張 迪，譚悅浩，劉漪淪，李 燦，劉 蓉，胡 雪，唐 斌，鄧峰美△

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(成都 610500)；3.雅安市名山區(qū)人民醫(yī)院(雅安 625000)

目前,慢性肝臟疾病是危害人類健康的主要因素之一，全球1%～2%的患者有肝臟相關(guān)疾病[1]。據(jù)2022年統(tǒng)計(jì)，我國(guó)患有慢性肝炎、脂肪肝和肝硬化等肝臟疾病的患者超過4.47億人[1]。基于現(xiàn)有人口規(guī)模估計(jì)，未來患有慢性肝臟疾病人數(shù)最多的國(guó)家將是中國(guó)[2]。肝纖維化是由多種慢性致病因子導(dǎo)致的結(jié)締組織異常增生的病理生理過程[3]。有研究[4-5]認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化生成成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致纖維化疤痕生成，從而造成肝損傷。肝纖維化不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，是所有慢性肝病的必經(jīng)過程，可增加肝硬化和肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)[6]。目前肝纖維化對(duì)現(xiàn)有藥物治療的反應(yīng)較差，因此尋找能有效防治肝纖維化的方法，是阻止慢性肝病進(jìn)一步惡化的重要途徑。

研究[5]證實(shí)，肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)是HSCs的活化與增殖，因此抑制HSCs的活化與增殖，在理論上可實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)肝纖維化[7]。研究[8-9]表明，血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)是目前發(fā)現(xiàn)的促HSCs增殖有效的因子，其中PDGF-BB對(duì)HSCs的活化作用最強(qiáng)。40 μg/L濃度下PDGF-BB激活的人HSCs(LX-2)細(xì)胞狀態(tài)最接近人體病理發(fā)展過程[10],故本實(shí)驗(yàn)采用PDGF-BB誘導(dǎo)HSCs活化。配對(duì)盒基因6(Pax6)屬于配對(duì)盒家族，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胰腺等發(fā)育中起重要作用[11]。有研究[12-13]表明，Pax6不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化與周期，推測(cè)Pax6可能與HSCs活化存在關(guān)聯(lián)。因此，本研究采用PDGF-BB誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞活化，慢病毒轉(zhuǎn)染，敲降Pax6，以探究Pax6能否干預(yù)治療肝纖維化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

LX-2購自復(fù)旦IBS細(xì)胞中心，培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)、培養(yǎng)基(10%胎牛血清+雙抗+DMEM-H)內(nèi)培養(yǎng)，間隔1 d進(jìn)行細(xì)胞換液，3～5 d進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗、0.25%胰酶均購自美國(guó)Gibco公司；E-cad及N-cad單克隆抗體購自美國(guó)CST公司；PDGF-BB購自美國(guó)MCE公司；DAPI、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購于北京碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國(guó)康寧公司；敲降慢病毒pGMLVSC5RNAi購于上海Genomeditech公司。

1.3 細(xì)胞株shPax6的構(gòu)建

細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí)，接種于24孔板中培養(yǎng)，等到細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到50%后，按慢病毒說明書加入慢病毒，分為4組：shNC+PBS組、shPax6+PBS組、shNC+PDGF-BB組、shPax6+PDGF-BB組。觀察感染率，待細(xì)胞表達(dá)綠色熒光達(dá)到60%時(shí)，更換新培養(yǎng)基。正常LX-2細(xì)胞接種于24孔板，選擇濃度為1、2、5、100 mg/L的嘌呤霉素處理，觀察統(tǒng)計(jì)細(xì)胞死亡率，選擇72 h下能完全殺死細(xì)胞的濃度(5 mg/L)作為篩選濃度。嘌呤霉素篩選濃度處理已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，顯微鏡下觀察到細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，更換新培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，提取相關(guān)蛋白，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 PDGF-BB處理細(xì)胞及分組

生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，加胰酶消化后，終止消化，將細(xì)胞懸液分為4組：shNC+PBS組、shPax6+PBS組、shNC+PDGF-BB組、shPax6+PDGF-BB組，采用40 μg/L PDGF-BB處理細(xì)胞24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用胰酶消化后，培養(yǎng)基中和消化，新加1 mL培養(yǎng)基重懸，配置成懸浮液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以6×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。細(xì)胞長(zhǎng)滿約85%時(shí)，用無菌尺輔助，槍頭在每孔內(nèi)劃痕，PBS溶液清洗未貼壁以及劃落細(xì)胞，顯微鏡拍照記錄。慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分為4組，40 μg/L PDGF-BB處理24 h后，鏡下觀察劃痕寬度。

1.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中，每孔密度為5×104個(gè)/孔，接種于Transwell小室。細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，40 μg/L PDGF-BB處理24 h，取出小室，棄培養(yǎng)基，加入PBS清洗，固定，結(jié)晶紫染色，PBS清洗。鏡下觀察拍照并記錄。

1.7 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn)

將處理好的4組細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度為90%，適量的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集的蛋白用BCA法測(cè)定。蛋白樣品加入上樣孔，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，濃縮膠90 V持續(xù)20 min，分離膠120 V持續(xù)40 min。電泳完畢，轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h。4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗膜5 min×3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次。曝光，檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.8 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)24孔板，爬片處理后，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗；0.1%的Tritonx-100處理15 min；PBS漂洗，5%山羊血清封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜；PBS漂洗細(xì)胞；熒光二抗Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)，37 ℃下避光孵育1 h，PBS漂洗；DAPI染5 min，PBS漂洗3次；撈出爬片，封片，熒光顯微鏡觀察采集，全程在暗室下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 慢病毒構(gòu)建 shPax6 細(xì)胞

