王利民 丁寧 臧思思 劉善鳳 王平

在臨床檢驗(yàn)工作中，血常規(guī)標(biāo)本鏡下血小板聚集導(dǎo)致PLT計(jì)數(shù)假性減低是檢驗(yàn)人員常遇到的問(wèn)題。如何有效糾正這類標(biāo)本的血小板計(jì)數(shù)，學(xué)者們[1-3]也進(jìn)行了一系列研究，其中提到可采取的方法有重新采血、更換抗凝劑、添加阿米卡星、劇烈震蕩等。另有研究報(bào)道[4]，邁瑞6、7系型號(hào)以上血液分析儀的光學(xué)法（PLT-O）對(duì)EDTA依賴性假性血小板減少（EDTA-PTCR）的標(biāo)本具有解離作用。這種方法操作簡(jiǎn)單，可盡快發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告且可避免患者再次采血，特別適用于門診標(biāo)本檢驗(yàn)。但血液分析儀PLT-O對(duì)不同程度的EDTA-PTCP標(biāo)本檢測(cè)的血小板計(jì)數(shù)值與實(shí)際值究竟有無(wú)差別，能否直接用于檢驗(yàn)報(bào)告的發(fā)放，是檢驗(yàn)人員尤為關(guān)注的問(wèn)題。本文針對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行研究報(bào)道分析。

對(duì)象與方法

1 對(duì)象 選取2020年4月～2021年5月我院門診患者EDTA-PTCR 53例標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，其中男性15例，女性38例，平均年齡為45±17歲；另選取25例血常規(guī)檢測(cè)鏡下無(wú)血小板聚集的健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性7例，女性18例，平均年齡為44±16歲。

2 試劑和儀器 BC6800血液分析儀（深圳邁瑞）及配套標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和試劑；邁瑞SC-120自動(dòng)血涂片制備儀、EDTA-K2抗凝真空采血管（武漢致遠(yuǎn)）、采血針、PLT稀釋液（草酸銨法稀釋液）、改良牛鮑氏計(jì)數(shù)板、CX顯微鏡（日本奧林巴斯）等。本實(shí)驗(yàn)室已通過(guò)ISO15189實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可，儀器性能驗(yàn)證達(dá)標(biāo)，儀器性能符合檢測(cè)要求。

3 方法 將確定為EDTA依賴性假性血小板減少的患者重新進(jìn)行靜脈采血，用EDTA-K2抗凝管采集血液2 mL放置20 min后（根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室采血到上機(jī)檢測(cè)的平均TAT時(shí)間），用邁瑞B(yǎng)C6800血液分析儀CDR模式進(jìn)行檢測(cè)，得到血小板電阻抗法（PLT-I）和PLT-O的檢測(cè)值，并同時(shí)進(jìn)行涂片染色鏡檢。血小板計(jì)數(shù)手工法（PLF-M）：靜脈血采集前，提前準(zhǔn)備好加有0.38 mL稀釋液（草酸銨）的EP管、20 μL毛細(xì)采樣管和棉球，EDTA-K2抗凝血采集后，立即擠出采血針管道內(nèi)殘留的血液，由檢驗(yàn)人員吸取20 μL血液加入EP管內(nèi)20倍稀釋，混勻，整個(gè)采集過(guò)程在90 s內(nèi)完成；由兩名資深的檢驗(yàn)員采用雙盲法嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[5]進(jìn)行PLT計(jì)數(shù)，取兩人兩次計(jì)數(shù)的平均值記為PLT-M（兩次計(jì)數(shù)的誤差＜5%）。再根據(jù)EDTA-K2抗凝管標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)每個(gè)標(biāo)本鏡下30個(gè)血小板聚集團(tuán)（≥3顆的聚集團(tuán)）的平均血小板數(shù)量又分成5組：PLT＜6顆、PLT 6顆～10顆、PLT 11顆～15顆、PLT 16顆～20顆、PLT＞20顆，以PLT-M值為靶值，CV≤2.5%（1/2美國(guó)CLIA，88能力驗(yàn)證計(jì)劃的分析質(zhì)量要求）作為判斷糾正合格的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)標(biāo)本的PLT-O值進(jìn)行計(jì)數(shù)糾正的合格統(tǒng)計(jì)，對(duì)不合格標(biāo)本進(jìn)行觀察分析。另隨機(jī)選取10份糾正合格的標(biāo)本，分別放置40 min、60 min后再統(tǒng)計(jì)儀器糾正計(jì)數(shù)合格數(shù)及涂片鏡檢。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。應(yīng)用SPSS 22.0軟件，采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組PLT-M、PLT-I及PLT-O結(jié)果 對(duì)照組PLT-I、PLT-O與PLT-M均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組PLT-I與PLT-M有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），PLT-O與PLT-M無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.317），見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組PLT-M、PLT-I及PLT-O結(jié)果

