孫秀蘭， 付旭冉， 鮑 琦， 孫嘉笛

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

分子診斷是通過核酸識別和基因編輯對遺傳物質(zhì)的變化做出診斷的技術(shù)[1]，在生物醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)測、食品安全防控等領(lǐng)域起著至關(guān)重要的作用[2]。 目前，最常用的技術(shù)主要有兩大類，第一類是以聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為代表的核酸檢測技術(shù)，其常作為分子診斷的“金標準”，具有高靈敏度和可靠性，但對設(shè)備條件要求高且具有環(huán)境依賴性， 基于PCR 方法建立的恒溫擴增、基因測序、生物芯片等技術(shù)也得到了廣泛應(yīng)用，但這些方法依舊存在技術(shù)復(fù)雜、成本高、特異性差等問題。 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測 定 （enzyme -linked immunosorbent assay，ELISA） 因其快速和高特異性的優(yōu)勢，已經(jīng)成為了蛋白質(zhì)和小分子廣泛應(yīng)用的診斷工具，然而，樣品前處理的復(fù)雜性以及較低的靈敏度限制了其在現(xiàn)場快速精準檢測中的應(yīng)用。

世 界 衛(wèi) 生 組 織 （World Health Organization，WHO）發(fā)布了理想診斷產(chǎn)品的標準ASSURED[3]，即為可負擔（affordable）、靈敏（sentitive）、特異（specific）、用 戶 友 好（user-friendly）、快 速 而 可 靠（rapid and reliable）、免設(shè)備（equipment-free）且可交付給最終用戶（deliverable to end users）[4]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)由于優(yōu)異的生物傳感性能逐漸成為下一代診斷技術(shù)的焦點，有望成為開發(fā)理想診斷產(chǎn)品的方法。 基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的特異性結(jié)合活性和高效反式切割能力，將其與電化學(xué)、熒光傳感技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)成功實現(xiàn)了各種靶標分子的高特異、 高靈敏檢測，檢測對象也已經(jīng)從最初的核酸擴展到金屬離子、蛋白質(zhì)、細菌、小分子等，說明了CRISPR/Cas 系統(tǒng)在檢測領(lǐng)域具有通用性。 本文中作者重點介紹了兩類CRISPR/Cas 系統(tǒng)的特征和機制， 并總結(jié)了基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的各種新型生物傳感器，列舉了針對核酸靶標及蛋白質(zhì)、生物小分子等非核酸靶標構(gòu)建的CRISPR/Cas 新型生物傳感器， 最后對該領(lǐng)域的發(fā)展提出了一些未來展望，以期為進一步開發(fā)新型分子診斷技術(shù)提供參考。

1 基因編輯及CRISPR/Cas 系統(tǒng)概述

基因編輯是分子診斷技術(shù)的基礎(chǔ)，目前基因編輯主要有三大利器：鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）、 轉(zhuǎn) 錄 激 活 樣 效 應(yīng) 因 子 核 酸 酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）與其蛋白質(zhì)（CRISPR associated，Cas）共同組成的CRISPR/Cas 系統(tǒng)[5]。 ZFN 是人工修飾的核酸酶，通常由兩部分組成，一部分是能夠?qū)崿F(xiàn)特異性識別鋅指（zinc-finger，ZF）的DNA 結(jié)合域，一般包含3 個ZF 重復(fù)結(jié)構(gòu)， 每個ZF 能識別3 個堿基；另一部分是包含非特異性限制性核酸內(nèi)切酶的DNA切割區(qū)域，對DNA 進行特異性切割，形成雙鏈斷裂區(qū)，以非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）的方式使目的基因失活，或借助同源重組（homologous recombination，HR）方式黏合斷裂的DNA，從而修復(fù)DNA。 其主要應(yīng)用于科研和醫(yī)療領(lǐng)域， 如治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥和21 三體綜合征等遺傳疾病[6]。

TALEN 最初來源于黃單胞菌， 完整的TALEN由包含定位信號的N 結(jié)構(gòu)域、 可識別特定靶DNA的TALE 重復(fù)序列以及FoKI 核酸內(nèi)切酶組成。天然TALEN 元件識別的序列長度為17~18 bp[7]，主要是通過將TALEN 靶向并結(jié)合DNA 位點， 在FoKI 核酸內(nèi)切酶的作用下實現(xiàn)對特定點位的剪切。 TALEN技術(shù)目前已在全球范圍內(nèi)廣泛用于靶向基因編輯，在醫(yī)療和動植物育種領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。

上述兩種酶的作用機制都是通過對雙鏈DNA（double stranded DNA，dsDNA）進行識別和切割， 激活細胞的非同源末端修復(fù)或者同源重組修復(fù)，依賴于DNA 序列與蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合，而這一步驟非常的費時且煩瑣， 具有很強的設(shè)備依賴性。 CRISPR/Cas 系統(tǒng)通過特異性向?qū)NA（guide RNA，gRNA）指導(dǎo)核酸內(nèi)切酶結(jié)合靶點，從而實現(xiàn)更簡單高效的基因編輯。 不同種類的酶對應(yīng)的靶點類型不同，包括dsDNA、單鏈DNA（single stranded DNA，ssDNA）和RNA 等。與其他兩種基因編輯系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有顯著優(yōu)勢[8]：1）載體構(gòu)建簡單且靶向效率高，只需要構(gòu)建一個具有幾十個堿基的CRISPR sgRNA 即可與DNA 序列進行匹配，從而介導(dǎo)Cas 效應(yīng)子對DNA 序列進行切割；2）CRISPR/Cas 系統(tǒng)可編輯的位點分布頻率較高，易選擇合適的位點進行基因編輯；3）CRISPR/Cas 系統(tǒng)可同時對基因組進行多位點編輯。

