，1 mmol/L），參比池注入同體積的超純水，于300 r/min 轉(zhuǎn)速及（25±0.1）℃條件下，采用28 滴（10 μL）自動加樣滴定模式（兩滴間時間間隔為240 s）加入20 mmol/L DETA 溶液. 校正實驗以DETA 溶液滴定對應(yīng)pH 值的緩沖液獲得稀釋熱，各體系量熱實驗數(shù)據(jù)扣除相應(yīng)稀釋熱后，得到DETA與油酸相互作用的熱數(shù)據(jù). 采用結(jié)合模型對數(shù)據(jù)進行擬合，獲得相互作用的熱力學(xué)參數(shù). 向樣品池內(nèi)注入1.4 mL的十二胺（pH=8.7，0.43 mmol/L；pH=11.4，0.27 mmol/L）或DTAB（pH=7.5，0.6 mmol/L；pH=11.3，0.6 mmol/L）緩沖溶液，用6 mmol/L油酸溶液按上述步驟進行滴定和數(shù)據(jù)處理.

1.5 結(jié)合能的計算

采用Gaussian 16軟件［20］對DETA與油酸分子/離子之間的弱相互作用進行理論計算.

2 結(jié)果與討論

2.1 短鏈胺-油酸囊泡的pH窗口、形貌及穩(wěn)定性

根據(jù)文獻［12］報道，DETA的氨基隨pH的變化在質(zhì)子化與去質(zhì)子化間轉(zhuǎn)變，并與脂肪酸發(fā)生靜電和氫鍵等豐富變化的相互作用. 調(diào)節(jié)氨基與脂肪酸的比例，能構(gòu)筑擬雙子表面活性劑結(jié)構(gòu)單元，可產(chǎn)生豐富的形貌［21］. 而己二胺與棕櫚酸形成多層大囊泡（MLV）維持其體系的穩(wěn)定性［22］. 本文通過激光丁達爾效應(yīng)確定二元胺/多元胺-油酸分散體系隨pH變化所對應(yīng)的膠束-囊泡-乳液-分相的各相區(qū)邊界，其中典型的二乙烯三胺-油酸體系見圖1，激光丁達爾效應(yīng)隨外觀及pH降低而變化，由此可較為清晰地判斷囊泡相邊界，進而確定囊泡的pH窗口.

Fig.1 Determination of the pH window for OAV of DETA?OA and other phase boundaries of the suspension corresponding to pH change by aid of the laser Tyndall effect observation

Fig.2 DETA?OA(molar ratio 0.1∶1.0)suspensions of pH?VHCl curve,conductometric(κ)?VHCl curve and the related laser Tyndall effects(inset)(A),correlation of the pH titration curves of sodium soap of 5 mmol/L OA(B1) and 0.5 mmol/L DETA(B2) by 0.1 mol/L HCl solution to schematically illus?trate molecular interactions between OA and DETA, optical micrographs of OAV on the near neutral?side pH window(C)and the alkaline?side pH window(D)corresponding to(A)at 25°C

將典型的二乙烯三胺-油酸（摩爾比0.1∶1.0）體系的相區(qū)分界標(biāo)注于pH 滴定曲線上［圖2（A）］，圖2（A）插圖為圖1中代表4種典型分散狀態(tài)的樣品瓶，表示所在的不同相區(qū)；圖2（A）中電導(dǎo)（k）曲線的谷底與油酸囊泡相區(qū)相對應(yīng)，佐證了激光丁達爾效應(yīng)判斷油酸囊泡pH窗口的可信性；其它5種短鏈胺-油酸（摩爾比0.1∶1.0）體系均有與此相似的結(jié)果（圖S1，見本文支持信息），可以用于比較各種短鏈胺對油酸囊泡pH窗口的影響. 圖2（B1）和（B2）關(guān)聯(lián)了油酸鈉皂和二乙烯三胺的pH滴定曲線，根據(jù)不同pH區(qū)間二乙烯三胺及油酸所對應(yīng)的不同電離狀態(tài)，可以分析油酸囊泡的pH窗口兩端各種分子-離子間的相互作用，可見主要緣于二乙烯三胺的質(zhì)子化和去質(zhì)子化隨pH的變化而轉(zhuǎn)變，并引起與油酸間的氫鍵、離子-偶極相互作用及靜電相互作用的變化. pH窗口堿性端主要為氫鍵和離子-偶極相互作用，而近中性端除此之外，還可能存在靜電相互作用. 圖2（C）和（D）為圖2（A）中囊泡pH窗口兩端的超景深三維顯微鏡圖像，證實均存在2～5 μm 的MLV 型油酸囊泡. 其它5 種短鏈胺-油酸體系的類似結(jié)果見圖S2（本文支持信息），其中除MLV外的少量非球形囊泡，可能為球形囊泡的融合或裂分所致，或與排水率（PRW）有關(guān)的亞穩(wěn)態(tài)囊泡［23］. 除乙二胺-油酸和丙二胺-油酸體系外，pH窗口近中性端囊泡尺寸總體上大于pH窗口堿性端. 將所有短鏈胺對油酸囊泡pH窗口的影響列于表1，發(fā)現(xiàn)pH窗口向堿性拓寬比向近中性拓寬顯著. 少量二元胺還會導(dǎo)致pH窗口雙向拓寬的效果，而多元胺中只有二乙烯三胺具有這種效果. 1，4-丁二胺向堿性拓寬效果最佳（pH=11.5），而二乙烯三胺向近中性拓寬效果最佳（pH=7.6）. 這些結(jié)果均可以用氨基隨pH變化發(fā)生質(zhì)子化和去質(zhì)子化轉(zhuǎn)變［圖2（B）］，從而導(dǎo)致與油酸及水分子間的相互作用及其變化予以解釋［10］.

