王翠萍， 晁 琛， 王書(shū)軍

（天津科技大學(xué) 食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

淀粉、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)是食品中富含的大宏量營(yíng)養(yǎng)素，在熱加工過(guò)程中其相互作用形成的復(fù)合物會(huì)顯著影響食品品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-3]。 熱加工過(guò)程中淀粉-脂質(zhì)及淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成能夠延緩淀粉凝膠化和回生進(jìn)程、 提高冷卻期間糊黏度、降低凝膠強(qiáng)度以及淀粉消化性[4-6]。 目前，淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物、 淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物的制備方法，多尺度結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，不同加工因素對(duì)其形成、結(jié)構(gòu)的影響以及潛在的應(yīng)用已被廣泛研究[7-10]。 研究熱加工過(guò)程中淀粉、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用及復(fù)合物的功能性質(zhì)對(duì)于淀粉類食品的結(jié)構(gòu)和功能靶向設(shè)計(jì)以及復(fù)合物在食品中的應(yīng)用具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬技術(shù)是近年來(lái)飛速發(fā)展的一種分子模擬方法，主要依靠牛頓力學(xué)來(lái)模擬分子體系的運(yùn)動(dòng)，在由分子體系不同狀態(tài)構(gòu)成的系統(tǒng)中抽取樣本，從而計(jì)算體系的構(gòu)型積分，并以構(gòu)型積分的結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)一步計(jì)算體系的熱力學(xué)量和其他宏觀性質(zhì)[11]。 作為繼實(shí)驗(yàn)和理論兩種研究方法之后研究分子體系結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的第3種科學(xué)研究方法，分子動(dòng)力學(xué)模擬已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)化工、材料科學(xué)與工程、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[12]。近年來(lái)，分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)也越來(lái)越多地被應(yīng)用到食品科學(xué)領(lǐng)域的研究中，用于分析碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等宏量營(yíng)養(yǎng)素的分子構(gòu)象以及與其他小分子成分的相互作用機(jī)制[13]。 由于分子動(dòng)力學(xué)模擬可以探索實(shí)驗(yàn)層面上無(wú)法實(shí)現(xiàn)的分子特性的表征和分析，直觀地給出分子在模擬過(guò)程中的構(gòu)象變化以及不同組分之間的相互作用力等信息，從而能為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋提供有力的理論支持[14]。

分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)作為研究組分相互作用機(jī)制的一種重要手段，在研究淀粉-脂質(zhì)、淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等方面也有諸多的報(bào)道[15-17]。 為了能夠更好地理解分子動(dòng)力學(xué)模擬在淀粉-脂質(zhì)和淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物形成機(jī)制中的作用，作者在介紹淀粉-脂質(zhì)和淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物形成及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，對(duì)分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)的原理及相關(guān)的操作流程和方法進(jìn)行了介紹，最后詳細(xì)綜述了分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)在探究復(fù)合物形成過(guò)程中組分間相互作用機(jī)制中的應(yīng)用，并對(duì)未來(lái)的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 淀粉-脂質(zhì)及淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成及結(jié)構(gòu)特征

1.1 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的形成及結(jié)構(gòu)

淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物（starch-lipid complex），也稱直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物 （amylose-lipid complex），是直鏈淀粉與脂質(zhì)（脂肪酸、單脂肪酸甘油酯等）在合適的介質(zhì)中通過(guò)疏水相互作用、氫鍵等一系列非共價(jià)相互作用力驅(qū)動(dòng)下自組裝成的具有有序晶體結(jié)構(gòu)的超分子聚合物。 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物既存在于天然淀粉中，也能夠在熱加工過(guò)程中（蒸煮、擠壓等）通過(guò)直鏈淀粉與內(nèi)源性或外源性脂質(zhì)相互作用而形成[18-19]。 相反，由于支鏈淀粉的高分支度及側(cè)鏈間的空間位阻， 其與脂質(zhì)的相互作用遠(yuǎn)不如直鏈淀粉。 盡管有研究表明支鏈淀粉也能與脂質(zhì)發(fā)生一定程度的相互作用，但很難形成具有有序晶體結(jié)構(gòu)的復(fù)合物[20]。淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的形成及結(jié)構(gòu)受多種因素的影響，包括制備方法、淀粉和脂質(zhì)的來(lái)源和性質(zhì)、復(fù)合條件等[21]。

淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的形成過(guò)程主要經(jīng)歷3 個(gè)階段，依次是淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物分子的自組裝、片層晶體的堆疊以及超分子聚集態(tài)的形成[21-22]（見(jiàn)圖1 中A～C）。 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物螺旋結(jié)構(gòu)的形成機(jī)理主要通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬及13C 固體核磁共振等技術(shù)對(duì)分子層面進(jìn)行研究。 直鏈淀粉在水的存在下通過(guò)氫鍵作用發(fā)生卷曲，進(jìn)而形成具有疏水空腔的左手單螺旋構(gòu)象，脂質(zhì)分子的疏水尾部在疏水相互作用驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入螺旋空腔， 而親水尾部則因?yàn)殪o電排斥（脂肪酸羧基）及空間位阻暴露在螺旋外（見(jiàn)圖1 中A）[10，23]。 直鏈淀粉的單螺旋構(gòu)象主要受配體種類決定， 通常直鏈淀粉與一個(gè)脂質(zhì)分子復(fù)合需要18~24 個(gè)葡萄糖單元（3~4 匝），每匝由6 個(gè)葡萄糖殘基構(gòu)成，因此又被稱為V6型直鏈淀粉。 淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物自身穩(wěn)定的單螺旋構(gòu)象主要由多種非共價(jià)相互作用力共同支撐[22]。 一方面直鏈淀粉每匝單螺旋之間存在分子內(nèi)氫鍵（H—O…H—O）以及范德華力，較大程度上維持了其單螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[24-25]；另一方面， 直鏈淀粉中葡萄糖單元上的氫原子（主要是C3和C5） 能夠與脂質(zhì)亞甲基上的氫原子之間產(chǎn)生范德華力，從而起到穩(wěn)定復(fù)合物結(jié)構(gòu)的關(guān) 鍵 作 用[24，26]。

淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物分子能夠通過(guò)分子間氫鍵及范德華力相互作用緊密堆積，排列為具有一定熱力學(xué)穩(wěn)定性的片層晶體結(jié)構(gòu)，其中復(fù)合物單螺旋垂直于晶層表面（見(jiàn)圖1 中B）[27-29]。 通過(guò)小角X 射線散射和透射電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物為結(jié)晶片層和無(wú)定型片層交替排列的半結(jié)晶結(jié)構(gòu)， 其晶層厚度、排列方式和緊密程度受淀粉和脂質(zhì)種類、加工方式及參數(shù)等多種因素的影響[30-32]。 示差掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）作為一種靈敏的熱分析技術(shù)，是表征復(fù)合物數(shù)量（熱轉(zhuǎn)變焓值）和熱穩(wěn)定性（熱轉(zhuǎn)變溫度）最常用的方法之一。根據(jù)復(fù)合物的熱力學(xué)穩(wěn)定性可將其分為Ⅰa型（熔融溫度85 ℃）和Ⅰb型（熔融溫度95 ℃）復(fù)合物、Ⅱa型（熔融溫度約115 ℃）和Ⅱb型復(fù)合物（熔融溫度＞121 ℃），較長(zhǎng)的脂質(zhì)烷基鏈、較高的復(fù)合溫度以及較低的成核速率有助于具有更高熱穩(wěn)定性Ⅱ型復(fù)合物的形成[30，33]。

在適當(dāng)條件下，復(fù)合物的結(jié)晶層狀結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步自組裝為更大尺寸的微米級(jí)聚合體結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖1 中C），具有獨(dú)特的V 型X 射線晶體衍射峰（7.6°、12.8°和19.8°）[34]。雖然已有許多研究報(bào)道過(guò)淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物聚集體的微觀結(jié)構(gòu)， 但由于制備方法、原料以及分析方法等不同， 導(dǎo)致結(jié)果存在很大的差異。 在使用天然淀粉制備復(fù)合物時(shí)，由于復(fù)合物樣品中存在大量的支鏈淀粉，因此很難通過(guò)電鏡清晰地觀察出直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的微觀結(jié)構(gòu)。 已有的研究報(bào)道中，淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物呈現(xiàn)出片狀晶體、球狀晶體、多孔塊狀等不同的形貌[35-38]。 相比之下，通過(guò)純直鏈淀粉制備的復(fù)合物能夠更加清楚地反映復(fù)合物的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)，二甲基亞砜/水法制備的直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物具有球形微觀形貌， 而酸堿法則更傾向于形成片狀或棒狀結(jié)構(gòu)[39]。