簡而言之，TALEN 和ZFN 雖然精確度高和可控性強， 但CRISPR/Cas 系統(tǒng)因操作簡單和功能強大，在分子診斷及生物傳感領(lǐng)域，尤其是現(xiàn)場即時檢測（point-of-care testing，POCT）領(lǐng)域有著更為巨 大的潛力，三者的對比見表1[9]。

表1 3種常見基因編輯技術(shù)的特點及比較Table 1 Characteristics and comparison of three common gene editing technologies

2 CRISPR 系統(tǒng)的分類及特點

CRISPR/Cas 系統(tǒng)依據(jù)Cas 效應(yīng)子的不同可以分為6 大類和32 個亞型。 1 類CRISPR 系統(tǒng)主要通過多個蛋白質(zhì)協(xié)同作用來激活切割活性， 包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型，效率較低且操作復(fù)雜，研究和應(yīng)用較少；2 類CRISPR 系統(tǒng)的Cas 效應(yīng)蛋白通常只有一個蛋白質(zhì)，包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型[10]。 2 類CRISPR系統(tǒng)作用機制主要包括3 個階段：第一個階段是識別可變間隔區(qū)，當識別到外來物質(zhì)時，前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）識別外源DNA 片段并整合到宿主CRISPR 基因的兩個重復(fù)序列之間，作為間隔序列[11]；第二階段是Cas 酶結(jié)合gRNA 形成二元復(fù)合物， 從而將gRNA 中的CRISPR 引導(dǎo)至DNA 分子上的前間隔序列；第三階段是gRNA 與前間隔序列配對形成Cas-gRNAPAM 三元復(fù)合物[12]，特異性識別外源核酸片段，Cas酶被激活， 順式切割外源核酸片段。 由于2 類CRISPR 系統(tǒng)只需要一個效應(yīng)蛋白就可以實現(xiàn)對靶核酸位點的切割，操作簡單、靶向精確，逐漸成為分子診斷領(lǐng)域的熱點， 已發(fā)現(xiàn)的2 類CRISPR 系統(tǒng)效應(yīng)蛋白Cas9、Cas12、Cas13 和Cas14 都有了廣泛應(yīng)用，且具有不同特點，其主要區(qū)別見表2。

表2 2 類CRISPR 系統(tǒng)中主要Cas 效應(yīng)蛋白比較Table 2 Comparison of major Cas effector proteins in class 2 CRISPR system

2.1 Cas9

Cas9 是一種雙gRNA 的II 型Cas 效應(yīng)子，其gRNA 包含一個crRNA 和一個tracrRNA。 crRNA 的3′端與tracrRNA 配對，crRNA 的5′端是游離的靶標序列[13]。 當外源dsDNA 片段進入時，Cas9 結(jié)合tracrRNA 形成復(fù)合體，然后將crRNA 引導(dǎo)至其與靶標序列的前間隔序列結(jié)合，而這個結(jié)合取決于前間隔序列和PAM。 與其他II 型CRISPR 系統(tǒng)不同。Cas9 中有兩部分起識別作用的結(jié)構(gòu)域， 分別是HNH 結(jié)構(gòu)域和RuvC 結(jié)構(gòu)域[14]。以含有PAM 序列的dsDNA 作為催化底物，在gRNA 的指導(dǎo)下，以PAM位點介導(dǎo)， 使得Cas9 的HNH 結(jié)構(gòu)域和RuvC 結(jié)構(gòu)域分別切割靶標鏈和非靶標鏈 （與靶標鏈互補的鏈），從而對目的基因進行編輯[1，15]。

2.2 Cas12

Cas12 和Cas9 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 相 似，Cas9 和Cas12b 的gRNA 包 括crRNA 和tracrRNA[16]，而Cas12a 的gRNA 只包括crRNA， 且只包含RuvC 單個核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。Cas12a 在crRNA 介導(dǎo)下特異性識別靶DNA 序列， 結(jié)合后觸發(fā)Cas12a 的構(gòu)象變化， 導(dǎo)致RuvC 的活性位點暴露， 特異性識別靶標dsDNA， 激活其特異性順式切割活性和非特異性反式切割活性[17]，形成黏性末端并非特異性反式切割 任意ssDNA[18]。 Cas12 中完整的crRNA 長度一般為42~44 nt[16]，一般包含19 nt 的重復(fù)序列和23~25 nt 的間隔區(qū)，其中第19 個U 堿基是嚴格保守的[15]。

2.3 Cas13a

與2 類中的其他Cas 效應(yīng)子相比，Cas13a 對單鏈RNA（single stranded RNA，ssRNA）具有順式和反式切割活性[19]。 Cas13a 含有兩個HEPN 結(jié)構(gòu)域，在crRNA 的引導(dǎo)下，特異性切割帶有互補間隔序列的ssRNA。 當Cas13a 結(jié)合到ssRNA 靶標后，Cas13a 蛋白被激活并轉(zhuǎn)化為非特異性內(nèi)切酶，對附近的非靶標ssRNA 具有反式切割活性。Cas13a 的前間隔序列一般為20 nt[20]，一般沒有特定的切割位點，但顯示出對U 堿基的切割偏好。

2.4 Cas14

相較于其他典型的2 類蛋白，Cas14 效應(yīng)子相對分子質(zhì)量較小， 只有大約400~700 個氨基酸，包含一個與Cas12a 類似的RuvC 區(qū)域[21]，通過與crRNA 和tracrRNA 結(jié)合切割靶標DNA。 在體外檢測中，Cas14 只能識別和切割ssDNA，但其核酸內(nèi)切酶活性的激發(fā)不需要依賴于PAM 序列[22]，此外，Cas14在與靶序列結(jié)合后也可非特異切割任意ssDNA。

