梁紅雁 陳德勇③ 王軍波③ 陳 健*③

①(中國(guó)科學(xué)院空天信息創(chuàng)新研究院傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100190)

②(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)電子電氣與通信工程學(xué)院 北京 100049)

③(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院 北京 100049)

1 引言

單細(xì)胞生物物理學(xué)特征主要包括結(jié)構(gòu)特征(如細(xì)胞直徑和細(xì)胞核直徑)和電學(xué)特征(細(xì)胞膜比電容和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率)。其中，細(xì)胞與細(xì)胞核直徑反映細(xì)胞形態(tài)特征，細(xì)胞膜由磷脂雙分子層和膜蛋白組成，通常等效為電容模型，細(xì)胞質(zhì)由基質(zhì)、骨架和內(nèi)容物組成，通常等效為電阻模型，其數(shù)值的變化與其組成結(jié)構(gòu)、數(shù)量的改變有關(guān)。目前，已有研究表明，單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征變化與血液細(xì)胞生理病理機(jī)制[1–8]、腫瘤細(xì)胞惡性程度[9–16]以及干細(xì)胞分化階段[17–23]密切相關(guān)。

單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征檢測(cè)存在細(xì)胞體積微小難以操縱、缺乏有效模型支撐等難度。面對(duì)這些難度，發(fā)展的單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征常規(guī)檢測(cè)方法主要分為兩類(lèi)：固定式和流動(dòng)式。固定式檢測(cè)方法包括膜片鉗、電旋轉(zhuǎn)和介電電泳等，可檢測(cè)數(shù)十、百個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜比電容、細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率和細(xì)胞直徑等固有參數(shù)，但存在細(xì)胞操縱復(fù)雜、檢測(cè)通量低等問(wèn)題，無(wú)法獲取具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的大量單細(xì)胞數(shù)據(jù)。而流動(dòng)式檢測(cè)方法包括電阻抗、光散射和光成像等，可獲取細(xì)胞及細(xì)胞核直徑等參數(shù)，但無(wú)法同時(shí)收集細(xì)胞電學(xué)特征等參數(shù)，使其應(yīng)用受限。

近年來(lái)，隨著MEMS(Micro-ElectroMechanical Systems)迅速地發(fā)展，微流控技術(shù)，即在微通道中對(duì)微尺度流體的控制技術(shù)[24]，由于特征尺寸(～μm)與細(xì)胞尺寸相匹配，已經(jīng)成為表征單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征的一種有效工具[25]?；谠摷夹g(shù)的方法較為明顯地提高了檢測(cè)通量，可檢測(cè)成千上萬(wàn)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和電學(xué)參數(shù)，但仍存在檢測(cè)參數(shù)少等問(wèn)題，限制了細(xì)胞的綜合評(píng)估。

在此背景下，本文綜述了以上不同單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征檢測(cè)方法，主要分為固定式、流動(dòng)式及基于微流控的方法。針對(duì)這些方法的原理、發(fā)展和主要優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了闡述分析和對(duì)比總結(jié)，同時(shí)探討了單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征檢測(cè)所面臨的問(wèn)題，以及發(fā)展研究的方向。

2 固定式檢測(cè)方法

常規(guī)的單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征的固定式檢測(cè)方法主要是基于頻率掃描的原理，將細(xì)胞固定在待測(cè)區(qū)域，通過(guò)施加電信號(hào)，記錄細(xì)胞的頻率響應(yīng)，再基于相應(yīng)的等效模型轉(zhuǎn)換為細(xì)胞的固有電學(xué)特征，如細(xì)胞膜比電容和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率等，同時(shí)，可利用成像獲取細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征。這類(lèi)方法主要包括膜片鉗、電旋轉(zhuǎn)和介電電泳等。

2.1 膜片鉗

膜片鉗檢測(cè)單細(xì)胞電學(xué)特征的工作原理如圖1(a)所示[26，27]。該方法是將細(xì)胞膜的一部分吸入微移液管尖端以形成高電阻密封，通過(guò)將微移液管尖端電極施加的電流解釋為頻率的函數(shù)，即可獲得等效的細(xì)胞膜電容。

