馬開(kāi)驃　唐亮　崔佳雯

摘要： 該研究以揚(yáng)州地區(qū)成年杉木為材料，采用半薄切片法以及掃描電鏡和透射電鏡觀察法，對(duì)杉木花粉發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明：杉木的造孢細(xì)胞形成于10月，持續(xù)至翌年的1月底至2月初。造孢細(xì)胞位于小孢子囊最里面，呈多邊形，數(shù)量多且彼此排列緊密；細(xì)胞壁很薄，細(xì)胞核較大，內(nèi)含豐富的細(xì)胞器和脂類物質(zhì)。造孢細(xì)胞發(fā)育成熟后彼此分離形成小孢子母細(xì)胞。小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂開(kāi)始于2月下旬，經(jīng)兩次減數(shù)分裂，先后形成二分染色體和四分染色體。小孢子從四分體釋放后，體積迅速增大，發(fā)育形成花粉，這個(gè)過(guò)程中，伴隨著明顯的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化。杉木成熟花粉壁由薄壁區(qū)和厚壁區(qū)兩部分組成，薄壁區(qū)中央有一個(gè)乳頭狀突起，突起上有一萌發(fā)孔。成熟花粉外壁著生了許多瘤狀顆粒。該研究結(jié)果為杉木生殖發(fā)育、有性繁殖以及系統(tǒng)演化研究提供了重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 杉木， 花粉， 小孢子， 造孢細(xì)胞， 散粉

中圖分類號(hào)： Q944， S791.27

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）10134206

杉木（Cunninghamia lanceolata），在傳統(tǒng)分類上屬于裸子植物門（Gymnospermae）杉科（Taxodiaceae），由于近年來(lái)國(guó)際學(xué)術(shù)界已將杉科并入廣義柏科（Cupressaceae），所以杉木現(xiàn)屬于柏科的杉木亞科（Cunninghamhioideae）杉木屬（Cunninghamia） （Mao et al， 2012）。該屬僅有1種1變種（于永福， 1995）。杉木是我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)最主要的造林用材樹(shù)種之一。目前，全國(guó)杉木人工林面積為911×104 hm2，占全國(guó)和世界人工林總面積的18%和5%（萬(wàn)曉華， 2013）。因此，杉木在我國(guó)造林樹(shù)種中占有重要地位。

花粉又稱為小孢子，是種子植物特有的結(jié)構(gòu)。由于裸子植物大都是風(fēng)媒傳粉（王莉等， 2015），裸子植物花粉生長(zhǎng)發(fā)育與形態(tài)結(jié)構(gòu)，與傳粉、受精等有性生殖密切相關(guān)（Lu et al， 2016）。杉木花粉形態(tài)及花粉管生長(zhǎng)形態(tài)已有相關(guān)報(bào)道，如席以珍（1986）和傅遠(yuǎn)志（1994）發(fā)現(xiàn)杉木花粉粒的形狀屬球形或近球形，萌發(fā)孔形狀多樣，花粉壁較薄。張卓文（2003）測(cè)定了杉木各無(wú)性系花粉大小、花粉萌發(fā)、花粉生活力以及花粉培養(yǎng)基等。徐進(jìn)等（2007）觀察了杉木花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)期單價(jià)體和多價(jià)體、染色體橋、滯后染色體、不均等分離、微核等異常細(xì)胞學(xué)行為。還有研究報(bào)道了杉木的花粉管中存在循環(huán)微絲束、微管的分布方式（甘國(guó)峰等， 2011， 2012）。盡管前人已對(duì)杉木花粉粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一些研究，但花粉在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，以及適應(yīng)傳粉特征目前尚不清楚，而這些是研究杉木授粉和有性生殖的重要基礎(chǔ)。因此，本研究從細(xì)胞學(xué)角度，研究觀察了杉木造孢細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、小孢子發(fā)生過(guò)程、花粉發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化以及成熟花粉的形態(tài)特征，為進(jìn)一步研究杉木傳粉生殖生物學(xué)提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用杉木取自江蘇省揚(yáng)州市瘦西湖風(fēng)景區(qū)（32°24′ N， 119°25′ E）內(nèi)，杉木生長(zhǎng)發(fā)育良好。于10月小孢子葉球出現(xiàn)至第2年4月散粉期間，對(duì)同一株杉木連續(xù)取樣，采集的小孢子葉球用戊二醛和FAA固定液固定后置于4 ℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 半薄切片觀察法將定期取樣的杉木小孢子葉球浸入戊二醛固定液中固定后置于4 ℃冰箱中保存。樣品取出后，用磷酸緩沖液清洗3次各15 min，之后進(jìn)行梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、100%）脫水處理各15 min，乙醇與丙酮2∶1、1∶1、1∶2混合液脫水處理各15 min，純丙酮脫水處理一次15 min，脫水處理后用spurr樹(shù)脂浸透包埋。包埋后的樣品修樣后，用ULTRACUT E型超薄切片機(jī)切片，切片后用甲苯胺藍(lán)染色后置于LEICA DMLS2型光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 掃描電鏡觀察法定期取樣的小孢子葉球用FAA固定液固定，置于4 ℃冰箱中保存。冰箱中保存。樣品取出后，用磷酸緩沖液清洗3次各15 min，梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脫水處理各15 min，乙醇與丙酮1∶1混合液脫水處理一次15 min，純丙酮脫水處理兩次各15 min，丙酮與乙酸異戊酯1∶1、1∶2混合液脫水處理各15 min，純乙酸異戊酯脫水處理一次30 min。脫水后在HCP2型臨界點(diǎn)干燥儀上干燥，然后在SCD500型離子濺射噴鍍儀上噴金，最后將樣品置于S4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下掃描并拍照。

