黃敏 李燕 張立波 傅強(qiáng)

中國(guó)是HBV流行高發(fā)地區(qū)，近年我國(guó)人群HBV流行率的調(diào)查顯示約為6.89%，東部地區(qū)為6.16%[1-2]。國(guó)內(nèi)血站1975年起就將HBV篩查作為必檢內(nèi)容。2015年至今血站HBV的篩查除了使用血清學(xué)方法—酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assays，ELISA）和化學(xué)發(fā)光免疫分析試驗(yàn)（chemiluminescent microparticle immunoassay，CLIA）以外，還在全國(guó)范圍內(nèi)全面使用核酸檢測(cè)方法（nucleic acid testing，NAT）—包括單人份核酸檢測(cè)（individual donation nucleic acid testing，ID-NAT）和混樣核酸檢測(cè)（mini-pool nucleic acid testing，MP-NAT）。雖然目前這些檢測(cè)手段已將輸血傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)降低，但檢測(cè)后仍然存在殘余風(fēng)險(xiǎn)。而血篩殘余風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估，無(wú)論對(duì)衛(wèi)生行政部門輸血安全管理的決策、臨床醫(yī)生根據(jù)利弊平衡原則掌握是否給患者輸血，以及擬接受輸血的患者對(duì)輸血風(fēng)險(xiǎn)的知情同意，都是重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。世界范圍內(nèi)關(guān)于獻(xiàn)血人群HBV傳播殘余風(fēng)險(xiǎn)度評(píng)估研究工作一直沒(méi)有停止過(guò)，我國(guó)在這一領(lǐng)域相對(duì)滯后。造成HBV輸血傳播殘余風(fēng)險(xiǎn)的原因有多種，主要有：①人群中HBV流行率；②采供血機(jī)構(gòu)的檢測(cè)原因，包括試劑靈敏度、不同種試劑組合的篩查模式、篩查策略、實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理等等；③醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床用血的管理；④用血患者本身的免疫特點(diǎn)。目前世界范圍內(nèi)對(duì)于HBV輸血傳播殘余風(fēng)險(xiǎn)的研究以①②為主，多數(shù)計(jì)算殘余風(fēng)險(xiǎn)度的數(shù)學(xué)模型即以此為基礎(chǔ)，采用血篩陽(yáng)性率和窗口期等參數(shù)來(lái)估算殘余風(fēng)險(xiǎn)。本文僅就原因②中的篩查模式進(jìn)行了初步探討。對(duì)此，本文選取2021年3月1日～2021年8月31日南京地區(qū)的獻(xiàn)血人群作為研究對(duì)象，對(duì)該人群HBV血篩殘余風(fēng)險(xiǎn)度的影響因素進(jìn)行了初步評(píng)估研究。

材料與方法

1 研究對(duì)象與篩查模式 本文選取2021年3月1日～2021年8月31日南京地區(qū)的獻(xiàn)血人群作為研究對(duì)象，共篩查52367人次，日常血液篩查策略為“2遍HBsAg血清學(xué)篩查+1遍HBV DNA核酸篩查”（文中簡(jiǎn)稱“2+1”），文中將其中包含的“任1遍HBsAg血清學(xué)篩查+1遍HBV DNA核酸篩查”看作“1+1”篩查策略（文中簡(jiǎn)稱“1+1”）?！?+1”策略中的2遍HBsAg血清學(xué)篩查分別采用2種HBsAg ELISA血清學(xué)篩查試劑（文中簡(jiǎn)稱E1和E2），1遍HBV DNA核酸篩查采用2種不同的HBV DNA核酸篩查方法（ID-NAT/MP-NAT）中的1種，其中ID-NAT共篩查26812人次，MP-NAT共篩查25555人次。這4種血液篩查試劑形成的不同組合模式文中簡(jiǎn)稱篩查模式。E1和E2為2種國(guó)產(chǎn)HBsAg ELISA血篩試劑，ID-NAT試劑為進(jìn)口Procleix Ultrio Elite Assay聯(lián)檢和鑒別試劑，采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)（transcription mediated amplification，TMA）原理；MP-NAT試劑為國(guó)產(chǎn)6混樣NAT試劑，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)。以上試劑均經(jīng)過(guò)國(guó)家批批檢，參與室間質(zhì)評(píng)100%通過(guò)。