作為這一領(lǐng)域的先驅(qū)者，Neher等人[28–30]使用全細(xì)胞膜片鉗研究單細(xì)胞電學(xué)特征，評(píng)估了細(xì)胞處于靜息狀態(tài)下的等效膜電容約為幾皮法(pF)，而細(xì)胞進(jìn)入胞吐過(guò)程(將細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)出的過(guò)程)中，等效膜電容以0.01 pF逐步變化。后續(xù)膜片鉗進(jìn)一步發(fā)展，主要表現(xiàn)在以下4個(gè)方面：(1)雙頻激勵(lì)信號(hào)的應(yīng)用[31，32]；(2)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的集成[33，34]；(3)測(cè)量噪聲的詳細(xì)分析[35，36]；(4)系統(tǒng)的自動(dòng)化[37，38]。

作為一項(xiàng)成熟的技術(shù)，膜片鉗已經(jīng)成為表征單細(xì)胞電學(xué)特征的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法雖然可以精確評(píng)估細(xì)胞膜電容，但由于高度依賴(lài)微移液管的精準(zhǔn)操作以及與目標(biāo)細(xì)胞形成高阻封接，造成了檢測(cè)通量過(guò)低的問(wèn)題，僅獲取來(lái)自十幾或幾十個(gè)細(xì)胞的電學(xué)特征數(shù)據(jù)。因此膜片鉗無(wú)法從大量細(xì)胞中獲取數(shù)據(jù)，從而使其在細(xì)胞分類(lèi)分型等應(yīng)用上受限。

2.2 電旋轉(zhuǎn)

電旋轉(zhuǎn)檢測(cè)單細(xì)胞電學(xué)特征的工作原理如圖1(b)所示[39，40]。在電旋轉(zhuǎn)中，基于麥克斯韋-瓦格納(Maxwell-Wagne)極化原理，施加的旋轉(zhuǎn)電場(chǎng)使懸浮的單細(xì)胞旋轉(zhuǎn)，通過(guò)測(cè)量旋轉(zhuǎn)速率對(duì)施加頻率的響應(yīng)來(lái)量化單細(xì)胞的細(xì)胞膜介電常數(shù)和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率。

作為該領(lǐng)域的先驅(qū)，Zimmermann等人[41，42]利用電旋轉(zhuǎn)研究單細(xì)胞電學(xué)特征，表征了紫菜葉肉單細(xì)胞、不同酸堿條件下的類(lèi)囊體囊泡單細(xì)胞的膜比電容分別為～0.48， 0.93(pH=8.1)和0.77 μF/cm2(pH=4.4)。后續(xù)電旋轉(zhuǎn)在表征單細(xì)胞膜電容方面的進(jìn)一步發(fā)展，主要體現(xiàn)在以下3個(gè)方面：(1)高頻電場(chǎng)中的模型擴(kuò)展[43，44]；(2)計(jì)算機(jī)輔助數(shù)據(jù)處理[45–46]；(3)自動(dòng)化操作[47–50]。

作為一項(xiàng)成熟的技術(shù)，電旋轉(zhuǎn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞電學(xué)特征檢測(cè)領(lǐng)域。該方法報(bào)道的電學(xué)特征參數(shù)差異證明了與腫瘤發(fā)展[9，51，52]和血液疾病相關(guān)[53，54]，然而仍存在高度依賴(lài)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的精確操作，導(dǎo)致檢測(cè)通量有限的問(wèn)題。盡管后續(xù)致力于提高細(xì)胞操作速度[47–50]，但仍只能獲取數(shù)百個(gè)單細(xì)胞的電學(xué)特征數(shù)據(jù)，不能得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單細(xì)胞電學(xué)特征差異。

2.3 介電電泳

介電電泳檢測(cè)單細(xì)胞電學(xué)特征的工作原理如圖1(c)所示[40]。在介電電泳中，施加電信號(hào)的電極使細(xì)胞附著其上，獲取細(xì)胞數(shù)量關(guān)于頻率的函數(shù)，然后通過(guò)克勞修斯-莫索提因子(Clausius-Mossotti Factor， CMF)頻譜曲線(xiàn)擬合將其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞膜比電容。

