哈里布努爾，熱依拉穆·麥麥提吐爾遜，艾沙江·阿不都沙拉木,2*

(1 喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院, 新疆喀什 844000；2 新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什 844000)

被子植物的花大小、花顏色、花回饋(花蜜、花粉和花氣味)和雌雄蕊器官異熟、異位程度及花壽命、花藥開裂和花粉散粉時間等表現(xiàn)的花部綜合征(花設(shè)計(jì)和花展示)，通過傳粉者活動、花粉散粉過程、雌雄功能干擾及交配方式來影響雌雄繁殖成功程度[1-4]，其中的雄性繁殖受到花回饋、傳粉者類型和效率以及花粉呈現(xiàn)的影響。

傳粉效率(雄性適合度)是推動植物花部特征進(jìn)化的重要驅(qū)動力[5]。有花植物在更多的資源投入(花粉數(shù)量)和調(diào)整花粉呈現(xiàn)時序(花粉散粉方式)來提高雄性繁殖及適合度[6-8]，其中的花粉呈現(xiàn)過程式不僅提高花粉傳遞效率、避免雌雄功能干擾及減少雄性競爭來保障雄性適合度(花粉移出)，而且可增加植物對環(huán)境變化的適應(yīng)能力來保障雌性繁殖成功[9-11]。花粉呈現(xiàn)過程不僅受到植物花部特征的影響，還受到傳粉者類型和效率(高移出高沉積、高移出低沉積、低移出高沉積及低移出低沉積4種類型)的影響。在傳粉者充足的情況下植物通過花粉逐步呈現(xiàn)(花粉從花藥、花或花序上逐次被釋放，使傳粉者依次移出花粉)吸引更多的傳粉者來減少被一次移出的花粉，避免花藥間的干擾，提高雄性繁殖及適合度[7,12-15]，反而在極端環(huán)境下(早春低溫、沙塵暴及暴雨等)傳粉者稀少時, 植物通過同時呈現(xiàn)(花粉同步和較快的速度散出)來增加傳粉者一次訪花帶走的花粉量來避免雄性資源浪費(fèi)[7,13-14,16-17]。在花壽命短、訪花頻率和傳粉者效率低的異花傳粉植物中，花粉逐步呈現(xiàn)是降低花粉限制、提高雄性適合度及異交，保障雌性繁殖的最佳策略[18-19]。

有花植物的雌性繁殖通過不同的交配方式來實(shí)現(xiàn)。已報(bào)道的交配方式有自主自交(Autonomous autogamy)、輔助自交(Facilitated selfing)及閉花受精(Cleistogamy)、異交和混合交配等類型[20-23]，其中異交為主的交配系統(tǒng)能產(chǎn)生雜種，增強(qiáng)后代活力，避免自交衰退，促進(jìn)物種的遺傳多樣性，但該類群的雌性繁殖成功受到花粉呈現(xiàn)及傳粉者效率相關(guān)雄性繁殖水平的影響。至今，在中國暖溫帶荒漠環(huán)境分布的植物雌雄繁殖的關(guān)系相關(guān)研究很少報(bào)道，本研究以主要分布在寧夏、新疆及內(nèi)蒙古等干旱和荒環(huán)境分布的藥用植物寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)為研究材料，對該物種在喀什自然種群的花粉呈現(xiàn)機(jī)制與交配系統(tǒng)的關(guān)系進(jìn)行了研究，以期探討花粉逐步呈現(xiàn)的適應(yīng)性及其在提高雌雄繁殖過程中的意義。

1 材料和方法

1.1 研究材料與研究地點(diǎn)

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)的藥用經(jīng)濟(jì)植物，中國只在寧夏、新疆、內(nèi)蒙等干旱和半干旱地區(qū)分布的特有種。該物種的花為兩性花，花為筒狀花；花萼窄鐘狀，花冠紫色或藍(lán)紫色，花瓣和雄蕊均5個，雄蕊著生于花冠筒口；傳粉方式為蟲媒傳粉[24]。