圖1 直鏈淀粉-脂質(zhì)及直鏈淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成機(jī)理及多尺度結(jié)構(gòu)模型Fig. 1 Formation mechanism and multiscale structural model of amylose-lipid and amylose-lipid-protein complexes

1.2 淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成及結(jié)構(gòu)

當(dāng)?shù)矸叟c脂質(zhì)和蛋白質(zhì)共同存在時(shí)，在適當(dāng)?shù)臈l件下三者會(huì)發(fā)生更加復(fù)雜的相互作用并形成具有一定有序結(jié)構(gòu)的三元復(fù)合物。 江南大學(xué)張根義教授和美國(guó)普渡大學(xué)的Hamaker 教授最早在研究高粱粉功能性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)， 其在快速黏度分析儀（rapid visco analyzer，RVA）中加熱后的冷卻階段形成黏度峰， 且脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的去除均導(dǎo)致該黏度峰消失，因此提出熱加工過(guò)程中淀粉與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)可能存在三元相互作用[40]。 在利用高效體積排阻色譜（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）分析直鏈淀粉-脂肪酸-β-乳球蛋白三元復(fù)合物樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，代表直鏈淀粉的洗脫峰消失的同時(shí)， 在蛋白質(zhì)和支鏈淀粉洗脫峰之間出現(xiàn)一個(gè)新峰，推測(cè)是形成了淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物[41]。隨后，通過(guò)構(gòu)建淀粉、脂肪酸和乳清蛋白/β-乳球蛋白相互作用模型并研究其在加工過(guò)程中的黏度變化， 發(fā)現(xiàn)在RVA 模擬熱加工過(guò)程中向淀粉中添加長(zhǎng)鏈脂肪酸（棕櫚酸、硬脂酸、油酸等）對(duì)其冷卻期間糊黏度的影響十分有限，而向上述體系中加入β-乳球蛋白后能夠很大程度地提高淀粉在冷卻期間的糊黏度并產(chǎn)生黏度[21，42-43]。對(duì)于原本與淀粉有較好復(fù)合能力并導(dǎo)致淀粉冷卻黏度峰形成的具有較短碳鏈的脂肪酸（月桂酸、癸酸等）來(lái)說(shuō)，β-乳球蛋白的添加則能夠進(jìn)一步提高其冷卻黏度。除β-乳球蛋白外，向淀粉和月桂酸體系中加入明膠也能顯著提高其冷卻期糊黏度[44]。 這些研究進(jìn)一步證實(shí)了熱加工過(guò)程中淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物的形成[7]。

近年來(lái)，隨著實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的創(chuàng)新、表征和分析方法的進(jìn)步以及組分相互作用理論的完善，在熱加工過(guò)程中淀粉與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制方面有了一定的突破。 淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物的形成過(guò)程如圖1 中D～F 所示，先是淀粉與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)通過(guò)疏水相互作用和氫鍵等作用力形成淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物（見(jiàn)圖1 中D），隨后復(fù)合物分子通過(guò)排列形成晶體片層（見(jiàn)圖1 中E），進(jìn)一步堆積形成具有一定形狀的聚集體結(jié)構(gòu) （見(jiàn)圖1 中F）。 作者所在課題組前期構(gòu)建了多種熱加工過(guò)程組分相互作用高仿真模型，通過(guò)DSC、激光共聚焦拉曼光譜、X 射線衍射等技術(shù)系統(tǒng)表征了淀粉-脂肪酸-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物的多尺度結(jié)構(gòu)及形成規(guī)律，發(fā)現(xiàn)三元復(fù)合物具有比淀粉-脂質(zhì)二元復(fù)合物更加有序的V 型晶體結(jié)構(gòu)和更高的短程分子有序性，并利用直鏈淀粉制備三元復(fù)合物發(fā)現(xiàn)其為尺寸均一、表面光滑的納米球形顆粒（見(jiàn)圖1 中F）[7，21]。 與脂肪酸三元體系不同，雖然DSC 和拉曼光譜結(jié)果表明淀粉-單甘酯-β-乳球蛋白三元體系中復(fù)合物有序結(jié)構(gòu)的數(shù)量大于對(duì)應(yīng)的二元體系，但β-乳球蛋白的添加會(huì)導(dǎo)致淀粉-單甘酯體系糊黏度降低， 并且二元及三元體系中復(fù)合物的熱力學(xué)性質(zhì)相同，所以β-乳球蛋白雖然能夠促進(jìn)淀粉-單甘酯復(fù)合物的形成，但不能形成三元復(fù)合物[45]。 張根義教授利用HPSEC 研究直鏈淀粉與單甘酯和β-乳球蛋白相互作用的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果，因此推測(cè)脂肪酸羧基在三元復(fù)合物的形成中發(fā)揮著重要作用。