圖1 固定式檢測(cè)方法

作為該領(lǐng)域的先驅(qū)，Labeed等人[55]利用介電電泳表征細(xì)胞電學(xué)特征，報(bào)道了人類(lèi)髓性白血病細(xì)胞(K562)及其耐藥性細(xì)胞的膜比電容和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率分別為0.82 μF/cm2和0.23 S/m(K562)、0.76 μF/cm2和0.50 S/m(耐藥性K562)；此外表征了人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)及其不同耐藥基因表達(dá)細(xì)胞(MCF-7 TaxR， MCF-7 DoxR和MCF-7 MDRl)的細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率分別為0.23，0.14，0.40和0.27 S/m。

介電電泳作為一種基于細(xì)胞群體檢測(cè)的方法，相對(duì)于膜片鉗和電旋轉(zhuǎn)來(lái)說(shuō)，操作簡(jiǎn)便，但在檢測(cè)過(guò)程中鄰近細(xì)胞之間相互作用的潛在問(wèn)題無(wú)法得到適當(dāng)?shù)慕鉀Q，同時(shí)采集的頻譜是基于群體細(xì)胞層面，所以轉(zhuǎn)化的特征是細(xì)胞群體的平均性能，而不是單個(gè)細(xì)胞的電學(xué)特征。

綜上所述，檢測(cè)單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征的固定式方法均可獲取細(xì)胞固有的電學(xué)特征參數(shù)，但存在無(wú)法表征單細(xì)胞層面性能(如介電電泳)或者檢測(cè)通量低(如膜片鉗和電旋轉(zhuǎn))等問(wèn)題，難以采集具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的大量單細(xì)胞數(shù)據(jù)用于細(xì)胞評(píng)估。

3 流動(dòng)式檢測(cè)方法

針對(duì)固定式單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征檢測(cè)方法通量低的主要問(wèn)題，發(fā)展了常規(guī)的流動(dòng)式方法，驅(qū)動(dòng)單個(gè)細(xì)胞依次流動(dòng)通過(guò)檢測(cè)區(qū)域，引起電信號(hào)或者光信號(hào)的產(chǎn)生或變化，以此為依據(jù)，轉(zhuǎn)換為細(xì)胞的電參量或結(jié)構(gòu)特征參數(shù)。這類(lèi)方法主要包括電阻抗、光散射和光成像等，目前據(jù)此形成的兩大類(lèi)重要儀器，流式細(xì)胞儀和血細(xì)胞分析儀，已經(jīng)被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，作為大部分細(xì)胞的分類(lèi)和狀態(tài)評(píng)估，具有廣闊的市場(chǎng)價(jià)值和應(yīng)用前景。

3.1 電阻抗

電阻抗檢測(cè)單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征的工作原理如圖2(a)所示[56]。基于庫(kù)爾特原理，懸浮在電解液的細(xì)胞通過(guò)小孔時(shí)取代相同體積的電解液，導(dǎo)致小孔兩側(cè)電極間電阻發(fā)生瞬時(shí)變化，產(chǎn)生電位脈沖，通過(guò)脈沖信號(hào)的大小和次數(shù)反映細(xì)胞大小和數(shù)目。

作為該領(lǐng)域的先驅(qū)，文獻(xiàn)[57，58]利用電阻抗研究單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征，測(cè)量了單細(xì)胞通過(guò)小孔的直流電脈沖，轉(zhuǎn)換為細(xì)胞體積，用于白細(xì)胞3分群(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞)；隨后，在直流的基礎(chǔ)上加入交流成分，額外表征了單細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)部分的電學(xué)特征，初步應(yīng)用于白細(xì)胞5分類(lèi)(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)[59，60]。

作為細(xì)胞計(jì)數(shù)金標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，基于庫(kù)爾特原理的電阻抗提供了一種對(duì)細(xì)胞直徑(體積)及細(xì)胞粒度進(jìn)行測(cè)量的方法。相對(duì)傳統(tǒng)顯微鏡細(xì)胞觀(guān)察分析，電阻抗能夠快速、準(zhǔn)確地獲取細(xì)胞大小和數(shù)量，但仍無(wú)法獲取細(xì)胞核直徑等結(jié)構(gòu)特征參數(shù)以及細(xì)胞膜比電容和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率等固有電學(xué)特征參數(shù)，導(dǎo)致其在單細(xì)胞分析領(lǐng)域功能受限。