Cas 效應(yīng)子可以特異性結(jié)合靶核酸， 以20~30 nt 的gRNA 為“向?qū)д摺?。而PAM 序列識別是Cas 效應(yīng)子檢測dsDNA 目標的先決條件[19，23-24]，與gRNA互補的ssDNA 也可以被Cas12a 切割， 并且以不依賴于PAM 序列的方式激活Cas12a 的反式切割活性[12]。對于ssRNA 檢測，則需要一個3′PFS（非G，相當于PAM 序 列）來 激 活Cas13a 的 切 割 活 性[13，25]。 對 于Cas9、dCas9 和Cas12 來說，gRNA 和靶標核酸的復(fù)合物對PAM 序列附近的10 個堿基對非常敏感[19，24，26-27]，而Cas13a 則對中心堿基對敏感[13，28]。 當堿基對錯配發(fā)生在中心堿基（即為敏感區(qū)域）時，Cas 效應(yīng)子的切割效率會顯著降低，從而可以用于進行單堿基錯配檢測。

3 CRISPR 傳感技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用

在分子診斷方面，Cas 效應(yīng)子的切割活性（包括順式切割和反式切割） 引起了廣泛關(guān)注與研究，尤其是Cas 效應(yīng)子的反式切割活性[12，29-31]。報告分子被Cas 效應(yīng)子切割后， 檢測體系將發(fā)生顯著的信號變化（如電化學(xué)或者光學(xué)信號）。 基于此，CRISPR/Cas系統(tǒng)成功實現(xiàn)了對包括核酸靶標和非核酸靶標在內(nèi)的多種生物分子的檢測。 各種基于CRISPR/Cas生物傳感系統(tǒng)的總結(jié)如圖1 所示。

圖1 基于CRISPR/Cas 的生物傳感系統(tǒng)示意圖Fig. 1 Schematic representation of CRISPR/Cas-based systems for biosensing

3.1 脫氧核糖核酸檢測

單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism，SNP） 與全基因組關(guān)聯(lián)鑒定的復(fù)雜性狀和疾病相關(guān)，是人類基因組中最常見的變異之一[32]。 Li 等建立了基于LbCas12a 的低成本高效檢測系統(tǒng)，被稱為一種單小時低成本多用途高效體系（an onehour low-cost multipurpose highly efficient system，HOLMES）用于檢測人類SNP。 該體系通過PCR 擴增靶DNA，并通過設(shè)計的引物引入PAM 序列，得到的dsDNA 產(chǎn)物會與Cas12a-crRNA 組裝形成三元復(fù)合物， 切割標記有熒光基團和猝滅劑的ssDNA 探針，從而導(dǎo)致熒光基團與猝滅劑分離，并產(chǎn)生顯著增加的熒光信號。 HOLMES 可以快速精準地檢測人類SNP，并高特異性區(qū)分純合和雜合基因型[18]。 Li等為了簡化操作程序，還構(gòu)建了基于AsCas12b 的HOLMESv2 系統(tǒng)， 實現(xiàn)了對SNP 和DNA 甲基化的一步核酸檢測[20]。

人乳頭瘤病毒 （human papillomavirus，HPV）是一種dsDNA 病毒， 與多種惡性腫瘤和癌癥有關(guān)[33]。70%的宮頸癌由HPV16 和HPV 18 引起[34]。 目前市售DNA 試劑盒不能有效地識別所有致癌的人乳頭瘤病毒類型。 Chen 等建立了基于Cas12a 的DNA 內(nèi)切酶靶向CRISPR 反式切割報告方法（DNA endonuclease -targeted CRISPR transreporter，DETECTR），該方法以LbCas12a 為效應(yīng)蛋白，采用RPA 等溫擴增構(gòu)建了通用型檢測平臺。RPA 的優(yōu)勢在于可在37 ℃的條件下快速進行指數(shù)擴增， 減少了對設(shè)備的依賴性。 該檢測平臺可以準確地區(qū)分HPV16 和HPV18，靈敏度可以達到amol/L 級別。 此外該平臺還可以用于檢測環(huán)境DNA，可成功區(qū)分出Salmo salar和Salmo trutta線粒體基因重組質(zhì)粒，基因組檢測的靈敏度為1×10-5ng/μL[12]。 Harrington 等基于Cas14 相關(guān)特性，構(gòu)建了Cas14-DETECTR。 因Cas14 靶向ssDNA，為擴增產(chǎn)生ssDNA，在擴增時，將一條引物進行硫代磷酸酯修飾， 擴增完成后，未被硫代磷酸酯修飾的鏈會被T7 核酸酶降解， 只保留ssDNA 靶序列[30]。 Cas14 具有更高的特異性和更低的脫靶率， 且可以識別沒有PAM 序列的外源DNA，被廣泛應(yīng)用于SNP 檢測，例如，目前Cas14 已被成功用于眼球顏色相關(guān)基因HERC2的SNP 檢測[35]。