Table 1 pH window for OAV formation of indiamine(or polyamine)-OA suspensions

通過ITC 測試體系的熱力學(xué)參數(shù)可以判斷非共價作用的類型［24］. 以二乙烯三胺-油酸體系為例，二乙烯三胺與油酸囊泡表面結(jié)合均為自由能降低的自發(fā)過程（△G＜0），且為放熱過程［圖3（A）和（B）］. pH 窗口近中性端（pH=8.1）的△H＜0，且△S＞0，表明涉及氫鍵和疏水作用. 由于二乙烯三胺的分子結(jié)構(gòu)不可能導(dǎo)致與油酸分子/離子間直接產(chǎn)生疏水作用，故該疏水作用應(yīng)該是兩者間氫鍵作用引起油酸分子/離子間更為顯著的疏水自組裝，從而有利于pH窗口近中性端拓寬至pH=7.6. pH窗口堿性端（pH=10.2）的△H＜0，且△S＜0，表明主要為氫鍵作用，這與圖2（B）的推斷相一致. 圖3（C）中二乙烯三胺與油酸的結(jié)合能計算值為負值，不僅支持圖3（A）和（B）中二乙烯三胺與油酸囊泡表面自發(fā)產(chǎn)生氫鍵（4～120 kJ/mol）及離子-偶極（50～200 kJ/mol）量級的相互作用［25］，而且支持圖2（B）中關(guān)于氫鍵和離子-偶極作用影響二乙烯三胺與油酸囊泡pH窗口變化的推斷. 圖3（A）和（B）中pH窗口近中性端的焓變減小程度小于pH窗口堿性端，表明前者的相互作用比后者弱，這導(dǎo)致短鏈胺使油酸囊泡pH窗口向堿性拓寬比向近中性拓寬顯著的實驗結(jié)果. 圖3（C）中近中性端的結(jié)合能大于堿性端，表明前者的相互作用比后者強，這與表1中的實驗結(jié)果表觀上相矛盾，但同時考慮二乙烯三胺與水的結(jié)合能就可以得到解釋. 由于pH窗口近中性端水分子與短鏈胺的結(jié)合能比堿性端更大，明顯的競爭結(jié)合作用將削弱短鏈胺與油酸的相互作用，因而才導(dǎo)致表1中堿性端拓寬更顯著的實驗事實. 同時，短鏈胺與油酸囊泡表面或水分子的相互作用及其競爭可能會影響囊泡的排水率［23］，從而影響囊泡的形貌（圖S2）.

溫度變化可能會影響脂肪酸囊泡的穩(wěn)定性而使其解體［26］，若二元胺或多元胺與油酸囊泡表面通過弱相互作用結(jié)合，則可以增強油酸囊泡的穩(wěn)定性［27，28］. 凍融循環(huán)1次和3次后［19］的超景深三維顯微鏡影像表明，體系中均有囊泡存在，囊泡的大小或形狀有些變化，且以形貌變化為主（圖S3，見本文支持信息）. 這可能與對圖S2現(xiàn)象的解釋一致［23］，該現(xiàn)象由短鏈胺-油酸-水分子之間的競爭結(jié)合及平衡所決定，但油酸囊泡相始終存在.

Fig.3 ITC of DETA titrating OAV in buffer solution at pH of 8.1(A1, A2) and 10.2(B1, B2) and binding energies between protonated/deprotonated DETA and OA or water(C)

2.2 中長鏈伯胺/季銨鹽-油酸囊泡的pH窗口、形貌及穩(wěn)定性

Fig.4 DA?OA suspension(molar ratio 1.0∶1.0)of appearance(inset)and turbidity with pH change(A),and optical micrographs on the near neutral?side and alkaline?side pH windows of two separated vesicular phases(B—E)