3.2 光散射

光散射檢測(cè)單細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征的工作原理如圖2(b)所示[56]。在光散射中，穿行的單細(xì)胞被激光照射，并與部分光子發(fā)生碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射。通過(guò)記錄激光中斷次數(shù)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)根據(jù)散射的數(shù)量和角度表征細(xì)胞大小、細(xì)胞核特征等對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)。

圖2 流動(dòng)式檢測(cè)方法

作為該領(lǐng)域的先驅(qū)，Grooth等人[56，61，62]利用光散射研究單細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，用于區(qū)分淋巴細(xì)胞亞群以及從正常淋巴細(xì)胞中區(qū)分出毒性細(xì)胞，同時(shí)用于對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行3分群、5分類(lèi)。后續(xù)光散射發(fā)展主要體現(xiàn)在兩方面：(1)多角度散射光分離技術(shù)[63，64]；(2)形態(tài)計(jì)量模型解釋散射模式[65，66]。

作為白細(xì)胞分類(lèi)的一種有效手段，光散射可以收集到細(xì)胞大小、細(xì)胞顆粒度以及細(xì)胞質(zhì)復(fù)雜性相關(guān)的信息，但仍無(wú)法準(zhǔn)確獲取細(xì)胞核直徑等結(jié)構(gòu)特征，也無(wú)法收集單細(xì)胞電學(xué)特征信息，所以光散射在單細(xì)胞分析領(lǐng)域應(yīng)用有限。

3.3 光成像

光成像檢測(cè)單細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征的工作原理如圖2(c)所示[67]。在光成像方法中，細(xì)胞膜及細(xì)胞核染色的細(xì)胞流經(jīng)檢測(cè)區(qū)域被不同波長(zhǎng)激光照射，產(chǎn)生相應(yīng)的不同發(fā)射熒光，利用成像元件(如CCD相機(jī))捕獲對(duì)應(yīng)的熒光圖像，表征細(xì)胞及細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)特征。

作為該領(lǐng)域的先驅(qū)，Luminex(Amnis)公司研究人員在流式細(xì)胞儀的基礎(chǔ)上發(fā)展了FlowSight成像流式細(xì)胞儀，后續(xù)針對(duì)激光種類(lèi)、放大倍數(shù)以及靈活性等方面進(jìn)行改進(jìn)，形成了ImagingStream X Mark II成像流式細(xì)胞儀，可實(shí)現(xiàn)至多12通道光成像，廣泛應(yīng)用于血液學(xué)、腫瘤學(xué)、干細(xì)胞分化等領(lǐng)域。

光成像廣泛應(yīng)用于細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞及亞細(xì)胞定位，提取細(xì)胞及細(xì)胞核的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征。相比于光散射，光成像能夠提供更準(zhǔn)確、全面的細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，然而仍無(wú)法同時(shí)收集單細(xì)胞電學(xué)特征信息。

綜上所述，檢測(cè)單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征的流動(dòng)式方法顯著提高了檢測(cè)通量，但著重在于獲取細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，而沒(méi)有實(shí)現(xiàn)同時(shí)采集細(xì)胞固有電學(xué)特征的功能(電阻抗方法得到的電脈沖也僅反映了細(xì)胞大小的信息)，由于檢測(cè)參數(shù)的有限性限制了單細(xì)胞分析的應(yīng)用。

4 基于微流控檢測(cè)方法

隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，其特征尺寸可以很好地與細(xì)胞尺寸相匹配，能夠更方便、快速地用于細(xì)胞檢測(cè)，適用于高通量獲取細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征參數(shù)。隨之發(fā)展的基于微流控檢測(cè)方法，驅(qū)動(dòng)單個(gè)細(xì)胞依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域，引起阻抗信號(hào)的變化，依據(jù)等效模型，轉(zhuǎn)換為表征細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征的參量。這類(lèi)方法主要的發(fā)展，其一在于電極數(shù)量、結(jié)構(gòu)布局等方面的改變，主要包括共面電極、對(duì)面電極、對(duì)面電極集成光學(xué)透鏡以及多電極結(jié)構(gòu)；其二在于針對(duì)微通道的橫截面特征尺寸的改變，較于微通道結(jié)構(gòu)(微通道橫截面積的特征尺寸大于細(xì)胞直徑)提出了壓縮通道(微通道橫截面積特征尺寸小于細(xì)胞直徑)的結(jié)構(gòu)。