本研究在新疆喀什市野生寧夏枸杞自然居群中進(jìn)行(39°28′ N，75°59′ E；海拔1 200～1 280 m)，該區(qū)域春季沙塵暴較多，夏季高溫，年平均氣溫12 ℃，年均降水量70 mm，年均沙塵暴天數(shù)(24±7) d，氣候類型屬于典型的暖溫帶荒漠氣候。本研究所有實(shí)驗(yàn)在2019-2020年的6月至9月開展。

1.2 研究方法

1.2.1 開花式樣與花部特征為檢測寧夏枸杞開花式樣的特點(diǎn)，在居群盛花期，隨機(jī)選取即將開放及發(fā)育良好的20朵花，觀察并記錄每朵花的壽命及其在不同時間段的花顏色和雌雄階段持續(xù)時間。在居群花期內(nèi)，從10株同一位置上隨機(jī)選取各2朵花，帶回實(shí)驗(yàn)室，使用便攜式SE-2000型數(shù)顯電子游標(biāo)卡尺(桂林迪吉特電子有限公司, 桂林, 中國; 精度為0.02 mm)，測量每朵花的花冠口直徑、花冠筒長度、花冠筒直徑、花瓣長寬、花萼長寬。同時從不同個體中選取發(fā)育狀態(tài)一致即將開放的50朵花，在每個花藥開裂階段選取10朵花，用游標(biāo)卡尺測量其各階段每個雄蕊與雌蕊的長度。

1.2.2 性分配特征及花粉呈現(xiàn)式樣于寧夏枸杞不同個體中隨機(jī)選取剛開放(花藥未開裂)的20朵花，每朵花的花藥放在離心管中，加入2 mL水充分搖勻制成花粉溶液，使用微量進(jìn)樣器取5 μL分5次滴于載玻片上，在Motic B1型光學(xué)顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司, 廈門, 中國)下統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)量，每朵花重復(fù)6次；同時每朵花的子房在Nikon SMZ-1000型解剖鏡(Nikon corporation, Tokyo, Japan)下解剖并統(tǒng)計(jì)胚珠數(shù)，計(jì)算每朵花的P/O(花粉數(shù)/胚珠數(shù))。

在寧夏枸杞盛花期內(nèi)，從10個不同個體中隨機(jī)選取40朵即將開放的花，觀測記錄：(a)花完全開放到花藥開始開裂所需時間；(b)每一朵花不同位置花藥散粉所需時間；(c)每一朵花所有花藥完全開裂所需時間。同時在每朵花每個花藥開裂20 min后將已開裂的花藥取回，放入離心管壓碎后，加入0.5 mL水充分搖勻，使用5 μL微量進(jìn)樣器分5次滴于載玻片上，每朵花重復(fù)3次，在Motic B1型光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)剩余花粉數(shù)量，計(jì)算花粉移出率。在自然種群中隨機(jī)選取10朵即將開放的花，將各花的花藥及柱頭置于EP管中自然晾干后，用電膠將樣品粘貼在標(biāo)本臺上，用真空鍍膜儀(MSP-2S, IXRF Systems, 日本)鍍膜后，放入掃描電鏡(FEI, Quanta250, 美國)觀察花粉和花柱形態(tài)并采集圖像。

1.2.3 花回饋和傳粉特性(1)花回饋及花氣味的測定：為了檢測寧夏枸杞花雄雌性階段的花蜜量，在盛花期隨機(jī)標(biāo)記將要開放的40朵花并套網(wǎng)袋，在花雄雌性階段快結(jié)束時，用2 μL的毛細(xì)管(上海積裕實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司, 上海, 中國)對標(biāo)記花的花蜜分泌量進(jìn)行測量。同時，從不同個體隨機(jī)選取雄雌階段花各70朵，放入20 mL頂空瓶內(nèi)，并用壓蓋器封緊瓶蓋，室溫放置2 h使花氣味充分散發(fā)，用Portable Electronic Nose PEN3型電子鼻(Airsense Analytics, Schwerin, Germany)檢測花氣味中的化學(xué)成分，檢測時間調(diào)至60 s,傳感器自動清洗時間調(diào)至120 s，Connectvial倒計(jì)時提示1 s時，同時將進(jìn)樣針和補(bǔ)氣針插入頂空進(jìn)樣器至瓶身2/3處，開始檢測揮發(fā)性物質(zhì)，當(dāng)Removevial倒計(jì)時提示1 s時迅速拔出進(jìn)樣針和補(bǔ)氣針，停止檢測，重復(fù)檢測3次，并計(jì)算每種化合物占總化合物含量的百分比及不同階段芳香物質(zhì)含量的變化。