1.2.3 透射電鏡觀察法將樣品用戊二醛固定，經(jīng)過(guò)PBS沖洗、鋨酸后固定、PBS沖洗、乙醇脫水、樹(shù)脂包埋等步驟后，用Leica EM UC6型超薄切片機(jī)切成100 nm的薄片，銅網(wǎng)撈片、烤片，醋酸鈾和佐滕氏鉛混合液雙重染色，在CM100型投射電子顯微鏡下觀察并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1 小孢子形成的解剖結(jié)構(gòu)觀察

10月中旬， 造孢細(xì)胞已經(jīng)形成，此時(shí)造孢細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞壁?。▓D版I： A）。11月中旬，造孢細(xì)胞細(xì)胞核明顯，少部分造孢細(xì)胞開(kāi)始瓦解，為其他造孢細(xì)胞的發(fā)育提供空間和營(yíng)養(yǎng)成分（圖版I： B）。隨后，造孢細(xì)胞彼此分離，形成游離狀的小孢子母細(xì)胞，小孢子母細(xì)胞具有較大的細(xì)胞核（圖版I： C）。小孢子母細(xì)胞形成之后，2月下旬，細(xì)胞的減數(shù)分裂開(kāi)始，經(jīng)過(guò)兩次減數(shù)分裂，形成二分染色體（圖版I： D）和四分染色體，新形成的四分體小孢子呈四角型，此時(shí)小孢子還未從四分體中釋放，每個(gè)小孢子呈三角狀，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器豐富（圖版I： E）。從四分體釋放后，小孢子體積迅速增大，細(xì)胞壁增厚，細(xì)胞質(zhì)有明顯的液泡化現(xiàn)象（圖版I： F）。

2.2 小孢子形成的超微結(jié)構(gòu)觀察

杉木的造孢細(xì)胞形成于10月，結(jié)束于第二年的1月底至2月初，持續(xù)近4個(gè)月。造孢細(xì)胞形成后，位于小孢子囊的中部，細(xì)胞數(shù)量多，呈多邊形，彼此排列緊密（圖版I： GH）。造孢細(xì)胞的細(xì)胞核較大，是細(xì)胞內(nèi)的主要部分，核仁中染色質(zhì)濃縮（圖版I： I）。同時(shí)，造孢細(xì)胞的細(xì)胞壁較?。▓D版I： J），內(nèi)含有豐富的細(xì)胞器和脂類物質(zhì)（圖版I： K）。此外，造孢細(xì)胞處于活躍分裂中，可觀察到一些細(xì)胞具有兩個(gè)核仁（圖版I： L）。造孢細(xì)胞發(fā)育成熟形成小孢子母細(xì)胞，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成小孢子。小孢子內(nèi)含有高爾基體、線粒體等細(xì)胞器（圖版I： M）。小孢子液泡化時(shí)期，中央形成大液泡，細(xì)胞核被擠至細(xì)胞邊緣（圖版I： N）。小孢子發(fā)育后期，細(xì)胞壁增厚，壁外形成許多烏氏體（圖版I： O）。

2.3 花粉發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累

杉木花粉發(fā)育過(guò)程中，有明顯的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化規(guī)律。1月底，在花粉細(xì)胞中可觀察到僅有少量的淀粉粒，細(xì)胞核較大（圖版Ⅱ： A， G）。2月上旬，小孢子不斷發(fā)育，細(xì)胞內(nèi)的淀粉粒數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞排列相對(duì)集中（圖版Ⅱ： B， H）。2月中旬，淀粉粒逐漸趨于成熟，體積進(jìn)一步增大，周圍出現(xiàn)液泡化現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖版Ⅱ： C， I）。2月下旬，花粉細(xì)胞內(nèi)的淀粉粒最明顯，細(xì)胞壁增厚（圖版Ⅱ： D， J）。3月上旬，花粉細(xì)胞內(nèi)部分淀粉粒解體，數(shù)目開(kāi)始變少（圖版Ⅱ： E）。3月中下旬，花粉發(fā)育成熟，細(xì)胞內(nèi)的淀粉粒數(shù)目明顯減少（圖版Ⅱ： F）。