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是一種大型有包膜的dsDNA 病毒[36]，會導(dǎo)致非洲豬瘟?。ˋfrican swine fever，ASF）。 ASF 是一種嚴重的出血性急性傳染病， 在家豬和野豬中死亡率接近100%。 Wang 等開發(fā)了一種CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的側(cè)向流動核酸測定法 （CRISPR/Cas9-mediated lateral flow nucleic acid assay，CASLFA）檢測ASFV。 通過重新設(shè)計sgRNA 并引入額外的莖環(huán)，以實現(xiàn)金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）-DNA 探針的結(jié)合。靶DNA 在PCR 或RPA 擴增過程中首先被生物素化并與Cas9-sgRNA 二元復(fù)合物預(yù)孵育。 當檢測液添加到橫向流動試紙條后， 所得產(chǎn)物與AuNPs-DNA 探針雜交，在結(jié)合墊上形成生物素化的擴增子Cas9-sgRNA-AuNPs-DNA 復(fù)合物，該復(fù)合物被預(yù)先包被的鏈霉親和素捕獲。當有ASFV 存在時，金納米粒子便會在檢測線上聚集，該方法在40 min 內(nèi)可以完成檢測， 檢出限為4 copies/mL， 與PCR 檢測ASFV 的準確度相當， 說明CRISPR/Cas9 在現(xiàn)場即時檢測中具有極強的潛力[37]。 為了進一步提高靈敏度，Wang 等研究了一種CRISPR/Cas12a 橫向流動檢測方案。擴增的ASFV 激活Cas12a 以切割標有地高辛和生物素的ssDNA 報告基因。 地高辛標記的ssDNA 可以與樣品墊上的AuNPs-地高辛抗體復(fù)合物結(jié)合， 總檢測時間為60 min， 可檢測低至0.4 copies/mL 的靶DNA[38]。Fu 等將基于Cas12a、RPA 和熒光團猝滅劑（FQ）標記的ssDNA 相結(jié)合，用于快速可視化檢測AFSV。基于Cas12a 設(shè)計的5種crRNAs均顯示出顯著熒光強度的特異性。 在20 min 內(nèi)，2 copies DNA 的初始濃度下，在實驗組和陰性組之間產(chǎn)生顯著差異，該方法具有較高靈敏度且反應(yīng)時間短[39]。

食品安全問題與人們身體健康息息相關(guān)，為有效防控食品安全風(fēng)險，開發(fā)特異、靈敏、快速的食源性致病菌、轉(zhuǎn)基因作物和肉類摻假的核酸檢測技術(shù)勢在必行。Liu 等利用Cas12a 的非特異性ssDNA 切割特性，結(jié)合RPA 設(shè)計了一種食品安全通用檢測平臺，稱為RPA-Cas12a-FS[40]。CaMV35S啟動子廣泛用于轉(zhuǎn)基因作物，如轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆[41]。 目前消費者對轉(zhuǎn)基因生物的接受度仍然很低，一些國家已經(jīng)強制要求商家在轉(zhuǎn)基因成分上標注閾值[42]。Wu 等通過Cas12a 系統(tǒng)和設(shè)計的反應(yīng)容器，建立了一種超快速和方便的可視化檢測CaMV35S啟動子的方法[43]。 通過LAMP 和PCR 分別與Cas12a 結(jié)合，在大豆粉中可檢測到低至0.05%（質(zhì)量分數(shù)）的轉(zhuǎn)基因含量，該方法設(shè)計的反應(yīng)容器有可能成為基于儀器的超高靈敏度方法的補充，并為現(xiàn)場快速檢測提供新的解決方案[43]。

食源性致病菌引起食源性疾病，對人們的身體健康造成了極大威脅。 Zhang 等基于Cas12a 系統(tǒng)，建立了一種新穎、 特異和可視化的核酸檢測方法，在蝦樣品中對副溶血性弧菌的檢出限為1.02×102copies/μL[44]。大腸桿菌可能導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎、血性腹瀉和腎衰竭等[45]，也可以感染水、果汁、牛奶、水果和蔬菜[46]。 Sun 等研究了一種Cas9 觸發(fā)的兩步等溫擴增方法，用于檢測大腸桿菌O157：H7。 該方法使用金屬有機框架UiO66 作為熒光猝滅劑， 在目標dsDNA 存在的情況下，Cas9-sgRNA 復(fù)合物被激活，在dsDNA 的非靶標鏈上引入兩個DNA 斷裂， 觸發(fā)新鏈的合成和延伸， 然后通過RCA 反應(yīng)產(chǎn)生包含靶標的長ssDNA 與DNA 探針雜交， 從而恢復(fù)熒光信號，該方法能夠以高特異性檢測40 CFU/mL 的大腸桿菌O157：H7[47]。 全球抗生素耐藥性以及食品和環(huán)境污染的發(fā)生率持續(xù)增加，特別是由病毒和多重耐藥細菌引起的感染。 多重耐藥金黃色葡萄球菌（multidrug-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）是最重要的多重耐藥病原體之一，對多種抗生素耐藥。 MRSA 感染導(dǎo)致嚴重發(fā)病率和死亡率的風(fēng)險極高[48]。 Guk 等構(gòu)建了一種簡便、靈敏和快速的方法，稱為CRISPR 介導(dǎo)的DNA 熒光原位雜交（FISH），用于檢測MRSA。 該方法中將dCas9-sgRNA 復(fù)合物用作識別元件，SYBR Green I 用作dsDNA 染色的報告分子，sgRNA 的易編程性使得dCas9-sgRNA 能夠選擇性地與MRSA 基因結(jié)合，該方法能夠檢測低至10 CFU/mL 的MRSA 裂解物[49]。Curti 等應(yīng)用Cas12a來識別與碳青霉烯類耐藥基因相對應(yīng)的靶序列，如blaKPC、blaNDM和blaOXA。 通過無標記阻抗分析，檢測時間縮短至60 min 以內(nèi)，且結(jié)果與qPCR 的結(jié)果相當，并通過便攜式試紙條進行了驗證[50]。