2 篩查結(jié)果判定規(guī)則

2.1 HBsAg血清學(xué)陰性結(jié)果的判定規(guī)則：HBsAg ELISA初篩為非反應(yīng)性，或HBsAg ELISA初篩反應(yīng)性后再進(jìn)行雙孔復(fù)試、雙孔均為陰性，以上兩種情況最終均判為ELISA試劑HBsAg陰性。

2.2 HBV DNA陽(yáng)性判定規(guī)則：ID-NAT試劑初篩反應(yīng)性后進(jìn)行鑒別實(shí)驗(yàn)，鑒別結(jié)果呈HBV DNA反應(yīng)性即判為HBV DNA ID-NAT試劑最終陽(yáng)性；MP-NAT試劑混樣檢測(cè)反應(yīng)性后再進(jìn)行拆分實(shí)驗(yàn)，拆分結(jié)果呈HBV DNA反應(yīng)性即判為HBV DNA MP-NAT試劑最終陽(yáng)性。

2.3 HBsAg陰性同時(shí)HBV DNA陽(yáng)性判定規(guī)則：HBsAg血清學(xué)篩查試劑結(jié)果均為陰性、同時(shí)1種核酸篩查試劑結(jié)果為HBV DNA陽(yáng)性，則該份樣本最終判為HBsAg陰性同時(shí)HBV DNA陽(yáng)性。

3 殘余風(fēng)險(xiǎn)度評(píng)估方法 本研究采用已有成熟的NAT單陽(yáng)性率-窗口期比率（NAT yield/WP ratio model）數(shù)學(xué)模型[3-4]做HBV輸血傳播殘余風(fēng)險(xiǎn)度的回顧性評(píng)估。模型計(jì)算公式：RR = WPNAT/（WPHBsAg–WPNAT）×（NWPNATyields/Ndonations）。其中參數(shù)RR是殘余風(fēng)險(xiǎn)度（residual risk，RR），單位：/1000 000人年（person-year，py），由于多數(shù)文獻(xiàn)采用/106py作為RR的單位，為了便于可比，本文也采用/106py，這與NWPNATyields/Ndonations的單位不同，因此文中RR的計(jì)算需要對(duì)人年進(jìn)行換算，2021年3月1日～2021年8月31日共184天，換算為0.5人年（文中計(jì)算采用原始多位小數(shù)結(jié)果），最終在WPNAT/（WPHBsAg–WPNAT）×（NWPNATyields/Ndonations）的基礎(chǔ)上乘以0.5再乘以10，文中（NWPNATyields/Ndonations）數(shù)據(jù)已乘以人年數(shù)；WP是窗口期（window period，WP），是指從獻(xiàn)血者感染病毒且具有傳播能力開始，到實(shí)驗(yàn)室能夠檢出的時(shí)間（year）。本研究窗口期參數(shù)均來(lái)自文獻(xiàn)，WPNAT是HBV DNA核酸篩查方法的窗口期時(shí)間，其中混樣核酸篩查方法采用24.5天（8混樣核酸檢測(cè)數(shù)據(jù)）[5]，單人份核酸篩查方法采用18.5天[6-7]； WPHBsAg是HBsAg的血清學(xué)篩查方法的窗口期時(shí)間，ELISA方法采用59天[8-10]。WPNAT/（WPHBsAg–WPNAT）為窗口期比率。計(jì)算不同篩查策略和篩查模式的殘余風(fēng)險(xiǎn)度時(shí)，按照高估風(fēng)險(xiǎn)的原則，根據(jù)策略或模式中所包含的試劑方法來(lái)選擇最長(zhǎng)窗口期，具體計(jì)算方法：“ELISA+ ID-NAT” 的窗口期比率為18.5/（59-18.5）=0.46，“ELISA+ MP-NAT”的窗口期比率為24.5/（59-24.5）=0.71。NWPNATyields是HBsAg陰性同時(shí)核酸陽(yáng)性的獻(xiàn)血者人次數(shù)（文中簡(jiǎn)稱NAT單陽(yáng)性數(shù)）；Ndonations是核酸篩查總獻(xiàn)血者人次數(shù)，文中稱篩查總數(shù)；（NWPNATyields/Ndonations）是HBsAg陰性同時(shí)核酸陽(yáng)性的人次數(shù)占獻(xiàn)血者核酸篩查總?cè)舜螖?shù)的比率，文中簡(jiǎn)稱NAT單陽(yáng)性率。單位：/100000人年。該參數(shù)采用2.3的結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。RR的影響因素采用卡方檢驗(yàn)法分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