2.4成熟花粉的形態(tài)特征

3月中旬，杉木的花粉發(fā)育成熟，扁圓球形的花粉較均勻的散布在小孢子囊中，每個(gè)成熟花粉的直徑約為20 μm （圖版Ⅱ： K）。花粉壁由兩部分組成，分別為處于上部的薄壁區(qū)和處于下部的厚壁區(qū)（圖版Ⅱ： L， M）。薄壁區(qū)中央常有一突起，突起物頂端有一個(gè)小孔，即為萌發(fā)孔，為以后花粉管長(zhǎng)出的區(qū)域（圖版Ⅱ： N， O）。此外，花粉外壁著生了許多小顆粒瘤狀突起，數(shù)目及密集程度不等，為顆粒狀紋飾（圖版Ⅱ： P）。

3討論

造孢細(xì)胞是由孢原細(xì)胞有絲分裂后形成的一類具有分生能力的細(xì)胞。前人研究表明，杉木的造孢組織具有一般分生組織的特征，但核仁呈不規(guī)則分枝狀，細(xì)胞呈多角形；小孢子母細(xì)胞之間具胞間隙，細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁之間有胼胝質(zhì)，核仁呈不規(guī)則塊狀，細(xì)胞呈圓形（蔣恕和黃金生， 1988）。在本研究中，揚(yáng)州地區(qū)杉木花粉的發(fā)育過(guò)程可分為四個(gè)階段，第一階段為10月中旬或者更早，持續(xù)至翌年的2月，此時(shí)是造孢細(xì)胞的形成階段。通過(guò)對(duì)造孢細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)：其數(shù)量多，細(xì)胞呈多邊形，彼此排列緊密，細(xì)胞壁很薄。第二階段為2月上中旬，此時(shí)是造孢細(xì)胞減數(shù)分裂間期，我們觀察到造孢細(xì)胞的細(xì)胞核明顯變大，表明染色體正在核內(nèi)復(fù)制準(zhǔn)備減數(shù)分裂，其中含有豐富的細(xì)胞器。第三階段為2月下旬至3月上旬，造孢細(xì)胞經(jīng)過(guò)冬季休眠發(fā)育成熟，春季解除休眠后進(jìn)入減數(shù)分裂期，形成小孢子。通過(guò)對(duì)造孢細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程的半薄切片觀察，也發(fā)現(xiàn)杉木的四分體排列方式大多為四角型的排列方式，這一結(jié)果與徐進(jìn)等（2007）的研究結(jié)果相似。杉木造孢細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程與如歐洲赤松（Pinus sylvestris）、歐洲云杉（Picea abies）、白云杉（P. glauca）和油杉（Keteleeria fortunei）的造孢細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體的過(guò)程相似（李國(guó)平和黃群策， 2006），都是經(jīng)過(guò)冬季休眠而后在春季解除休眠后進(jìn)行減數(shù)分裂。第四階段為3月中下旬，此階段是杉木花粉發(fā)育成熟的過(guò)程。整個(gè)花粉發(fā)育過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)特別是淀粉的積累呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。淀粉的積累是為花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂提供物質(zhì)基礎(chǔ)，所積累的淀粉在減數(shù)分裂過(guò)程中大部分被花粉粒迅速轉(zhuǎn)化、吸收和利用。

A. 10月中旬，造孢細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核不明顯； B. 11月中旬，造孢細(xì)胞有明顯的細(xì)胞核； C. 1月下旬至2月上旬，呈游離狀的小孢子母細(xì)胞； D. 減數(shù)分裂形成的二分體小孢子； E. 減數(shù)分裂形成未分開(kāi)的四分體小孢子； F. 從四分體釋放后的小孢子呈松散結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核大，質(zhì)濃； GH. 造孢細(xì)胞； I. 造孢細(xì)胞的分枝狀核仁； J. 造孢細(xì)胞間的細(xì)胞壁； K. 造孢細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和脂類物質(zhì)； L. 造孢細(xì)胞正處于活躍的細(xì)胞分裂； M. 小孢子內(nèi)的細(xì)胞器； N. 小孢子液泡化時(shí)期； O. 小孢子發(fā)育后期。 SC. 造孢細(xì)胞； N. 細(xì)胞核； MMC. 小孢子母細(xì)胞； DY. 二分染色體； Te. 四分染色體； Va. 液泡； Ms. 小孢子； Nu. 核仁； W. 細(xì)胞壁； Ve. 小泡； L. 脂類； M. 線粒體； Di. 高爾基體； U. 烏氏體。 比例尺： AF=30 μm； G=50 μm； H=5 μm； IL=2 μm； M=100 nm； N=5 μm； O=0.5 μm。