3.2 核糖核酸檢測

Cas13a 在相應(yīng)的crRNA 的引導(dǎo)下，可特異性識別RNA，因此多通過Cas13 構(gòu)建生物傳感系統(tǒng)以實現(xiàn)核糖核酸的檢測。有研究者利用Cas13a 的反式切割活性， 構(gòu)建了一種基于Cas13a 的生物傳感平臺，稱為特異性高靈敏度酶報告系統(tǒng) （specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）。通過逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增（reverse transcription recombinase polymerase amplification，RT-RPA）技術(shù)擴增RNA 或RPA 擴增dsDNA， 再經(jīng)過T7 轉(zhuǎn)錄生成RNA 產(chǎn)物，用于激活Cas13a 以產(chǎn)生熒光信號[51]。SHERLOCK 能夠在患者血清或尿液樣本中檢測到寨卡病毒和登革熱病毒，并區(qū)分不同地區(qū)的寨卡病毒。 第1 代SHERLOCK 存在一定的局限性，無法達到便攜、多重檢測和高靈敏度的性能要求[52]。為了解決這些問題， 張鋒所在團隊再次構(gòu)建了SHERLOCKversion2 系統(tǒng)（SHERLOCKv2）[35]，利用不同的Cas 酶表現(xiàn)出不同程度的“偏愛”切割特性，同時將多種不同特異性熒光探針引入檢測系統(tǒng)，進行多種核酸檢測，可在1 份樣本中同時檢測多種病毒[52]。SHERLOCKv2 還利用側(cè)流層析方法實現(xiàn)了快速檢測，當Cas13a 切割RNA 熒光探針時，探針兩端連接的6-羧基熒光素（6-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）與生物素分別結(jié)合到試紙條的不同區(qū)域， 在2 h 內(nèi)即可將結(jié)果直觀地展現(xiàn)在試紙條上，擺脫了檢測體系對熒光讀數(shù)儀器的依賴，該方法可通過凍干試劑在室溫使用，從而實現(xiàn)了現(xiàn)場即時檢測。

微小RNA（microRNAs，miRNA）是具有18~24個核苷酸的小的非編碼RNA[53]，其對于基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)是必需的[54]。 miRNA 被發(fā)現(xiàn)各種疾病的發(fā)生和發(fā)展與其異常表達水平密切相關(guān)，被廣泛作為診斷的生物標志物[55]。 對于miRNA 檢測，最常見的策略是基于Cas13 的生物傳感系統(tǒng)。Shan 等利用CRISPR/LbuCas13a 的高特異性和簡單性直接檢測miRNA，這種一步法在30 min 內(nèi)實現(xiàn)了使檢測限低至4.5 amol/L，線性范圍為10 amol/L~100 fmol/L[56]。更重要的是，單核苷酸的變化，甚至是目標miRNA末端的變化， 都可以通過合理改變crRNA 進行鑒別。此外，這種基于Cas13a-crRNA 的信號放大策略的實際應(yīng)用能力通過在復(fù)雜生物樣品中的miRNA定量檢測得到了證明，其具有良好的可靠性、敏感性和方便快捷等特點， 有望在與miRNA 相關(guān)疾病的早期診斷中發(fā)揮巨大的潛力。 Wang 等利用Cas9開發(fā)了一種用于miRNA 檢測的滾環(huán)DNA 擴增（RCA）-CRISPR-split-HRP（RCH）方法。 靶miRNA可解開啞鈴探針以進行RCA 反應(yīng)， 從而產(chǎn)生重復(fù)的反義序列和規(guī)則的莖環(huán)結(jié)構(gòu)， 其融合的split-HRP-dCas9 復(fù)合物將通過sgRNA 裝配在RCA 產(chǎn)物上。 因此，split-HRP 催化3′3′5′5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）進行氧化以產(chǎn)生顏色變化，該方法可以達到fmol/L 水平的檢測靈敏度和單堿基水平的特異性[57]。 同Cas9 相似，Cas12a 生物傳感系統(tǒng)也需要將miRNA 轉(zhuǎn)化為DNA 底物再進行檢測。Wang 等構(gòu)建了一種新的生物傳感系統(tǒng)，稱為Cas12a 自供電和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄（rolling circle transcription，RCT）-釋放實時crRNA 募集系統(tǒng)（Cas12a-SCR）。 miRNA 作為引物，沿著掛鎖探針啟動RCT，不斷產(chǎn)生具有pre-crRNA重復(fù)的ssRNA。 這些pre-crRNA 與Cas12a 形成Cas12a-crRNA 復(fù)合物， 能以amol/L 水平的靈敏度檢測miRNA-21。Cas12a-SCR 中的pre-crRNA 是實時循環(huán)生成的，不再需要Cas12a-crRNA 的預(yù)組裝，顯著提高了miRNA 檢測的信噪比[58]。

2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV）可在人與人之間廣泛傳播[59-60]，導(dǎo)致新型冠狀病毒肺炎的疫情難以控制，研究人員針對該病毒的快速檢測方法展開了研究[61]。 Ding 等利用Cas12a 結(jié)合RT-RPA 擴增來檢測2019-nCoV（SARS-CoV-2），可在20 min內(nèi)得到單拷貝的靈敏度[62]。為了實現(xiàn)一步到位、簡單、快速地對2019 新型冠狀病毒現(xiàn)場檢測，美國食品藥品監(jiān)督管理局 （Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）設(shè)計并授權(quán)了一種稱為“一鍋法SHERLOCK”（SHERLOCK testing in one pot，STOP） 來 檢 測2019-nCoV，該方法簡稱STOPCovid。 STOPCovid 將LAMP 和 AapCas12b 酶 結(jié) 合， 使 得 兩 步 法SHERLOCK 轉(zhuǎn)化為一步法， 通過LAMP 擴增的2019-nCoV 的RNA，激活A(yù)apCas12b 以切割LAMP生物素標記的ssDNA 報告分子。 STOPCovid 在70 min 和40 min 內(nèi)分別實現(xiàn)比色讀數(shù)和熒光讀數(shù)。STOPCovid 通過鼻咽拭子取樣， 具有97%的準確性和100%的特異性[63]。 為了進一步簡化RNA 提取，Joung 等使用磁珠進行目標富集， 在15 min 內(nèi)即可實現(xiàn)目標物的濃縮，對2019-nCoV（SARS-CoV-2）檢出限為33 copies/mL[64]。

埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）是一種ssRNA病毒，屬于絲狀病毒科[65]，可引起致死率很高的埃博拉病毒?。‥bola virus disease，EVD）[66]，早期診斷和治療對于控制EBOV 至關(guān)重要。 有研究者利用可編程CRISPR 系統(tǒng)， 并應(yīng)用聚丙烯酰胺-DNA 水凝膠設(shè)計微流體紙基分析裝置（μPAD），該裝置包括具有拓撲排列親水區(qū)域的多層結(jié)構(gòu)，特定dsDNA 的存在可激活Cas12a 以切割第二層中的ssDNA 交聯(lián)劑，從而抑制水凝膠的形成。 當緩沖液流經(jīng)整個裝置，在染料存在的情況下可以實現(xiàn)可視化檢測。 同時，通過比色長度測量，5 min 即可定量檢測病毒的濃度，檢出限低至11 amol/L[67]。 此外，該體系使用的無線識別模塊被整合到μPAD 中進行數(shù)據(jù)處理，可實現(xiàn)數(shù)據(jù)的即時反饋， 基于CRISPR/Cas 的μPAD在便攜性、靈敏度和低成本方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。

3.3 蛋白質(zhì)檢測

CRISPR/Cas 系統(tǒng)也用于檢測非核酸目標，如蛋白質(zhì)、酶、金屬離子和小分子物質(zhì)等。 通常CRISPR/Cas 系統(tǒng)被用作信號放大器， 因為非核酸的靶標分子不能被直接識別，通常需要摻入識別元件，如功能性核酸（脫氧核酶和適體）、抗體和細菌變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子。

Dai 等利用蛋白質(zhì)適配體的優(yōu)異識別能力，構(gòu)建了一種基于CRISPR/Cas12a 的電化學(xué)生物傳感器（E-CRISPR）。 蛋白質(zhì)（TGF-β1）適配體復(fù)合物的形成可以阻止Cas12a 切割ssDNA 報告基因， 從而導(dǎo)致電流強度迅速降低，獲得報告信號，檢測限低至0.2 nmol/L[68]。 此外，該測定方法可用于人間充質(zhì)干細胞軟骨分化過程中的TGF-β1 的檢測， 無須復(fù)雜的樣品預(yù)處理。Chen 等開發(fā)了一種CRISPR/Cas13a的酶聯(lián)免疫吸附測定 （Cas13a signal amplification linked immunosorbent assay，CELISA）方法，采用雙抗體來捕獲蛋白質(zhì)。 輸出熒光信號可以通過T7 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄和CRISPR/Cas13a 反式切割活性進行雙倍放大，對白細胞介素6（interleukin，IL-6）和血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 的檢測限分別為2.29 fmol/L 和0.81 fmol/L，檢測靈敏度是傳統(tǒng)ELISA 試劑盒的100 倍[69]。Du 等設(shè)計了一個基于CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)的啞鈴形尿嘧啶-DNA 糖基化酶 （uracil-DNA glycosylase，UDG）作用底物（eSUDG）。 啞鈴形尿嘧啶-DNA 糖基化酶在莖部含有一個尿嘧啶堿基，UDG 可以特異性地去除尿嘧啶堿基以產(chǎn)生無嘧啶位點，該位點可以被Endo.IV 核酸酶進一步切割，這會產(chǎn)生帶有3′OH 末端的游離ssDNA。隨后，在脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase，TdT）的介導(dǎo)下聚合以形成長的PolyT 序列。 由于Cas12a 的crRNA本身具有Poly（A）序列，因此Cas12a 效應(yīng)子可以被激活并對ssDNA 探針進行切割，從而產(chǎn)生熒光信號[70]。所提出的生物傳感器實現(xiàn)了UDG 和Dam MTase 兩種酶活性的檢測， 檢測限分別為5×10-6U/mL 和1×10-4U/mL[70-71]。

3.4 小分子物質(zhì)檢測

開發(fā)特異性、簡單且可推廣的小分子檢測方法對于生物應(yīng)用具有很強的吸引力， 包括環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)學(xué)診斷和法醫(yī)甄別[72-74]。 然而，光譜和質(zhì)譜技術(shù)等“金標準”分析過程耗時，且依賴大型儀器[75]。 Liang等報道了一種CRISPR/Cas12a 和細菌變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（allosteric transcription factor，aTF）介導(dǎo)的小分子檢測器，稱為CaT-SMelor。 該系統(tǒng)需要與dsDNA 探針和Cas12a-crRNA 介導(dǎo)的熒光報告基因結(jié)合的固定化aTF。 當存在靶標分子的情況下，aTF 通過改變其構(gòu)象以將dsDNA 從aTF 結(jié)合結(jié)構(gòu)域解離， 之后dsDNA 與Cas12a 的結(jié)合可以激活Cas12a 非特異性切割ssDNA 報告基因，從而產(chǎn)生恢復(fù)的熒光[72]。 該系統(tǒng)的檢測時間只需要25 min， 且檢測限可達到0.25 nmol/L，滿足實際樣品（166.4~546.7 mmol/L）尿酸分析的要求[76-77]。