4.1 共面電極

作為基于微流控的方法檢測(cè)單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征的前驅(qū)，Gawad等人[68]提出了基于共面電極(電極處于同一平面)的微流控阻抗流式細(xì)胞儀，工作原理如圖3(a)所示。細(xì)胞在微通道中穿行，依次通過(guò)底部嵌入的3個(gè)共面電極，其中中間電極作為公共電極，與兩端電極分別組成一組電極對(duì)，構(gòu)成差分阻抗檢測(cè)配置(細(xì)胞通過(guò)其中一組電極對(duì)時(shí)，另一組電極對(duì)作為參考，消除檢測(cè)噪聲等干擾)，測(cè)量細(xì)胞通過(guò)時(shí)的阻抗變化，反映細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征和電學(xué)特征等信息。

Gawad等人[68]利用該結(jié)構(gòu)，成功區(qū)分了不同粒徑的乳膠珠子(5 μm和8 μm)以及正常紅細(xì)胞與血影細(xì)胞(紅細(xì)胞經(jīng)低滲處理后，質(zhì)膜破裂將胞質(zhì)內(nèi)容物釋放至胞外后恢復(fù)原來(lái)形態(tài)和大小的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu))。然而，該方法采用的共面電極在通道高度上產(chǎn)生電場(chǎng)分布不均勻，從而影響阻抗變化，更重要的是，由于缺乏有效模型的支撐，獲取的阻抗信號(hào)無(wú)法進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為細(xì)胞固有電學(xué)特征參數(shù)。

4.2 對(duì)面電極

針對(duì)通道高度上電場(chǎng)分布不均勻的問(wèn)題，Cheung等人[69]提出了基于對(duì)面電極(電極面平行相對(duì))的微流控阻抗流式細(xì)胞儀，工作原理如圖3(b)所示。細(xì)胞在微通道中穿行，依次通過(guò)兩對(duì)對(duì)面電極，其中底部電極共同接地，構(gòu)成差分阻抗檢測(cè)配置，測(cè)量細(xì)胞通過(guò)時(shí)的阻抗變化，并提出“不透明度”(opacity)的概念，即高頻阻抗與低頻阻抗的比值，映射細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征等信息。

圖3 基于微流控檢測(cè)方法

Cheung等人[69]利用該結(jié)構(gòu)，成功區(qū)分了不同粒徑的乳膠珠子(4 μm， 5 μm和6 μm)、正常紅細(xì)胞與血影細(xì)胞、正常紅細(xì)胞與不同化學(xué)處理的紅細(xì)胞。該方法提出的對(duì)面電極結(jié)構(gòu)，使得測(cè)量細(xì)胞周?chē)碾娏髅芏雀泳鶆?，一定程度上消除了電?chǎng)分布不均對(duì)阻抗檢測(cè)的影響，但也增加了電極制備的復(fù)雜度，同時(shí)仍未解決表征單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征的根本問(wèn)題。

4.3 對(duì)面電極集成光學(xué)透鏡

為了更好地表征單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征，增強(qiáng)檢測(cè)功能，Holmes等人[70]集成了對(duì)面電極與光學(xué)透鏡，形成了微流控阻抗熒光流式細(xì)胞儀，工作原理如圖3(c)所示。細(xì)胞在微通道中穿行，通過(guò)兩對(duì)對(duì)面電極，采集差分阻抗信號(hào)變化，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)熒光抗體被激光照射激發(fā)，產(chǎn)生相應(yīng)的發(fā)射熒光信號(hào)被光電器件(光電倍增管PMT)接收，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征的多維表征。