中短鏈脂肪酸（C4～C8）與中短鏈伯胺通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移共組裝為脂肪酸囊泡［29］，中長鏈伯胺與脂肪酸疏水共組裝為脂肪酸囊泡［13］，DTAB易與脂肪酸形成陰-陽離子囊泡［14，15］，但沉淀區(qū)（Precipitation zone，PZ）［30］會干擾激光丁達爾效應(yīng)的測定，改用濁度方法（25 ℃下測定樣品在400 nm 處的光密度OD400）測定該類體系的pH窗口. 典型的十二胺-油酸體系如圖4（A）所示，觀察到PZ相區(qū)兩端分別有兩個油酸囊泡相區(qū)，圖4（B）～（E）中超景深顯微鏡結(jié)果證實，存在MLV型油酸囊泡，此外囊泡粒徑隨pH增大而減小的趨勢較短鏈胺更為顯著. 類似得到的其它各體系油酸囊泡的pH窗口數(shù)據(jù)列于表2，表明新出現(xiàn)的酸性區(qū)域的油酸囊泡相區(qū)隨長鏈伯胺的碳鏈延長逐漸從無到有，隨著長鏈伯胺濃度的增大，從介穩(wěn)到穩(wěn)定. 原有的堿性區(qū)域的油酸囊泡相區(qū)拓展到強堿區(qū)域，從而使得膠束相區(qū)消失. 與長鏈伯胺相比，DTAB使油酸囊泡的pH窗口雙向拓寬且隨濃度的增加而增大，但其不僅使強堿性區(qū)域的膠束相恢復(fù)，而且在強酸性下造就的新囊泡，相比伯胺能夠更加長期穩(wěn)定，推斷這些均與DTAB在各種pH環(huán)境下均攜帶正電荷，因而強化與油酸的離子-偶極和靜電相互作用有關(guān)［14，15］.

Table 2 pH window for OAV formation in primary fatty amine-OA and DTAB-OA suspensions

Fig.5 ITC of OA titrating into DA(A1, A2, B1, B2) or DTAB(C1, C2, D1, D2) in buffer solution at pH of 8.7(A1,A2),11.3(B1,B2),7.5(C1,C2)and 11.4(D1,D2)

圖5 為堿性區(qū)域的囊泡相2的ITC結(jié)果，ΔH＜0且ΔS＞0表明十二胺或DTAB與油酸的相互作用涉及氫鍵和疏水作用，各pH下均存在疏水作用（ΔS＞0），也說明了十二胺或DTAB與油酸通過共組裝形成復(fù)合囊泡. 相較于DTAB，十二胺與油酸的相互作用焓變減小得更多，說明伯胺基與油酸羧基之間的氫鍵或離子偶極作用較DTAB的季銨基更為明顯. 而DTAB在堿性條件下與油酸相互作用的焓變較近中性側(cè)更小，體現(xiàn)了季銨基與油酸離子的羧酸基之間的靜電相互作用，支持了上述DTAB強化了與油酸的靜電相互作用的推斷.

2.3 胺類分子結(jié)構(gòu)對油酸囊泡pH窗口的影響

基于上述實驗結(jié)果，以油酸體系為參照，選取胺/油酸的摩爾比均為0.1∶1的DETA-油酸，DA-油酸和DTAB-油酸體系為例，比較各類代表體系中相區(qū)差異以及囊泡相區(qū)和膠束相區(qū)中分子間的相互作用，以闡釋胺類分子結(jié)構(gòu)對油酸囊泡pH 窗口影響的機理（Scheme 1）. 短鏈胺主要通過非共價鍵合作用，中長鏈胺與油酸形成油酸囊泡所需的“二聚體”，其在堿性范圍發(fā)揮與脂肪醇類似的作用［16，31］，以滿足形成油酸囊泡的堆積參數(shù)（P）的條件（1/2＜P＜1）［32］. 而DTAB在強酸和堿性條件下均以陽離子形式存在，并在堿性條件下形成鹽橋［33］.

Scheme 1 Schematic comparison of mechanism dominating the pH window of OAV by amines

3 結(jié)論

選取油酸作為囊泡砌塊，探究了二元胺、多元胺、中長鏈伯胺及DTAB 對油酸囊泡pH 窗口的影響. 采用激光丁達爾效應(yīng)觀察了二元胺（或多元胺）-油酸分散液相變. 結(jié)果表明，二元胺及多元胺均可使油酸囊泡的pH窗口向堿性拓寬，其中1，4-丁二胺向堿性側(cè)拓寬效果最佳（pH=11.5），而二乙烯三胺向近中性側(cè)拓寬效果最佳（pH=7.6）. ITC 實驗證明，二元胺或多元胺在油酸囊泡表面為非共價結(jié)合，而中長鏈伯胺及DTAB還可以與油酸通過疏水作用或靜電吸引形成共組裝囊泡，導(dǎo)致前者的調(diào)節(jié)功能弱于后者. 氨基的質(zhì)子化和脫質(zhì)子化隨pH的轉(zhuǎn)換是胺類分子調(diào)節(jié)油酸囊泡pH窗口的共同驅(qū)動力. 此研究對進一步深入探究小分子影響脂肪酸囊泡形成及其穩(wěn)定性的構(gòu)效關(guān)系，以及考察史前細胞的形成條件等均有參考價值.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20220144.