2021年3月1日～2021年8月31日，共篩查南京地區(qū)獻(xiàn)血者52367人次，不同篩查策略和篩查模式對(duì)其HBV血篩殘余風(fēng)險(xiǎn)度的影響均未見顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1 不同篩查策略和篩查模式對(duì)南京地區(qū)獻(xiàn)血者HBV血篩殘余風(fēng)險(xiǎn)度的影響（n=52367）

討論

本研究選用了NAT單陽(yáng)性率-窗口期比率模型，該模型兼具優(yōu)勢(shì)與局限性。目前國(guó)際國(guó)內(nèi)常用的HBV輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)數(shù)學(xué)模型有①經(jīng)典的I-WP模型，包括Muller-Breitkreutz model和Modified Incidence/WP model[11-12]，②NAT yield/WP ratio model[3-4]， ③以HBsAg檢出率法為基礎(chǔ)的新感染率-窗口期模型[13]， ④流行率-窗口期模型[14]， ⑤Seed模型（建立在流行率-窗口期模型基礎(chǔ)上）[15]等等。我國(guó)對(duì)于該領(lǐng)域研究起步較晚，①③④模型都有相關(guān)研究報(bào)道[16-18]，但考慮到部分研究方法的爭(zhēng)議[19-20]，本文經(jīng)過(guò)取舍，選取了②NAT yield/WP ratio model。該模型適合評(píng)估HBV高流行地區(qū)，具有簡(jiǎn)便易算的優(yōu)點(diǎn)，只需要輸入所有獻(xiàn)血者的NAT單陽(yáng)性率（即NAT陽(yáng)性同時(shí)HBsAg陰性）和窗口期參數(shù)即可，并不需要區(qū)分初次獻(xiàn)血者和重復(fù)獻(xiàn)血者。但由于該模型的含義是指血篩殘余風(fēng)險(xiǎn)完全來(lái)自于NAT窗口期，具有局限性，主要表現(xiàn)在以下幾方面：第一，窗口期的精確估計(jì)非常困難，在病毒感染早期，病毒顆粒會(huì)局限在接種點(diǎn)或?qū)嵸|(zhì)靶器官，不會(huì)立即進(jìn)入血液，不會(huì)立即達(dá)到足夠的載量進(jìn)行有感染性的傳播，因此有許多科研團(tuán)隊(duì)對(duì)窗口期的確定進(jìn)行反復(fù)精確的試驗(yàn)，通過(guò)計(jì)算病毒倍增時(shí)間來(lái)推算具有感染性的窗口期時(shí)間，并相應(yīng)調(diào)整其他時(shí)間參數(shù)[21]；第二，該模型與眾多數(shù)學(xué)模型一樣，缺少考慮臨床受血者感染的風(fēng)險(xiǎn)[15]；第三，該模型要求NAT單陽(yáng)性率足夠高，否則會(huì)影響模型計(jì)算的準(zhǔn)確性[11]；第四，NAT單陽(yáng)性結(jié)果必須可靠，最好是真正意義上的“窗口期”，因此所有NAT單陽(yáng)性結(jié)果需要經(jīng)過(guò)確認(rèn)和分類。實(shí)際上，目前我國(guó)大陸血站沒(méi)有強(qiáng)制對(duì)NAT結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)和分類，NAT單陽(yáng)性不能排除假陽(yáng)性的存在，且大部分這種樣本的病毒濃度很低，很難對(duì)獻(xiàn)血者的血液狀態(tài)進(jìn)行追蹤，另外本中心NAT單陽(yáng)性結(jié)果中必然含有相當(dāng)數(shù)量的OBI（隱匿性乙肝病毒感染）結(jié)果，這一比例在南非為4%，而在亞洲和歐美國(guó)家達(dá)到了12%[11]和19.4%左右[5]，我國(guó)部分高流行地區(qū)為2.92%[22]，有報(bào)道稱急性隱匿性或乙肝疫苗抗-HBs突破/流產(chǎn)感染，均為短暫的低水平HBsAg血癥（前者抗-HBs陰性，后者抗-HBs陽(yáng)性），即NAT單陽(yáng)性結(jié)果，這種情況導(dǎo)致的殘余風(fēng)險(xiǎn)也被考慮到NAT單陽(yáng)性窗口期比率模型中；同時(shí)對(duì)于受血者來(lái)說(shuō)，相當(dāng)一部分免疫接種人群對(duì)于低病毒載量的血液不易感，NAT單陽(yáng)性結(jié)果的存在并不意味著能通過(guò)輸血傳播HBV。綜上所述，以上種種因素導(dǎo)致NAT單陽(yáng)性窗口期比率模型計(jì)算出的殘余風(fēng)險(xiǎn)度往往會(huì)高于其他涉及HBsAg陽(yáng)性數(shù)的模型[11]，有高估殘余風(fēng)險(xiǎn)的可能。同時(shí)有研究表明，OBI獻(xiàn)血者標(biāo)本由于多數(shù)濃度偏低，其中僅有12.8%能被MP-NAT（16混）檢測(cè)到[4]，由此得到的MP-NAT單陽(yáng)性率與ID-NAT相比必然偏低，但同時(shí)窗口期前者偏長(zhǎng)，該模型最終計(jì)算得到的殘余風(fēng)險(xiǎn)度有可能相差不大甚至前者更?。ㄒ姳疚慕Y(jié)果）。因此有文章將數(shù)學(xué)模型做分類加權(quán)[8]，每種類別的檢出概率不同，風(fēng)險(xiǎn)也不同，這樣調(diào)整后的風(fēng)險(xiǎn)度更加可靠，但由于人們對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度估算傾向于偏高，因此WHO相關(guān)指南[8]也建議如果調(diào)整后風(fēng)險(xiǎn)減小則沒(méi)有調(diào)整的必要，而本文涉及的模型本身就具有高估風(fēng)險(xiǎn)的特點(diǎn)，而且數(shù)據(jù)有限，因此本文沒(méi)有考慮采納。