(2)訪花行為及傳粉者效率：在觀測點(diǎn)晴朗的天氣里，隨機(jī)標(biāo)記當(dāng)天開放的10朵花，每天8:00-20:00間內(nèi) (30 min/h，總240 min/d)，觀測寧夏枸杞的昆蟲訪花頻率及停留時間；同時用昆蟲網(wǎng)捕獲昆蟲，致死后，通過昆蟲攜帶的花粉與寧夏枸杞的花粉比較觀察, 判斷其是否為傳粉者，并鑒定昆蟲種類。依照Han等[25]的方法，花被一次訪花后，取回其花藥和柱頭，帶回實(shí)驗(yàn)室，在Motic B1型光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)其從花藥移出和沉積到柱頭上的花粉量；參考Harder等[13]的公式(g)=logRD來計(jì)算傳粉者效率(Pollinator efficiency)，其中的g是傳粉者效率，R是被昆蟲移出的花粉數(shù)，D是柱頭沉積的花粉數(shù)。

1.2.4 自交親和性和花粉限制的判斷在寧夏枸杞盛花期，從10個個體中隨機(jī)標(biāo)記發(fā)育狀況一致即將開放的120朵花，在花開放時，進(jìn)行以下處理 (每個處理30朵花)：(1)自然授粉。不去雄、自然開放式授粉；(2)去雄人工異花授粉。在花剛開放(花藥未開裂)時去雄，并用異株花粉來進(jìn)行人工授粉；(3)自發(fā)自交(主動自交)。在花即將開放時直接套袋；(4)人工自花授粉。在花即將開放時套袋，花藥開裂時用自花花粉進(jìn)行人工授粉。果實(shí)成熟時統(tǒng)計(jì)不同處理花的座果率及結(jié)籽率。參照Zapata等[26]的方法判斷自交親和性，SI=ssi/sso(ssi是人工自花授粉后的結(jié)籽率，sso是人工異花授粉結(jié)籽率)。同時，參照Castro等[11]的方法計(jì)算傳粉者限制(PL)：PL= [(PX-PE)×100%]/PX，PX指去雄人工異花授粉花的結(jié)籽率，PE是指自然傳粉花的結(jié)籽率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有的數(shù)據(jù)分析在SPSS 22.0，分析前，用Explore命令花設(shè)計(jì)、花展示、授粉實(shí)驗(yàn)不同處理的結(jié)實(shí)結(jié)籽率以及傳粉昆蟲在不同時間段的訪花頻率、停留時間進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。對服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，選用One-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行方差性分析。利用廣義線性模型(generalized linear model, GLM)，授粉實(shí)驗(yàn)不同處理的結(jié)實(shí)結(jié)籽率用正態(tài)分布模型-恒定函數(shù)進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (Mean±SE) 表示，作圖使用Sigma Plot 10.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 開花特性與花部特征