采用慢病毒構(gòu)建LX-2細(xì)胞，設(shè)計(jì)目標(biāo)序列(5′-GCAGACGGCATGTATGATA-3′)插入pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體；同時(shí)，隨機(jī)采用一個(gè)shRNA作為陰性對(duì)照(shNC)；慢病毒感染48 h后，在熒光顯微鏡下，明顯觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，表明慢病毒感染的shNC、shPax6細(xì)胞株為穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(圖1)。

圖1 慢病毒構(gòu)建shPax6細(xì)胞(400×)

2.2 Pax6對(duì)PDGF-BB刺激后HSCs劃痕的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲降Pax6后對(duì)LX-2的遷移能力無影響；加入PDGF-BB后能激活正常LX-2，使其具有趨化性，敲降Pax6后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移能力受到一定抑制(圖2)。

圖2 Pax6對(duì)PDGF-BB刺激后HSCs劃痕的影響

2.3 Pax6對(duì)HSCs遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PDGF-BB激活后的LX-2細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，但是敲降Pax6后能明顯減少有遷移能力的細(xì)胞(表1、圖3)。

表1 shPax6處理下的LX-2各組細(xì)胞遷移數(shù)目

圖3 Pax6對(duì)HSCs遷移的影響(100×)

2.4 Pax6對(duì)活化HSCs相關(guān)蛋白的影響

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物：E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cadherin,N-cad)[14]。結(jié)果顯示，PDGF-BB活化后的細(xì)胞中,E-cad表達(dá)增加，N-cad表達(dá)降低；敲降Pax6后能明顯減少N-cad表達(dá)，增加E-cad表達(dá)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在PDGF-BB激活下，LX-2細(xì)胞Vimentin表達(dá)增加，敲降Pax6能抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的Vimentin表達(dá)(表2～3、圖4～5)。

表2 shPax6處理下的LX-2各組N-cad蛋白表達(dá)情況

表3 shPax6處理下的LX-2各組E-cad蛋白表達(dá)情況

圖4 Pax6對(duì)活化的HSCs免疫熒光檢測(cè)(400×)

圖5 Pax6對(duì)活化的HSCs相關(guān)蛋白的影響

3 討論

肝纖維化是一種常見的慢性肝病[15]，其患病率高,但治療策略有限。目前肝纖維化尚無確切的治療方法，且會(huì)發(fā)展為難治愈的肝硬化，甚至是肝癌。

LX-2是被永生化的人HSCs株，保留了HSCs的大部分特性，因此更接近人體生理?xiàng)l件下的細(xì)胞[16]。Pax6是PAX基因家族中的一個(gè)重要成員，在進(jìn)化過程中高度保守，是關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子[13]。有研究[17]表明，HSCs活化過程常伴有遷移能力增加。因此，抑制遷移能力成為本研究的重點(diǎn)，是有效抑制肝纖維化加重,乃至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要靶點(diǎn)。為此，本研究采用PDGF-BB誘導(dǎo)LX-2活化，活化后其遷移能力增強(qiáng)；但使用慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，敲降Pax6后，發(fā)現(xiàn)LX-2的遷移能力受到一定限制。該結(jié)果表明，Pax6能明顯抑制LX-2遷移能力，進(jìn)而減緩或(和)抑制纖維化進(jìn)程。研究[17]表明，HSCs活化是導(dǎo)致肝纖維化的必要環(huán)節(jié)，其特征為細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，而敲除Pax6能夠抑制HSCs增殖，與本研究結(jié)果一致。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Pax6對(duì)HSCs活化后遷移能力的抑制作用，本研究采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn)及免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果表明活化后的LX-2中E-cad表達(dá)增加，而N-cad表達(dá)降低；敲降Pax6結(jié)果與上述相反,進(jìn)一步表明Pax6可抑制PDGF-BB刺激導(dǎo)致的HSCs遷移能力增強(qiáng)。已知Pax6能調(diào)節(jié)多種生物發(fā)育，包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和分化，并影響細(xì)胞周期[18]。有研究[19]報(bào)道，Hedgehog信號(hào)通路是正常胚胎發(fā)育所必需，且在組織維持、更新和再生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究[20]認(rèn)為，肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，Hedgehog信號(hào)通路的異常激活是導(dǎo)致HSCs激活的關(guān)鍵因素，表明Pax6和Hedgehog之間存在密切關(guān)聯(lián)，可能會(huì)激活Hedgehog信號(hào)通路，使得靜態(tài)HSCs發(fā)生激活和增殖。由此推測(cè)，Pax6能夠活化Hedgehog信號(hào)通路，以介導(dǎo)HSCs的活化與遷移能力。

綜上所述，敲降Pax6能夠抑制HSCs的遷移能力，可能通過激活Hedgehog信號(hào)通路發(fā)揮作用，表明Pax6可能是抑制肝纖維化發(fā)展病變中的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。目前對(duì)于Pax6激活Hedgehog信號(hào)通路的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本研究不足之處在于未進(jìn)行Pax6的過表達(dá)，以及其相關(guān)通路的深入研究，今后研究中需進(jìn)一步探討。