NICO LELIE等發(fā)現(xiàn)該模型計(jì)算得出的東南亞地區(qū)殘余風(fēng)險(xiǎn)度（ID-NAT）為1∶3115～1∶5780，南非為1∶2188～1∶4049[11]。從本文結(jié)果可以看出，不論采用哪種模式，本中心血篩殘余風(fēng)險(xiǎn)度在1∶6085～1∶7933之間，位于可接受范圍內(nèi)，甚至低于東南亞總體RR水平。與世界范圍的其他國(guó)家相比，本中心HBV血篩殘余風(fēng)險(xiǎn)度高于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家 （1∶ 115000～1∶8000 000），同時(shí)也高于曾經(jīng)被WHO認(rèn)為是HBV中高程度的流行地區(qū)，如巴西（1∶29411）、韓國(guó)（1∶39956）等地區(qū)[5，23]。但與我國(guó)大陸地區(qū)未開展NAT血篩之前的報(bào)道（1∶1769）[17]相比，目前的殘余風(fēng)險(xiǎn)度總體明顯有所下降。一方面這可能與近幾年NAT的廣泛開展有關(guān)，我國(guó)從2015年開始NAT血篩全面覆蓋，相關(guān)文獻(xiàn)顯示，不論是MPNAT還是ID-NAT[23-24]，與傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)手段相比，NAT能夠明顯降低血篩的殘余風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，本文首次使用了新的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，該模型與過(guò)去的傳統(tǒng)模型相比，對(duì)于殘余風(fēng)險(xiǎn)度的評(píng)估更加嚴(yán)格和保守，得出的結(jié)論往往比實(shí)際偏高。真實(shí)的結(jié)論還需要對(duì)模型參數(shù)的來(lái)源進(jìn)行更多探討和研究。然而不論如何，在與國(guó)際范圍內(nèi)的其他地區(qū)橫向比對(duì)后，我國(guó)的血篩殘余風(fēng)險(xiǎn)度水平仍然不容樂(lè)觀，在獻(xiàn)血者招募和宣傳教育、血篩技術(shù)和策略、血篩試劑改進(jìn)、臨床用血等方面，我們還有很多工作可以做。