自然居群中，寧夏枸杞的種群花期為90 d左右。大部分花在上午11：00左右開花，單花壽命為(4.07±0.15)d，其雌性(4±0.01)d比雄性階段(0.07±0.01)d長，雌雄階段持續(xù)時間存在顯著差異(F=288 495.17,P<0.001)。花冠口直徑為(12.17±0.50)mm，花冠筒長度和直徑分別為(6.22±0.31)mm和(2.86±0.12)mm，花瓣長寬分別為(5.84±0.27)mm和(3.94±0.14)mm，花萼長寬分別為(4.70±0.21)mm和(2.77±0.10)mm；花壽命不同階段的雌蕊長度均比雄蕊長度長，且二者在不同階段的長度間存在顯著差異(F雄性=32.01,P<0.001；F雌性=133.07,P<0.001; 圖1，A-F； 圖2，Ⅰ)，雌雄蕊空間位置屬于探頭式雌雄異位；花柱在雄性階段彎曲，而雌性階段回正(圖1)。花在雄性階段花瓣為鮮艷的紫色(圖1，A-E)，而雌性階段的花瓣顏色為淡紫色(圖1，F(xiàn))，花粉形態(tài)為橢圓形，花粉外壁具有不規(guī)則的條紋(圖1，G)，柱頭表面有明顯的乳突細(xì)胞(圖1，H)。

2.2 性分配特征及花粉呈現(xiàn)式樣

寧夏枸杞單花花粉量為(4 6980±3 833)粒,胚珠為(20.40±1.33)個, 花粉胚珠比(P/O值)為(2 448.11±448.32)，屬于兼性異交繁育系統(tǒng)類型。該物種花藥在花開放(21.77±6.38)min后開始開裂；5枚花藥的開裂方式比較穩(wěn)定，從柱頭彎曲位置靠近的花藥開始順時轉(zhuǎn)逐步開裂；單個花藥開裂所需時間為(12.41±0.83)min，5枚花藥開裂所需總時間(94.15±7.47)min；不同花藥開裂所需時間間存在差異(F=3.43,P=0.015)，第1個花藥到第5個花藥開裂所需時間逐漸延長(圖2, Ⅱ)，屬于逐步呈現(xiàn)類型。此外，不同花藥開裂間隔時間之間存在顯著差異(F=20.062,P<0.001)，其中第1、2及3花藥在開裂所需時間上有一定的相互重疊(圖2，Ⅲ)，反而第4和第5個花藥開裂所需時間上完全隔離；說明每個花藥的花粉散粉時間及雄性功能間存在一定干擾現(xiàn)象。每個花藥開裂時花粉被昆蟲轉(zhuǎn)移，第1花藥(89.16%±0.93%)到第5個花藥(85.78%±2.46%)被昆蟲帶走的花粉逐步減少，但后一個花藥開裂時從前一個花藥被移出花粉率間無顯著差異(F=5.729,P=0.22；圖2，Ⅳ)，從每個花藥后一個花藥開裂前被移出的花粉率均達(dá)到(88.23%±0.84%)，說明花粉逐步呈現(xiàn)會促進(jìn)花粉的有效散粉。

2.3 花回饋及傳粉特性

(1)花回饋和花氣味：寧夏枸杞的花報(bào)酬是花蜜、氣味和花粉?；ㄔ谛坌噪A段分泌的花蜜量(0.53±0.08) μL比雌性階段(0.29±0.04) μL多，且二者間存在顯著差異(Wald χ2=6.599,P=0.01)?；ㄔ诖菩垭A段均分泌10大類化合物，其中有4類為芳香類化合物；花在雌性階段分泌的各化合物含量往往比雄性階段高(表1)；雌性階段(34.37%±0.21%)的芳香類物質(zhì)含量比雄性階段(31.82%±0.15%)高，且二者之間存在顯著差異(F=99.21,P=0.001)。

表1 寧夏枸杞花雄性階段和雌性階段花氣味中的化學(xué)成分占總化合物百分比的比較Table 1 Comparison of chemical components in percentage of total compounds (mean±standard error) between male and female stages flower of L. barbarum