熱加工過(guò)程中三元復(fù)合物的形成主要受組分性質(zhì)和加工條件的影響。 脂肪酸鏈長(zhǎng)度的降低和不飽和度的升高更有利于三元復(fù)合物的形成，但復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性逐漸降低，且脂肪酸結(jié)構(gòu)對(duì)三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)有序性的影響小于對(duì)二元復(fù)合物的影響，這主要是由于蛋白質(zhì)的乳化特性能夠很大程度上促進(jìn)淀粉與脂質(zhì)的復(fù)合[46]。相比于明膠，具有更低等電點(diǎn)和更好乳化性的乳清分離蛋白能夠與淀粉和脂質(zhì)形成更有序的復(fù)合物[44]。 淀粉來(lái)源也是影響三元復(fù)合物形成的重要因素之一，小麥淀粉比馬鈴薯淀粉更易與脂質(zhì)和β-乳球蛋白形成三元復(fù)合物，且首次發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)玉米淀粉在β-乳球蛋白存在下能夠與脂肪酸形成有序的V 型復(fù)合物[47]。 另外，加工條件（時(shí)間、溫度、pH 等）也會(huì)影響三元復(fù)合物的形成。加熱溫度的升高及降溫速率的加快能夠更好地促進(jìn)淀粉-月桂酸-β-乳球蛋白復(fù)合物的形成[48]。 體系pH 升高能夠促進(jìn)淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物的形成， 這是由于較高的pH 能夠促進(jìn)脂肪酸溶解以及加熱期間更多直鏈淀粉的瀝出[8，49]。 盡管關(guān)于淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物形成及結(jié)構(gòu)有序性的研究已被大量報(bào)道，但大多局限于利用淀粉作為材料制備復(fù)合物，淀粉中大量支鏈淀粉的存在很大程度上阻礙了對(duì)于淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物多尺度結(jié)構(gòu)以及功能性質(zhì)的認(rèn)識(shí)。

2 分子動(dòng)力學(xué)模擬概述

2.1 簡(jiǎn)介

分子動(dòng)力學(xué)模擬是一種計(jì)算機(jī)模擬方法，能使分子和原子在已知的物理定律（例如量子力學(xué)和經(jīng)典力學(xué)理論）下作用一段時(shí)間，然后通過(guò)求解運(yùn)動(dòng)方程進(jìn)而得到分子和原子在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化和動(dòng)力學(xué)特征[50]。 分子動(dòng)力學(xué)模擬可以為傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法提供補(bǔ)充信息，能夠從分子結(jié)構(gòu)和它們之間的微觀相互作用方面將分子組裝過(guò)程可視化并系統(tǒng)解析其結(jié)構(gòu)和特性[51-52]。 分子動(dòng)力學(xué)模擬在19 世紀(jì)60 年代末被首次提出用于研究硬球的相互作用[53-54］，之后Stillinger 和Rahman 在1974 年完成了對(duì)真實(shí)體系（液態(tài)水）的分子動(dòng)力學(xué)模擬[55]。 分子動(dòng)力學(xué)模擬充當(dāng)了理論與實(shí)驗(yàn)之間的橋梁，既可以通過(guò)使用相同模型進(jìn)行模擬來(lái)檢驗(yàn)理論，也可以通過(guò)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較來(lái)測(cè)試模型。