對于非核酸物質(zhì)的檢測通常需要利用特殊的適體將非核酸信號轉(zhuǎn)化為核酸信號。Abnous 等基于AuNPs、CRISPR/Cas12a 和RCA 催化活性開發(fā)的比色適體傳感器， 將RCA、CRISPR/Cas12a 和AuNPs組合使得在黃曲霉毒素M1（AFM1）存在時形成大的DNA 結(jié)構(gòu)， 作為顯色劑的4-硝基苯酚無法進入AuNPs 表面；而當AFM1不存在時，4-硝基苯酚可自由到達AuNPs 表面， 此時的AuNPs 表面僅保留非常短的寡核苷酸， 通過4-硝基苯酚對AuNPs 表面的結(jié)構(gòu)和光譜的影響，可靈敏地識別加標牛奶樣品中的AFM1[78]。 Mao 等構(gòu)建了一種上轉(zhuǎn)換納米粒子（up conversion nanoparticles，UCNP）探針來檢測赭曲霉毒素A （OTA）。 基于OTA 適體構(gòu)建毒素的dsDNA 探針， 當存在OTA 時，OTA 適體與OTA 競爭結(jié)合并釋放激活鏈（OTA 適體互補鏈），激活鏈被CRISPR/Cas12a 復(fù)合物識別并激活Cas12a 反式切割ssDNA 的活性。 結(jié)果表明，OTA 濃度與激活鏈和熒光值成正比并用于檢測玉米粉中的OTA[79]。Wu等通過將CRISPR/Cas14a 系統(tǒng)與二維卟啉金屬有機框架納米片 （2D porphyrin metal -organic framework，pMOFs）相結(jié)合，研究了一種新型多功能的Cas14-pMOFs 熒光傳感器用于檢測飲用水和自來水中的微囊藻毒素-LR，在3.5 h 內(nèi)可達到19 pg/mL的檢測靈敏度[80]。

4 展 望

作為基因編輯工具的固有特性，CRISPR 靶向識別活性已經(jīng)實現(xiàn)了廣泛應(yīng)用，包括生物傳感分析和成像分析等，Cas 效應(yīng)子的反式切割活性為超靈敏和便攜式核酸檢測提供了有效的信號輸出系統(tǒng)。CRISPR 檢測方案有幾個共同的特征，如快速、恒溫和便捷， 幾乎所有的CRISPR 系統(tǒng)都可以在短時間內(nèi)（如幾分鐘）在溫和的條件下完成反應(yīng)，這是基于CRISPR 的核酸檢測工具最突出的優(yōu)勢。 總之，從表3 中可以看出， 基于結(jié)合活性和切割活性，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經(jīng)成為多種目標檢測的通用工具， 包括核酸、蛋白質(zhì)、金屬離子、細菌和小分子。 CRISPR/Cas 技術(shù)簡單，具有特異性，靈敏度高，可結(jié)合多種技術(shù)實現(xiàn)目標檢測，其性能等同于或優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法。雖然已經(jīng)取得了顯著的進步，但CRISPR 診斷工具仍然面臨一些挑戰(zhàn)。 目前存在問題及解決措施如下所示：

表3 基于CRISPR/Cas 的生物傳感平臺概述Table 3 Overview of CRISPR/Cas-based biosensing platforms

1）脫靶效應(yīng) 在CRISPR/Cas 系統(tǒng)中，脫靶效應(yīng)一直受到關(guān)注。 在檢測過程中，需要仔細考慮脫靶效應(yīng)可能導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。 多種因素影響脫靶效應(yīng)， 如Cas 效應(yīng)子本身對錯配的容忍度、crRNA 與Cas 效應(yīng)子的結(jié)合沒有發(fā)生在 “敏感區(qū)域”、設(shè)計的向?qū)NA 序列具有兼容性[81]和靶核酸序列與向?qū)NA 序列之間的堿基錯配程度[82]等。對于Cas 效應(yīng)子， 不同Cas 效應(yīng)子的結(jié)構(gòu)特征和來源對脫靶效應(yīng)有顯著影響。 靶標和gRNA 序列之間的堿基錯配也是產(chǎn)生脫靶效應(yīng)的主要原因，完全或部分互補的核酸序列導(dǎo)致了脫靶的可能性，特別是當非種子區(qū)域中存在錯配的堿基對時，致使一些非靶標序列可能激活Cas 效應(yīng)子，產(chǎn)生背景信號，并導(dǎo)致CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)的整體靈敏度相對較低[76，83]。 目前也有一些措施用于減少脫靶效應(yīng)，如通過人工突變構(gòu)建了高保真Cas9 效應(yīng)子[84]、使用Cas9鎳酶和成對的向?qū)NA 來最大化降低脫靶效應(yīng)[85]。此外， 新發(fā)現(xiàn)的Cas 效應(yīng)子也可以提高靶向活性，如Cas12b[86]、Cas13d[87]。機器學(xué)習(xí)在脫靶預(yù)測和優(yōu)化向?qū)NA 設(shè)計方面等具有較大的潛力[88-91]。 通過對CRISPR 數(shù)據(jù)庫的不斷學(xué)習(xí)和訓(xùn)練， 脫靶效應(yīng)將得到精確預(yù)測，該方法可廣泛應(yīng)用于CRISPR/Cas 系統(tǒng)。