(2)訪花行為及傳粉者效率:寧夏枸杞在自然居群的訪花昆蟲有意大利蜜蜂(Apismellifera)、熊蜂(Bombussp.)、食蚜蠅(Syrphidaesp.)、螞蟻 (Tetramoriumsp.)及蒼蠅 (Syrphidfly)等5種。其中意大利蜜蜂、熊蜂和食蚜蠅的身上有該物種的花粉，均為傳粉者；螞蟻為盜蜜者，蒼蠅為訪花者。3種傳粉者雄性階段的訪花頻率(1.44±0.36)比雌性階段高(0.13±0.04)，且存在顯著差異(F=13.44,P<0.01)(圖3，A)。主要傳粉者熊蜂和食蚜蠅一次訪花后移走的花粉數(shù)之間存在顯著差異(F=8.344,P=0.008)，但二者一次訪花后沉積的花粉 (F=0.52,P=0.483)和傳粉者效率(F=0.23,P=0.64)間未存在顯著差異(表2)，熊蜂和食蚜蠅的傳粉者效率屬于高移出低沉積傳粉者類型。

表2 不同傳粉者一次訪花后的花粉傳遞效率Table 2 Total number of removed, deposited pollen grains and pollinator efficiency with different pollinators

2.4 自交親和性和花粉限制

寧夏枸杞不同授粉處理下的座果率(Wald χ2=878.66,P<0.01)和結(jié)籽率(Wald χ2=388.27,P<0.01)間均呈顯著差異(表3)，其中人工異花授粉花的座果率及結(jié)籽率均高于自然授粉花；自發(fā)自交座果率為0，說明該物種未存在主動自交現(xiàn)象；此外，人工自花授粉花的座果率(7.82±3.72)及結(jié)籽率(5.93±0.91)，自交不親和指數(shù)為0.07，屬于自交不親和植物類型；交配方式屬于兼性異交。寧夏枸杞在喀什的自然居群中存在較高的花粉限制(40.71%)。

表3 不同處理授粉對寧夏枸杞結(jié)實(shí)和結(jié)籽率的影響(n=30)Table 3 Effect of pollination treatments on percent fruit-set and seed-set per fruit in the L. barbarum (n=30)

3 討 論

3.1 雌雄功能的干擾及花粉呈現(xiàn)式樣

植物的花部特征不僅影響其對傳粉者的吸引和花粉散布，還與傳粉機(jī)制和植物適合度有著緊密的聯(lián)系[27-28]。對于蟲媒傳粉植物的雄性適合度可能會隨著植物一次提供更多的花粉而降低[14,29]，因此蟲媒傳粉的大多數(shù)植物通過花粉逐步呈現(xiàn)來提高雄性繁殖[7,10]；如在蟲媒傳粉植物Bomareaacutifolia通過6枚雄蕊依次開裂的逐步呈現(xiàn)來提高花粉移出率[30]，而Erythroniumgrandiflorum及草地老鸛草(GeraniumpratenseL.)通過內(nèi)外輪雄蕊逐步呈現(xiàn)來避免雌雄功能干擾[31-32]；此外，在傳粉者缺乏的環(huán)境中黑鱗頂冰花(Gageanigra)通過逐步呈現(xiàn)來延長散粉時間，降低雄性資源(花粉)浪費(fèi)[33-34]。本研究表明，寧夏枸杞在花壽命內(nèi)雌蕊長度往往比雄蕊長度長，屬于柱頭探出式雌雄異位類型，雄性階段持續(xù)時間比雌性階段短，雄雌階段的花粉移出和沉積率上表現(xiàn)出彼此間的權(quán)衡關(guān)系；說明該物種在長期適應(yīng)西北地區(qū)荒漠環(huán)境過程中，雌雄功能在時間和空間上進(jìn)化出了避免干擾機(jī)制。該物種花藥在花開放20 min后開始逐步散粉，不完全的逐步呈現(xiàn)(花粉散粉具有一定的同步性)來完成每個花藥的雄性繁殖，但花藥開裂及散粉時間上存在相互干擾；并且花藥散粉的同步呈現(xiàn)提高花藥間的雄性功能干擾程度。