目前分子動(dòng)力學(xué)模擬應(yīng)用最為廣泛的幾款軟件 主 要 有 GROMACS、LAMMPS、AMBER 等 。LAMMPS 可以支持包括氣態(tài)、液態(tài)、固態(tài)等各種系統(tǒng)下的百萬(wàn)級(jí)原子分子體系，主要被應(yīng)用于各種有機(jī)以及金屬材料方面的模擬。 GROMACS 是由格羅寧根大學(xué)開(kāi)發(fā)的用于研究生物分子體系的分子動(dòng)力學(xué)程序包， 其可以模擬溶液或晶體中的任意分子，并進(jìn)行分子能量的最小化、構(gòu)象分析等。AMBER是由加利福尼亞大學(xué)的Coleman 教授為生物分子開(kāi)發(fā)的一系列建模和分子力學(xué)、 動(dòng)力學(xué)模擬程序，其具有與GROMACS 十分相似的功能，其具體操作流程已在后文中詳細(xì)描述。

雖然分子或原子的運(yùn)動(dòng)軌跡是基于牛頓第二運(yùn)動(dòng)定律計(jì)算的，但分子的多樣性和唯一性要求在模擬過(guò)程中應(yīng)用特定的力場(chǎng)[56]。 分子的力場(chǎng)通常包含涉及的原子、殘基及其類型、質(zhì)量、范德華半徑、部分電荷、角度、二面角、力常數(shù)，以及共價(jià)和非共價(jià)相互作用中涉及的共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵等信息[57-59]。根據(jù)選用的力場(chǎng)將分子的物理信息轉(zhuǎn)化為指導(dǎo)動(dòng)力學(xué)計(jì)算的約束勢(shì)，因此進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬可以準(zhǔn)確高效地獲得分子構(gòu)象變化及相互作用等信息。目前使用的主流生物分子力場(chǎng)包括AMBER、GROMOS、CHARMM、OPLS 等[60]。

此外，為了更加準(zhǔn)確地模擬實(shí)驗(yàn)條件，通常需要對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行溶劑化。 常用的水分子模型包括SPC、TIP3P、TIP4P、TIP5P 以 及De Leeuw 和Parker的兩個(gè)極化水模型[61]。 在模擬生物大分子在水溶液中的行為時(shí)，通常需要應(yīng)用周期性邊界條件以消除邊界效應(yīng)[62]。在周期性邊界條件中，生物分子及其周圍的水分子被三維復(fù)制，形成無(wú)限晶格，即模擬盒子的精確圖像在各個(gè)方向上相互堆疊，因此溶液沒(méi)有表面，這有助于消除表面效應(yīng)，如果水分子離開(kāi)模擬盒子，其凈效應(yīng)相當(dāng)于相同分子的副本進(jìn)入盒子，這樣水分子就永遠(yuǎn)不會(huì)逃逸[63]。 同時(shí)，模擬所使用的周期盒子也具有不同的形狀， 包括立方體、菱形、十二面體和截?cái)喟嗣骟w，這些幾何形狀顯著減少了系統(tǒng)中所需的溶劑原子數(shù)量，從而節(jié)省了計(jì)算時(shí)間[64-65]。

2.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬操作步驟

使用AMBER 進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬通常包含準(zhǔn)備分子結(jié)構(gòu)、設(shè)置模擬參數(shù)、能量最小化、平衡體系能量、 模擬成品和分析數(shù)據(jù)等步驟， 下面以應(yīng)用AMBER 研究淀粉、 脂肪酸和蛋白質(zhì)相互作用為例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