2）檢測目標物的有限性 為了準確識別靶序列，大多數(shù)Cas 效應(yīng)子，如Cas9、Cas12a 和Cas13a，需要包含短序列基序（PAM 或PFS）的靶標[25]。 雖然這一要求可以顯著增加CRISPR/Cas 系統(tǒng)的特異性，但也限制了靶標區(qū)域的選擇。 此外，不同類型和來源的Cas 效應(yīng)子具有各自的短序列基序（如LbCas12a的5′TTTN 和SpCas9 的3′NGG）， 這意味著一個特定的靶序列只能被一個Cas 效應(yīng)子識別，并降低了CRISPR/Cas 系統(tǒng)的靈活性。 因此，當CRISPR/Cas 系統(tǒng)直接檢測目標序列時，可選擇的目標序列可能很少，尤其是檢測短序列或區(qū)分單核苷酸多態(tài)性。 此外，為了實現(xiàn)非核酸的檢測，一些功能核酸通常被用來將非核酸信號轉(zhuǎn)換成核酸信號。 但是，對短序列基序的要求可能需要在一定程度上改變功能核酸的結(jié)構(gòu)，并進一步影響它們的特異性或檢測靈敏度。 減少對短序列的依賴性同時保證其特異性，或許是擴大檢測范圍的重點。 最近有研究者構(gòu)建了一個名為SpG 的近似無須PAM 的SpCas9 變體，能夠靶向具有非G 的PAM[92]。 隨著對Cas 效應(yīng)子結(jié)構(gòu)的不斷研究，更多的Cas 效應(yīng)子將滿足對短序列的檢測需求，擴大應(yīng)用范圍。

3）多靶點檢測 雖然通過CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經(jīng)成功開發(fā)了許多用于各種目標物的檢測方法，但從單個樣品中同時檢測多個目標物仍然難以實現(xiàn)[93-94]。 原因主要歸因于一旦Cas 效應(yīng)子和gRNA的復(fù)合物被靶標激活，Cas 效應(yīng)子就表現(xiàn)出非特異性反式切割活性， 所以依靠CRISPR/Cas 系統(tǒng)本身進行多重檢測可能不是一個好的選擇。 相反，通過物理分離將Cas 效應(yīng)子、gRNA 或它們的混合物分離到不同的區(qū)域來進行檢測應(yīng)該是更好的解決方案[95]。 但是，仍有許多工作需要考慮，包括設(shè)計合適的分離結(jié)構(gòu)（如二氧化硅/玻璃微陣列或硝酸纖維素膜）， 建立便攜式讀出技術(shù) （如比色讀數(shù)或熒光讀數(shù)）等。

4）便攜式檢測平臺的設(shè)計 為了使CRISPR/Cas 系統(tǒng)更有吸引力， 更廣泛地應(yīng)用于不同目標物的檢測， 特別是在資源有限的地區(qū)， 利用CRISPR/Cas 系統(tǒng)建立一些簡單、低成本、方便的檢測平臺是非常重要的。 在最近的新型冠狀病毒肺炎疫情中，基于CRISPR 的2019 新型冠狀病毒檢測方法已被廣泛研究，并因其高靈敏度和特異性而在控制新型冠狀病毒肺炎疫情方面發(fā)揮了重要作用[64，96-97]，但這些檢測方法主要限于實驗室使用。 對于通常使用的基于熒光的CRISPR 傳感系統(tǒng)， 構(gòu)建具有高效的光信號收集的小型熒光探測器對于便攜式信號讀取非常有必要。 目前已有研究者設(shè)計了一個口袋大小的熒光檢測器用于讀取熒光信號變化[98]。 在處理大規(guī)模檢測時，樣本之間可能的交叉污染仍然是一個挑戰(zhàn)。 在這種情況下，將CRISPR 檢測與工程、微電子和小型化相結(jié)合可能會提高檢測通量和自動化程度。 微流控平臺可以在幾平方厘米的系統(tǒng)上集成大型測試實驗室的所有功能，包括處理樣品、轉(zhuǎn)移溶液、混合試劑、加熱等。 未來的工作可能需要專注于建立基于CRISPR 的便攜式微流控檢測平臺，攜帶所有必要的試劑，整個操作過程可以自動或半自動完成。 此外，便攜式檢測平臺中的CRISPR/Cas 系統(tǒng)試劑可以凍干或脫水，便于運輸和儲存[31]，據(jù)報道， 脫水的Cas12a 比Cas12a 溶液具有更好的熱穩(wěn)定性[99]。樣本處理對于目標檢測也非常重要，在未來發(fā)展中，將CRISPR 檢測與工程、材料和人工智能相結(jié)合的多學(xué)科聯(lián)合將使CRISPR/Cas 系統(tǒng)更加強大。

5）可穿戴設(shè)備的研究與應(yīng)用 將CRISPR 診斷和檢測系統(tǒng)集成到可穿戴設(shè)備中，可以無創(chuàng)監(jiān)測生理狀況、疾病狀態(tài)，檢測可能接觸到的病原體或毒素。CRISPR/Cas 系統(tǒng)與水凝膠耦合構(gòu)建刺激響應(yīng)材料，可以將生物信息轉(zhuǎn)化為材料性質(zhì)的變化[67]，為智能生物傳感器的發(fā)展提供了一條途徑。 此外，最近有研究者研制了一種帶有凍干CRISPR 傳感器的面罩[100]，是一種可以實現(xiàn)耐儲存、基因可編程和高靈敏度的可穿戴生物傳感器，將這些生物傳感器集成到與無線網(wǎng)絡(luò)兼容的服裝中，并使用定制的智能手機應(yīng)用程序提供實時動態(tài)。

目前，盡管仍有一些挑戰(zhàn)需要克服，但隨著對每個CRISPR/Cas 系統(tǒng)機制的不斷了解和更多Cas效應(yīng)子的發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas 系統(tǒng)將以其獨特的優(yōu)勢在未來的各種目標檢測中變得更加完善。