不同的篩查策略會(huì)導(dǎo)致不同的殘余風(fēng)險(xiǎn)度水平?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程（2015版）》對(duì)血站的檢測(cè)策略（簡(jiǎn)稱新策略）進(jìn)行了更新：實(shí)施核酸檢測(cè)試劑批簽發(fā)之后，HIV、HBV和HCV感染標(biāo)志物應(yīng)采用核酸和血清學(xué)檢測(cè)2種方法各進(jìn)行1次檢測(cè)[25]，也就是通常所說(shuō)的“1種血清學(xué)檢測(cè)+1種NAT”的篩查策略。新版《血站技術(shù)操作規(guī)程（2019版）》檢測(cè)策略中提到：HIV、HBV和HCV感染標(biāo)志物應(yīng)至少采用核酸和血清學(xué)試劑各進(jìn)行 1 次檢測(cè)。新版中增加了“至少”二字，也是由于國(guó)內(nèi)多數(shù)研究認(rèn)為“2+1”比“1+1”的篩查策略更加安全[18]。但從本文結(jié)果中可以看出，2種篩查策略并沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。值得關(guān)注的是，未發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示有5例E2和NAT結(jié)果均呈陽(yáng)性的樣本E1呈陰性，可能與E1試劑的靈敏度及其對(duì)某些變異型病毒的檢出能力有關(guān)。如果按照“1+1”策略進(jìn)行血篩，E1與NAT的組合模式完全依賴于NAT的靈敏度和可檢靶基因的覆蓋程度，可能造成這5例陽(yáng)性樣本的漏檢。盡管從總體統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來(lái)看2種篩查策略沒(méi)有顯著差異，但接近1/10000（5/52367）的漏檢率從受血者角度來(lái)看，一旦發(fā)生就是悲劇。因此單從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度并不能絕對(duì)認(rèn)為2種策略同樣安全，這一點(diǎn)從以往的文獻(xiàn)中也多次得到印證。

不同的篩查模式對(duì)血篩殘余風(fēng)險(xiǎn)度的影響主要取決于試劑靈敏度和對(duì)某些變異型、亞型病毒的檢出能力等。從結(jié)果中可知，含有E1的篩查模式要比含有E2的篩查模式殘余風(fēng)險(xiǎn)度高，同時(shí)E1確實(shí)有5例陽(yáng)性樣本未檢出，這可以給“1+1”策略中保留哪1種ELISA試劑提供參考。有意思的是，結(jié)果顯示含有ID-NAT的篩查模式要比含有MP-NAT的篩查模式具有更高的殘余風(fēng)險(xiǎn)度，這在前面分析中提到，可能與ID-NAT靈敏度高，導(dǎo)致NAT單陽(yáng)性率高有關(guān)，IDNAT采用單人份檢測(cè)，且初篩反應(yīng)性即判為陽(yáng)性（不用等鑒別結(jié)果即報(bào)廢），而MP-NAT采用6人份混樣檢測(cè)，且混樣加拆分均為反應(yīng)性才判為陽(yáng)性，勢(shì)必造成前者NAT單陽(yáng)性率高于后者。盡管窗口期參數(shù)前者短于后者，但最終結(jié)果往往不能確定哪個(gè)更高。如果本文樣本量增大，并增加確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，排除假陽(yáng)性可能，或許將得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。這也是本研究的不足之處，將在今后的工作中繼續(xù)完善。同時(shí)這也體現(xiàn)了數(shù)學(xué)模型的局限性，參數(shù)的準(zhǔn)確性非常重要，但實(shí)際很難得到，世界上目前也沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這需要科研人員尤其是國(guó)內(nèi)的科研人員做出更多的努力。隨著研究工作的逐步完善，數(shù)學(xué)模型的準(zhǔn)確性也將會(huì)有更多的提升。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突