2.2.1準(zhǔn)備 在進(jìn)行模擬之前，首先需要獲得進(jìn)行模擬的生物分子的PDB（protein data bank）結(jié)構(gòu)文件，包含生物分子（直鏈淀粉、脂肪酸、蛋白質(zhì)）之間相互作用的所有信息，如原子類型、原子序號(hào)、殘基類型、殘基序號(hào)、原子三維坐標(biāo)以及所帶電荷等[66]。 蛋白質(zhì)的PDB 結(jié)構(gòu)文件通常從PDB 網(wǎng)站（https：//www.pdbus.org/）直接下載；直鏈淀粉的結(jié)構(gòu)可以從Glycam 網(wǎng)站（https：//glycam.org/）繪制，然后保存成PDB 文件； 而脂肪酸的PDB 結(jié)構(gòu)文件可以使用ChemDraw 軟件先畫出其結(jié)構(gòu)式， 然后用Chem3D 軟件將其保存為PDB 文件。

2.2.2設(shè)置 由于PDB 文件中可能包含與分子動(dòng)力學(xué)模擬設(shè)置過(guò)程無(wú)關(guān)的信息，因此在模擬之前可以使用pdb4amber 工具來(lái)徹底檢查用于模擬的PDB 文件是否有任何錯(cuò)誤，包括添加氫原子和去除多余的原子信息[67]。蛋白質(zhì)和直鏈淀粉可以直接加載對(duì)應(yīng)力場(chǎng)，而脂肪酸需要使用小分子力場(chǎng)GAFF（general AMBER force field）進(jìn)行設(shè)置[68]。 然后使用tleap 程序?qū)⒛M體系采用合適的水模型放置于周期性盒子中進(jìn)行溶劑化以模擬生理環(huán)境，同時(shí)需要中和體系中的電荷，保證在模擬時(shí)體系呈電中性[69]，最后保存復(fù)合物的參數(shù)文件（complex.prmtop）和坐標(biāo)文件（complex.inpcrd）用于后續(xù)模擬。

2.2.3模擬 模擬需要應(yīng)用周期性邊界條件以消除邊界效應(yīng)，使模擬體系更接近真實(shí)的實(shí)驗(yàn)條件[62]。在模擬之前需要使用等溫等壓系綜（constant number of particles，pressure and temperature，NPT）和 等 溫 等 容 系 綜 （constant number of particles，volume and temperature，NVT）運(yùn)行能量最小化使系統(tǒng)具有最低的自由能，從而保持在最穩(wěn)定的狀態(tài)[60]。然后可根據(jù)所需要的模擬時(shí)長(zhǎng)和精確度進(jìn)行成品模擬。

2.2.4分析 模擬過(guò)程的第一個(gè)分析步驟通常是將模擬軌跡可視化，可以使用VMD（visual molecular dynamics） 軟件直觀地展現(xiàn)出分子構(gòu)象隨模擬時(shí)間的變化[70]。另外，使用CPPTRAJ[71]和MMPBSA[72]等程序來(lái)分析均方根偏差 （root mean square deviation，RMSD）、均方根波動(dòng)（root mean square fluctuation，RMSF）、回轉(zhuǎn)半徑（gyration radius，Rg）、溶劑可及表面積（solvent accessible surface area，SASA）以及不同殘基及原子之間的距離隨時(shí)間的變化等，從而獲得直鏈淀粉、脂肪酸和蛋白質(zhì)在模擬過(guò)程中的構(gòu)象變化及相互作用等信息[52，73]。

2.3 用于分析淀粉、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)相互作用的一些常用模擬參數(shù)

2.3.1Snapshots Snapshots 是指直鏈淀粉、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在模擬過(guò)程中其構(gòu)象隨時(shí)間變化的截圖，通過(guò)觀察三者在特定模擬時(shí)間段的構(gòu)象，可以直觀地看出三者在模擬過(guò)程中的構(gòu)象變化及相互作用[74]。運(yùn)用對(duì)象為直鏈淀粉、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)。

2.3.2RMSD、RMSF 和RgRMSD 可以測(cè)量任意時(shí)間段的分子構(gòu)象與初始構(gòu)象的平均原子位移，RMSF 可以測(cè)量直鏈淀粉、 脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子的每個(gè)殘基隨模擬時(shí)間的波動(dòng)情況，Rg可以測(cè)量任意時(shí)間段的分子構(gòu)象與初始分布的差異性[75]。 這3 個(gè)指標(biāo)都可以表征直鏈淀粉、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在模擬過(guò)程中的波動(dòng)情況，其值越小說(shuō)明分子越穩(wěn)定，進(jìn)而可以推測(cè)出分子間可能存在某種相互作用[76-77]。 運(yùn)用對(duì)象為直鏈淀粉、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)。