Holmes等人[70]利用該裝置，結(jié)合阻抗信號(hào)和熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了白細(xì)胞3分群[70]或淋巴細(xì)胞亞群分類(lèi)[71]，相較于上述微流控方法，該方法增加了維度參數(shù)，有利于更全面地理解單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征，但同樣無(wú)法獲取單細(xì)胞固有的電學(xué)特征。

4.4 多電極

近年來(lái)，該領(lǐng)域研究人員通過(guò)增加電極個(gè)數(shù)、改變電極布局等，消除現(xiàn)有方法存在的細(xì)胞位置影響測(cè)量結(jié)果的問(wèn)題。Caselli等人[72–74]一直致力于此，首先提出了一種新型共面5電極結(jié)構(gòu)[72]，工作原理如圖4(a)所示。細(xì)胞在微通道中穿行，依次通過(guò)底部的5個(gè)電極，其中在第3電極上施加交流信號(hào)，第2和第4電極處于浮動(dòng)，第1和第5電極測(cè)量流經(jīng)的電流差。該結(jié)構(gòu)中的電極布局形成的非均勻電場(chǎng)，包括4個(gè)高場(chǎng)強(qiáng)區(qū)域和之間間隔的弱場(chǎng)區(qū)域，從而形成的信號(hào)趨勢(shì)與細(xì)胞大小及所處垂直位置相關(guān)，并可用于補(bǔ)償細(xì)胞垂直位置變化引起的細(xì)胞尺寸測(cè)量的誤差，從而達(dá)到高精度表征細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，但該方法只能得到阻抗數(shù)據(jù)，無(wú)法得到細(xì)胞固有電學(xué)特征。

后續(xù)，Reale等人[73]在上述共面5電極的基礎(chǔ)上，增加了兩對(duì)相對(duì)共面電極用于表征單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征，結(jié)構(gòu)示意如圖4(b)所示。兩對(duì)相對(duì)共面電極位于側(cè)通道底部，將交流電壓施加在其中一組對(duì)角電極，另一組對(duì)角電極收集差分電流，用于測(cè)量細(xì)胞橫向位置；5個(gè)共面電極位于主通道底部，檢測(cè)配置同上，用于測(cè)量細(xì)胞垂直位置。通過(guò)確定細(xì)胞在通道中橫截面位置，消除位置對(duì)細(xì)胞尺寸測(cè)量的影響，但同樣無(wú)法獲取固有電學(xué)特征。

另一方面，Honrado等人[74]在保留兩對(duì)相對(duì)共面電極的基礎(chǔ)上，將共面5電極更改為兩對(duì)對(duì)面電極，結(jié)構(gòu)示意如圖4(c)所示。相對(duì)共面電極的檢測(cè)配置同上，而對(duì)面電極檢測(cè)配置同樣更改為對(duì)角激勵(lì)及檢測(cè)。該方法同樣用于確定細(xì)胞在通道中的橫截面位置，更準(zhǔn)確地獲取細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，但仍不能得到細(xì)胞固有電學(xué)特征信息。

Yang等人[75]針對(duì)電極布局進(jìn)行改進(jìn)，提出了一種新型N型電極結(jié)構(gòu)，用于表征單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征，結(jié)構(gòu)示意如圖4(d)所示。N型電極由兩個(gè)外側(cè)電極和中間一個(gè)傾斜電極組成。由于傾斜電極的設(shè)計(jì)，不同橫向位置細(xì)胞通過(guò)前端兩個(gè)電極和后端兩個(gè)電極的時(shí)間不同，從而精確細(xì)胞的橫向位置，校準(zhǔn)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征。相對(duì)于Caselli等人[72]的新型共面5電極結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)電極相對(duì)更簡(jiǎn)單，獲取的信號(hào)波形更易于處理，但仍無(wú)法將阻抗數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞固有電學(xué)特征。

圖4 基于微流控檢測(cè)方法(多電極)