花粉在花和花序內(nèi)的延長散粉時間和交錯呈現(xiàn)是一種進(jìn)化策略，保障其最大限度地輸出花粉和雄性繁殖成功[12,35]；蟲媒傳粉的植物中花回饋和傳粉者效率是影響雄性繁殖的主要因素[36]；其中花回饋的時間性變化不僅影響傳粉者活動，還能影響花粉的移出和沉積過程[12]。寧夏枸杞雌雄性階段花回饋(顏色、花蜜、花粉及氣味)間存在顯著差異；花短時間的雄性階段(1.5 h)內(nèi)分泌更多的花回饋(紫色的花色、花蜜及花粉)及分泌一定的芳香物來吸引傳粉昆蟲，通過花粉的不完全逐步呈現(xiàn)的策略，促進(jìn)大部分(85%)花粉的迅速移出；反而在漫長的雌性階段(94 h)，通過分泌更多的芳香物質(zhì)來吸引昆蟲，但極少的花回饋(花蜜和花粉)不僅降低訪花頻率，還影響花粉同步呈現(xiàn)的展現(xiàn)過程(僅有10%的花粉被移出)。同時，該物種高移出低沉積的兩種主要傳粉者在花回饋豐富雄性階段對花粉逐步呈現(xiàn)的成功有重要貢獻(xiàn)；花回饋相關(guān)的傳粉者活動對花粉同時呈現(xiàn)的實(shí)現(xiàn)沒有作用。此外，低沉積的傳粉者在雄性階段柱頭沉積的花粉(81.60±9.34)比雌性階段(29.13±4.37)多，說明訪花頻率不僅影響花粉移出還能影響花粉的沉積[12]?；ɑ仞伒臅r間性變化及兩種主要傳粉者的高移出低沉積效率只促進(jìn)該物種花粉的移出率，但對花粉的沉積沒有起到促進(jìn)作用。蟲媒傳粉植物花粉的呈現(xiàn)格局往往是植物開花式樣、花部特征以及傳粉者效率和環(huán)境等多種因素共同作用的結(jié)果[37-38]。因此該物種花粉不完全逐步呈現(xiàn)、雌雄空間異位等花部特征是在長期適應(yīng)西北地區(qū)荒漠環(huán)境(強(qiáng)沙塵暴、夏季高溫、荒漠氣候)過程中為了保障雄性繁殖、提高物種遺傳多樣性表現(xiàn)出的進(jìn)化機(jī)制，該物種在不同的生境花粉呈現(xiàn)可能有不同的散粉機(jī)制，有待進(jìn)一步的研究。

3.2 交配方式和花粉限制特征

動物傳粉植物的花部綜合征不僅影響其對傳粉昆蟲的訪花行為、花粉散粉過程[27, 39]，而且影響植物的交配方式及雌雄適合度[8]。按照Dafni[40]和Cruden[41]的方法，該物種的OCI(雌雄異位、花冠直徑)(OCI=4)和性分配特征P/O(2 448.11±448.32)上均進(jìn)化出兼性異交特征外，還在花粉呈現(xiàn)式樣、花回饋及訪花頻率上表現(xiàn)出適應(yīng)于異花授粉的特征。在授粉實(shí)驗(yàn)中，自花授粉花表現(xiàn)出很低的結(jié)籽率(自發(fā)自交為0，人工自花為5.93%)，屬于自交不親和類型；此外，自然傳粉花的結(jié)籽率比人工異花授粉花低，說明存在較高的花粉限制現(xiàn)象(40.71%)。自交不親和傳粉者訪花頻率及效率是影響雌性繁殖成功的主要因素[2,42-44]，在自然居群中該物種主要傳粉者的高移出低沉積的傳粉者效率、訪花頻率及交配系統(tǒng)特點(diǎn)是導(dǎo)致花粉限制的主要原因；該物種傳粉者依賴的花粉限制方面需要進(jìn)一步研究。

總之，該物種長期適應(yīng)新疆南部塔克拉瑪干沙漠邊緣荒漠環(huán)境過程中，通過花內(nèi)雌雄器官空間位置的分離和花粉逐步呈現(xiàn)(不完全)的策略來避免雌雄功能之間的干擾，削弱雄蕊內(nèi)部之間干擾和花粉間的競爭，來保障雄性繁殖；但在雌性階段花回饋依賴的訪花頻率及傳粉者效率變化以及自交不親和性是降低雌性繁殖并導(dǎo)致花粉限制的主要因素。