2.3.3原子間距離 End-to-End 距離是指位于線性分子首尾兩端的殘基質(zhì)心之間的距離，可以用于表征直鏈淀粉和脂質(zhì)分子在模擬過(guò)程中的彎曲、折疊和纏繞[78]，運(yùn)用對(duì)象為直鏈淀粉和脂質(zhì)。 O3n—C（5n+3）距離是指直鏈淀粉的n號(hào)殘基的O3原子與n+3 號(hào)殘基的C5原子之間的距離， 由于直鏈淀粉多以V6型螺旋結(jié)構(gòu)存在，因此可以采用這個(gè)指標(biāo)來(lái)表征直鏈淀粉螺旋內(nèi)徑隨模擬時(shí)間的變化，進(jìn)而可以推斷出脂質(zhì)與直鏈淀粉的結(jié)合位置[52]。 運(yùn)用對(duì)象為直鏈淀粉。

2.3.4SASA SASA 可用于測(cè)量模擬體系中溶劑可接近的分子表面積，其值的變化趨勢(shì)可以反映直鏈淀粉、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子在模擬過(guò)程中親水性和疏水性的變化，結(jié)合分子本身結(jié)構(gòu)特性可以說(shuō)明分子在模擬過(guò)程中的構(gòu)象變化以及形成復(fù)合物后溶解度的差異性[73]。運(yùn)用對(duì)象為直鏈淀粉、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)。

2.3.5氫鍵 氫鍵分為分子間氫鍵和分子內(nèi)氫鍵。分子間氫鍵是一種非共價(jià)相互作用力， 對(duì)直鏈淀粉、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)相互作用有重要貢獻(xiàn)；而分子內(nèi)氫鍵存在于直鏈淀粉分子內(nèi)，常用來(lái)表征直鏈淀粉螺旋結(jié)構(gòu)的解旋程度[17，79]。 在MD 模擬中判斷氫鍵形成的標(biāo)準(zhǔn)是氫供體與氫受體之間的距離小于0.35 nm，夾角小于30°[80]。 運(yùn)用對(duì)象為直鏈淀粉、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)。

2.3.6結(jié)合自由能 通過(guò)計(jì)算不同分子間結(jié)合自由能可以衡量分子間結(jié)合親和力以及不同種類的非共價(jià)相互作用（靜電相互作用和范德華力）對(duì)復(fù)合物形成的貢獻(xiàn)。 自由能越大說(shuō)明分子間的相互作用越強(qiáng)，形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)就越穩(wěn)定[81]。運(yùn)用對(duì)象為直鏈淀粉、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)。

2.3.7主成分分析 進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）用于可視化是否存在一種或多種參數(shù)組合， 可以區(qū)分在模擬中的直鏈淀粉、直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物和直鏈淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物的不同構(gòu)象。 通過(guò)比較不同模擬體系在由PCA 構(gòu)造的協(xié)方差矩陣中兩個(gè)主特征向量定義的平面上投影，可以獲得模擬體系的構(gòu)象變化以及體系的穩(wěn)定狀態(tài)等信息[52，82]。 運(yùn)用對(duì)象為直鏈淀粉、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)。

2.3.8褶皺分布 褶皺分布（puckering distribution）描述了葡萄糖環(huán)原子與平均平面的偏差。 用角度θ表示六環(huán)原子（O5、C1、C2、C3、C4、C5）所在的葡萄糖環(huán)偏離參考平面的角度，當(dāng)θ 在0°~60°時(shí)，直鏈淀粉分子顯示椅式4C1構(gòu)象， 這是能量水平最低即最穩(wěn)定的狀態(tài)；而當(dāng)θ 大于120°時(shí)直鏈淀粉分子將顯示為較不穩(wěn)定的椅式1C4構(gòu)象[52]。通過(guò)觀察不同模擬體系中直鏈淀粉分子構(gòu)象隨模擬時(shí)間的變化，從而獲得形成復(fù)合物后對(duì)直鏈淀粉構(gòu)象的影響。 運(yùn)用對(duì)象為直鏈淀粉。