與此同時(shí)，Spencer等人[76]對(duì)此也做了一些工作，提出了一種對(duì)面5電極結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)示意如圖4(e)所示。其中第2和第4電極對(duì)，頂部電極施加多種頻率電壓激勵(lì)，底部電極用于收集差分電流，其余電極接地。獲取的阻抗頻譜通過(guò)單殼模型(即假設(shè)一個(gè)一定厚度的球形殼體將內(nèi)部相與環(huán)境相分離)進(jìn)一步處理校準(zhǔn)，可得到細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征，如細(xì)胞大小、細(xì)胞膜比電容、細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率和介電常數(shù)。然而由于模型中的某些參量非實(shí)際檢測(cè)確定的，而是依據(jù)前人數(shù)據(jù)進(jìn)行假設(shè)設(shè)定的，同時(shí)又由于細(xì)胞與通道壁之間存在較大的間隙，導(dǎo)致細(xì)胞通過(guò)時(shí)阻抗變化較低，無(wú)法精確獲取細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征。

近來(lái)，文獻(xiàn)[77]觀(guān)察到非對(duì)稱(chēng)細(xì)胞產(chǎn)生的阻抗脈沖存在傾斜的現(xiàn)象，為了進(jìn)一步表征細(xì)胞的形狀，提出了一種新型電極布局結(jié)構(gòu)，其工作原理如圖4(f)所示。在該結(jié)構(gòu)中，使用一個(gè)非平行浮動(dòng)電極來(lái)分離共面3電極形成的兩個(gè)檢測(cè)區(qū)域，同時(shí)浮動(dòng)電極間形成等電場(chǎng)區(qū)域，細(xì)胞通過(guò)時(shí)，阻抗保持不變。依據(jù)細(xì)胞通過(guò)時(shí)間來(lái)確定細(xì)胞的橫向位置校準(zhǔn)細(xì)胞大小，同時(shí)通過(guò)得到的阻抗信號(hào)傾斜指數(shù)作為細(xì)胞形態(tài)表型。該方法提供了更多細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征的信息，但仍未獲取細(xì)胞固有電學(xué)特征參數(shù)。

綜上所述，以上單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征的微流控檢測(cè)方法更多地在于通過(guò)獲取細(xì)胞在微通道橫截面中位置，以此來(lái)校準(zhǔn)細(xì)胞尺寸，進(jìn)一步修正阻抗信號(hào)，但缺乏有效的模型將阻抗數(shù)據(jù)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為細(xì)胞固有電學(xué)特征。

4.5 壓縮通道

針對(duì)上述方法，細(xì)胞在微通道中穿行，與通道內(nèi)壁存在很大的間隙，總體來(lái)說(shuō)，很難提出有效的等效電學(xué)模型獲取細(xì)胞固有電學(xué)特征，如細(xì)胞膜比電容和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率。所以對(duì)此，本課題組減小微通道的橫截面積，提出了壓縮通道的概念。

本課題首先提出了基于“一字型”壓縮通道的微流控阻抗流式細(xì)胞儀，工作原理如圖5(a)所示[78]。細(xì)胞連續(xù)通過(guò)壓縮通道，利用鎖相放大器檢測(cè)壓縮通道兩端雙頻阻抗信號(hào)，同時(shí)利用高速照相機(jī)記錄細(xì)胞通過(guò)壓縮通道的形態(tài)(如細(xì)胞拉伸長(zhǎng)度，即細(xì)胞被壓縮后在穿行方向上的長(zhǎng)度)。然后依據(jù)該方法提出的壓縮通道等效電學(xué)模型進(jìn)行轉(zhuǎn)換擬合得到單細(xì)胞膜比電容、細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率以及細(xì)胞直徑。然而，該方法由于圖像采集處理過(guò)程得到數(shù)據(jù)用于后續(xù)計(jì)算，限制了檢測(cè)通量，無(wú)法獲取具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的大量數(shù)據(jù)。

為了進(jìn)一步提高檢測(cè)通量，本課題組提出了基于“十字型”壓縮通道的微流控阻抗流式細(xì)胞儀，工作原理如圖5(b)所示[79]。細(xì)胞通過(guò)“十字型”主壓縮通道的同時(shí)，利用鎖相放大器測(cè)量側(cè)壓縮通道兩端之間的雙頻阻抗信號(hào)，基于提出的等效電學(xué)模型轉(zhuǎn)換擬合得到單細(xì)胞膜比電容和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率。該方法雖然極大地提高了檢測(cè)通量，但缺少了單細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征檢測(cè)。