25組不同血小板聚集數(shù)標(biāo)本的直方圖和血涂片 根據(jù)鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)30個(gè)血小板聚集團(tuán)的平均血小板數(shù)量，將標(biāo)本分成5組：PLT＜6顆、PLT 6顆～10顆、PLT 11顆～15顆、PLT16顆～20顆、PLT＞20顆。每組各選取一例血小板實(shí)際計(jì)數(shù)正常標(biāo)本的血小板直方圖及顯微鏡下圖進(jìn)行展示，如圖1。從圖中可以看出，隨著血小板聚集顆粒數(shù)的增加，血小板直方圖的波峰呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，尾部都存在翹尾現(xiàn)象。

圖1 5組不同血小板聚集數(shù)標(biāo)本的直方圖和高倍鏡（10×40倍）下血涂片

3 5 組標(biāo)本的糾正計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì) 將53例標(biāo)本的PLT-O檢測(cè)值，以PLT-M值為靶值，CV≤12.5%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行糾正計(jì)數(shù)合格統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)PLT平均聚集顆粒數(shù)大于20顆時(shí)，PLT-O糾正計(jì)數(shù)的合格率很不理想。

表2 5組標(biāo)本的糾正計(jì)數(shù)合格統(tǒng)計(jì)表

4 糾正合格標(biāo)本和糾正失敗標(biāo)本血涂片對(duì)比 將PLT≤20顆PLT-O檢測(cè)結(jié)果糾正失敗標(biāo)本的涂片與糾正合格標(biāo)本的涂片油鏡下進(jìn)行對(duì)比，選取其中5份糾正失敗標(biāo)本和5份糾正合格標(biāo)本的涂片，見(jiàn)圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PLT-O計(jì)數(shù)糾正合格的標(biāo)本鏡下血小板聚集較疏松，基本能看清各血小板的界限，而糾正失敗的標(biāo)本鏡下血小板黏附聚集較致密，呈塊狀，各血小板之間的界限模糊或消失。

圖2 5例糾正合格和5例糾正失敗的標(biāo)本血涂片油鏡（10×100倍）下對(duì)比

5 另隨機(jī)選取10份糾正合格的標(biāo)本，分別放置40 min、60 min后再統(tǒng)計(jì)儀器糾正計(jì)數(shù)合格數(shù)量及涂片鏡檢。結(jié)果為：放置40 min后，糾正合格標(biāo)本數(shù)為7份；放置60 min后，糾正合格標(biāo)本數(shù)為5份。糾正合格的標(biāo)本鏡下血小板平均聚集顆粒數(shù)仍小于20顆，而新增糾正失敗的標(biāo)本鏡下血小板聚集的顆粒數(shù)出現(xiàn)了明顯的增加，且平均顆粒數(shù)均大于20顆。

討論

臨床上導(dǎo)致血常規(guī)標(biāo)本發(fā)生血小板聚集的主要原因有抗凝劑、血液采集因素、臨床藥物、冷凝集等。其中EDTA-PTCP是目前我們血常規(guī)檢測(cè)中最常遇到的鏡下血小板聚集案例。EDTA-PTCP如未及時(shí)發(fā)現(xiàn)，將為臨床提供錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果，從而導(dǎo)致不必要的血小板輸注、脾切除、皮質(zhì)類固醇等不當(dāng)治療，可能會(huì)導(dǎo)致手術(shù)的延遲、不必要的骨髓穿刺等一系列錯(cuò)誤的舉措[6-9]，同時(shí)易引起醫(yī)療糾紛。因此準(zhǔn)確識(shí)別EDTA-PTCP標(biāo)本、及時(shí)有效地糾正血小板計(jì)數(shù)對(duì)臨床決策很重要，這也是一名檢驗(yàn)技師應(yīng)該熟練掌握的技能。

本次研究選取了53例門診EDTA-PTCP患者作為實(shí)驗(yàn)組和25例無(wú)血小板聚集的健康體檢者作為對(duì)照組，本次實(shí)驗(yàn)標(biāo)本選取靜脈血，是為了避免靜脈血和末梢血間血小板計(jì)數(shù)的誤差[10]。結(jié)果表明：對(duì)照組PLT-I、PLT-O與PLT-M均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），表明手工法與儀器法具有一致性；實(shí)驗(yàn)組PLT-I與PLT-M有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），PLT-O與PLT-M無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.317），表明儀器檢測(cè)EDTA-PTCP標(biāo)本，PLT-I結(jié)果不準(zhǔn)確，PLT-O結(jié)果具有較好的準(zhǔn)確性，糾正計(jì)數(shù)性能顯著。這是由于BC6800的PLT-O法對(duì)血小板具有解聚作用。BC 6800血液分析儀網(wǎng)織紅細(xì)胞通道（RET通道）的PLT-O法對(duì)血小板的解聚主要是由四方面原因組成。首先保證最合適的解聚溫度，試劑預(yù)熱池和反應(yīng)池的溫度分別為45.47℃和42℃。儀器吸取血樣后，立即與已經(jīng)預(yù)熱的熒光試劑一起高速注入42℃的恒溫反應(yīng)池中，形成旋流，使熒光試劑與血樣充分作用。同時(shí)，攪拌桿以1400 r/min的速度對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行高速攪拌，對(duì)血小板聚集的物理結(jié)構(gòu)進(jìn)行機(jī)械破壞。反應(yīng)池通過(guò)渦旋混勻以及高速打散裝置實(shí)現(xiàn)均勻分散血小板。另外試劑中的專屬“解聚成分”對(duì)血小板聚集的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)破壞，并與單個(gè)血小板結(jié)合，使血小板依次通過(guò)激光檢測(cè)通道，從而達(dá)到對(duì)血小板聚集結(jié)果的糾正。攪拌與加溫都只是輔助的作用，這兩者不會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞。最后RET通道的PLT-O法采用核酸熒光染色，增強(qiáng)了對(duì)血小板形態(tài)的鑒別能力，可以有效地鑒別紅細(xì)胞碎片，使得PLT檢測(cè)結(jié)果不受紅細(xì)胞碎片等物質(zhì)的干擾[11]。