Plate ⅠAnatomic and ultrastructural observation of microsporogenesis and microspore development in Cunninghamia lanceolata

A. In midOctober， sporogenous cells were arranged closely； B. In midNovember， the sporogenous cell had an obvious nucleolus； C. In late January to early February， microspore mother cells were separated each other； D. Dyad formation after meiosis； E. Tetrad formation after meiosis； F. The microspore released from tetrad with a large nucleus and thick cytoplasm； GH. Sporogenous cell； I. Sporogenous cell with a branching nucleolus； J. Cell wall between sporogenous cells； K. The organelles and lipids in sporogenous cells； L. The active sporogenous cells； M. The organelles in microspore； N. Microspore vacuolization； O. Microspores in late development stage. SC. Sporogenous cell； N. Nucleus； MMC. Microspore mother cell； DY. Dyad； Te. Tetrad； Va. Vacuole； Ms. Microspore； Nu. nucleolus； W. Wall； Ve. Vesicle； L. Lipid； M. Mitochondria； Di. Dictyosome； U. Ubisch body. Scale bars： AF=30 μm； G=50 μm； H=5 μm； IL=2 μm； M=100 nm； N=5 μm； O=0.5 μm.

A. 1月底花粉細(xì)胞； B. 2月上旬花粉細(xì)胞； C. 2月中旬花粉細(xì)胞； D. 2月下旬花粉細(xì)胞； E. 3月上旬花粉細(xì)胞； F. 3月中下旬花粉細(xì)胞； G. 1月底花粉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)； H. 2月上旬花粉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)； I. 2月中旬花粉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)； J. 2月下旬花粉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)； K-M. 成熟的花粉細(xì)胞； N-O. 花粉細(xì)胞萌發(fā)孔； P. 花粉細(xì)胞外壁。 P. 花粉粒； S. 淀粉粒； N. 細(xì)胞核。比例尺： A-F=20 μm； G-J=2 μm； K=100 μm； L=20 μm； M-O=10 μm； P=5 μm。

Plate ⅡPollen development process and ultrastructure of mature pollen in Cunninghamia lanceolata

A. Microspore in late January； B. Microsporein early February； C. Microspore in midFebruary； D. Microspore in late February； E. Microspore in early March； F. Microspore in late March； G. Ultrastructure of microspore in late January； H. Ultrastructure microspore in early February； I. Ultrastructure of microspore in midFebruary； J. Ultrastructure of microspore in late February； KM. Mature microspore； NO. Germinal aperture in microspore； P. Surface of microspore. P. Pollen； S. Starch； N. Nucleus. Scale bars： A-F=20 μm； G-J=2 μm； K=100 μm； L=20 μm； M-O=10 μm； P=5 μm.

傳粉是杉木有性生殖過(guò)程中不可缺少的環(huán)節(jié)（張卓文， 2005），裸子植物通常是風(fēng)媒傳粉植物，其花粉演化成了利于風(fēng)媒傳播的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征（Lu et al， 2011； 張敏等， 2014； 王莉等， 2015）。針葉樹(shù)的花粉直徑在20～100 μm之間，并且花粉的含水量很低，通常在5%～10% （Owens et al， 1998）。賈子瑞等（2014）對(duì)云杉屬20個(gè)種的花粉結(jié)構(gòu)用掃描電鏡進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)花粉均屬于兩氣囊松科花粉，大小為84.33～118.79 μm。張敏等（2014）對(duì)5種裸子植物花粉外壁進(jìn)行了掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)杉木的花粉粒近扁球形，花粉粒體積小，在花粉極面有1個(gè)稍微突出的乳頭狀突起，外壁有疏松的顆粒狀紋飾。本研究中，杉木花粉呈扁圓球形，直徑約20 μm，屬于較小的花粉，表面具顆粒狀紋飾，花粉的輪廓線呈現(xiàn)波浪形，使得花粉的逸散更加容易。雖然不具有氣囊，但其進(jìn)入空氣中之后立即失水，從而減輕了自身重量，有利于空氣中漂浮。另外花粉薄壁區(qū)向下凹陷，使花粉形成空腔，從而增加了其在空氣中的浮力。這些結(jié)果表明，杉木花粉的這些特點(diǎn)體現(xiàn)了其適應(yīng)風(fēng)媒傳粉的特征。

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