針對(duì)“一字型”和“十字型”壓縮通道的限制，本課題后續(xù)提出了基于“雙T型”壓縮通道的微流控阻抗流式細(xì)胞儀，工作原理如圖5(c)所示[80]。細(xì)胞通過(guò)雙T型壓縮通道時(shí)，利用鎖相放大器測(cè)量側(cè)通道兩端之間的雙頻阻抗信號(hào)，根據(jù)阻抗信號(hào)波形與細(xì)胞穿行距離進(jìn)行匹配得到細(xì)胞拉伸長(zhǎng)度，進(jìn)一步得到細(xì)胞直徑，同時(shí)阻抗幅值、相位擬合于等效電學(xué)模型可得到單細(xì)胞膜比電容和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率。該方法在滿(mǎn)足高通量的條件下，盡可能更多地檢測(cè)單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征參數(shù)，但針對(duì)細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征仍未表征。

圖5 基于微流控檢測(cè)方法(“壓縮通道”)

為了進(jìn)一步提高檢測(cè)參數(shù)，本課題組最新開(kāi)展了具有熒光檢測(cè)窗口的“雙T型”壓縮通道的微流控流式細(xì)胞儀?！半pT型”壓縮通道結(jié)構(gòu)用于進(jìn)行阻抗檢測(cè)，得到細(xì)胞直徑、細(xì)胞膜比電容和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率；同時(shí)熒光檢測(cè)窗口用于進(jìn)行熒光檢測(cè)，得到細(xì)胞核直徑。該方法可以在保證一定的高通量前提下，獲取單細(xì)胞相對(duì)完整的結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征，但針對(duì)細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則(如桿狀或分葉狀)，該方法仍無(wú)法做出表征，同時(shí)也無(wú)法獲取細(xì)胞核的電學(xué)特征等，但這也給后續(xù)的研究提供了方向。

以上，就目前已有的單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征檢測(cè)方法進(jìn)行了闡述概括，主要介紹了不同檢測(cè)方法的原理、發(fā)展及主要優(yōu)缺點(diǎn)，并提出了目前該領(lǐng)域所面臨的機(jī)遇挑戰(zhàn)。最后，針對(duì)單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征檢測(cè)方法主要的標(biāo)志性發(fā)展及檢測(cè)參數(shù)和成就，歸納總結(jié)如表1所示，有望對(duì)后續(xù)單細(xì)胞結(jié)構(gòu) 和電學(xué)特征檢測(cè)方法的發(fā)展有一定指導(dǎo)意義。

表1 單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征檢測(cè)方法標(biāo)志性發(fā)展

5 結(jié)束語(yǔ)

單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征檢測(cè)揭示了細(xì)胞之間的差異，能夠更好地應(yīng)用于分析血液細(xì)胞生理病理機(jī)制、腫瘤細(xì)胞惡性程度以及干細(xì)胞分化階段。面對(duì)單細(xì)胞固有結(jié)構(gòu)和電學(xué)特性應(yīng)用的需求越來(lái)越多，基于微流控技術(shù)的檢測(cè)方法在迎接更多的挑戰(zhàn)的同時(shí)也面臨一些潛在方向的機(jī)遇。其中提升檢測(cè)通量是一大方向，隨著檢測(cè)通量的提高，大量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)的獲取對(duì)于分析更多樣本(如血液中痕量存在的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分析)以及分析的準(zhǔn)確性都有巨大意義。另一潛在方向在于檢測(cè)參數(shù)的增加及綜合檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)，隨著更多解耦參數(shù)的應(yīng)用十分有利于細(xì)胞亞類(lèi)型的分類(lèi)(如白細(xì)胞5分類(lèi)以及粒細(xì)胞系統(tǒng)劃分為早幼、中幼、晚幼、桿狀核和分葉核粒細(xì)胞等)?？偠灾?，基于微流控的單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征檢測(cè)方法仍處于探索、發(fā)展階段，還需要進(jìn)一步的技術(shù)創(chuàng)新，高通量地實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞結(jié)構(gòu)和電學(xué)特征多參數(shù)表征以對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行綜合評(píng)估。