為了確定不同聚集程度的標(biāo)本PLT-O檢測(cè)值是否都能直接用于檢驗(yàn)報(bào)告的發(fā)放，將隨機(jī)計(jì)數(shù)30個(gè)血小板聚集團(tuán)的顆粒數(shù)進(jìn)行了分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PLT＜6顆、PLT 6顆～10顆、PLT 11顆～15顆、PLT16顆～20顆這四組的糾正計(jì)數(shù)合格率比較理想，均≥80%；而PLT＞20顆的糾正計(jì)數(shù)合格率較差，只有22.2%，臨床實(shí)驗(yàn)室不能接受。針對(duì)PLT≤20顆糾正計(jì)數(shù)失敗的標(biāo)本，油鏡下仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)：與糾正計(jì)數(shù)合格的標(biāo)本涂片相比，血小板與血小板之間黏附聚集更致密，呈塊狀，各血小板之間的界限模糊或消失。另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明隨時(shí)間的推移，儀器解離糾正合格的標(biāo)本數(shù)呈下降趨勢(shì)。這是由于EDTA依賴性假性血小板減少會(huì)隨時(shí)間的推移存在越來(lái)越嚴(yán)重的現(xiàn)象[12]。但只要標(biāo)本解離時(shí)血小板聚集平均顆粒數(shù)小于20顆時(shí)，儀器仍具有良好的糾正性能。目前，EDTAPTCP發(fā)生的機(jī)制仍未能全面闡釋。廖遠(yuǎn)泉等[13]總結(jié)了已發(fā)現(xiàn)的EDTA-PTCP發(fā)生機(jī)制，主要有EDTA的螯合機(jī)制（抗原抗體反應(yīng)）、EDTA誘導(dǎo)血小板活化機(jī)制、“血小板的衛(wèi)星現(xiàn)象”、溫度相關(guān)性依賴現(xiàn)象-冷凝集、藥物因素等，它的發(fā)生并不是某單一機(jī)制或因素影響所導(dǎo)致的現(xiàn)象，應(yīng)是多種因素共同作用的結(jié)果。是否由于不同機(jī)制引發(fā)的EDTA-PTCP的聚集形式和程度的不同，從而導(dǎo)致部分標(biāo)本無(wú)法解聚，有待進(jìn)一步的研究。BAO等[14]引入“解聚率”概念來(lái)定義解聚效果，解聚率=血小板聚集標(biāo)本PLT-O值/PLT真實(shí)值×100%，他認(rèn)為EDTA-PTCP的解聚效果是由物理和化學(xué)因素的組合導(dǎo)致的解離效應(yīng)。另外一些聚集嚴(yán)重的標(biāo)本，血小板之間黏連非常嚴(yán)重，在此儀器的反應(yīng)體系快速檢測(cè)過(guò)程中無(wú)法打散所有聚集的血小板，許穎等[15]也進(jìn)行了相應(yīng)的報(bào)道。以上結(jié)果表明在PLT≤20顆且聚集較疏松的情況下，BC6800血液分析儀PLT-O計(jì)數(shù)可以直接用于檢測(cè)結(jié)果值的發(fā)放；但當(dāng)血小板聚集顆粒數(shù)較多（＞20顆）或聚集較致密時(shí)， BC6800血液分析儀PLT-O通道并不能完全打散血小板聚集團(tuán)，對(duì)血小板的糾正計(jì)數(shù)超過(guò)儀器檢測(cè)血小板的允許誤差，需采用其他糾正方法對(duì)血小板計(jì)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

綜上，檢驗(yàn)工作中遇到EDTA依賴性假性血小板減少的標(biāo)本可以使用BC6800血液分析儀光學(xué)法對(duì)血小板計(jì)數(shù)的進(jìn)行糾正，但要結(jié)合血涂片鏡下血小板聚集的大致顆粒數(shù)及血小板之間黏附的致密程度來(lái)確定糾正計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突