2.3.9二面角分析 直鏈淀粉α-1，4-糖苷鍵的二面角（dihedral angles）分別由原子O5-C1-O4′-C4′（φ）和C1-O4′-C4′-C3′（ψ）定義，二面角的變化有助于可視化淀粉螺旋結(jié)構(gòu)的變化，反映了葡萄糖殘基的取向和螺旋曲率的程度[83]。 如果二面角的值分布在較窄的范圍內(nèi)， 說(shuō)明分子的構(gòu)象處于較穩(wěn)定的狀態(tài)，反之則說(shuō)明分子構(gòu)象波動(dòng)較大[17，84]。 運(yùn)用對(duì)象為直鏈淀粉。

2.3.10蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu) 通過(guò)分析二級(jí)結(jié)構(gòu)隨模擬時(shí)間的波動(dòng)可以獲得復(fù)合過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化信息， 從而明晰在形成蛋白質(zhì)-脂質(zhì)二元復(fù)合物以及直鏈淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響[85-86]。 運(yùn)用對(duì)象為蛋白質(zhì)。

3 分子動(dòng)力學(xué)模擬在直鏈淀粉-脂質(zhì)和直鏈淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用

3.1 直鏈淀粉-脂質(zhì)相互作用

使用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究直鏈淀粉與脂肪酸的相互作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，直鏈淀粉能與脂肪酸結(jié)合形成V6型單螺旋構(gòu)象的復(fù)合物，其中脂肪酸的疏水烷基鏈位于直鏈淀粉螺旋空腔內(nèi)，而親水的羧基暴露于直鏈淀粉螺旋外部。 此外，直鏈淀粉與脂肪酸的絡(luò)合部分可以在模擬過(guò)程中保持完整的螺旋結(jié)構(gòu)，而其兩端未與脂肪酸結(jié)合的部分則逐漸解螺旋（見(jiàn)圖2（a））[82，87]，充分印證了之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[39，88]。相比于未復(fù)合直鏈淀粉，與脂肪酸復(fù)合后的直鏈淀粉在模擬過(guò)程中的RMSD 和Rg值較低， 說(shuō)明具有更加穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖2（b）和（c））[52]。 通過(guò)研究直鏈淀粉與亞油酸在不同溫度下相互作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，與300 K 相比，直鏈淀粉在373 K 下具有更大的疏水面積，說(shuō)明在373 K 時(shí)直鏈淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)具有更好的穩(wěn)定性，因此，高溫（373 K）比低溫（300 K）更利于直鏈淀粉和脂肪酸的復(fù)合[73]。使用O3n—C（5n+3）距離隨時(shí)間的改變來(lái)表示直鏈淀粉螺旋內(nèi)徑的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)復(fù)合物結(jié)構(gòu)達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，直鏈淀粉中間部分的螺旋半徑較小， 而兩端的螺旋半徑較大，并且直鏈淀粉中間部分殘基的RMSF 值也較?。ㄒ?jiàn)圖2（d）和圖2（e）），因此可以推斷出脂肪酸結(jié)合在直鏈淀粉的中間部分[52]。 通過(guò)觀察直鏈淀粉和脂肪酸的End-to-End 距離隨模擬時(shí)間的變化發(fā)現(xiàn)， 直鏈淀粉在模擬過(guò)程中會(huì)發(fā)生彎曲和纏繞，而脂肪酸的結(jié)構(gòu)未發(fā)生顯著變化（見(jiàn)圖2（f））[52]。

圖2 表征分子構(gòu)象變化及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的常用參數(shù)Fig. 2 Common parameters used to characterize conformational changes and structural stability of molecules

Feng 等的研究表明，在直鏈淀粉與亞油酸復(fù)合時(shí)，其體系中的氫鍵數(shù)量逐漸增多，說(shuō)明直鏈淀粉與脂肪酸結(jié)合后其構(gòu)象變得更加緊密（見(jiàn)圖3（a））[82]，但也有研究表明在復(fù)合過(guò)程中直鏈淀粉與油酸的分子間氫鍵數(shù)量逐漸減少（見(jiàn)圖3（b）），這可能與所使用的脂肪酸類型以及模擬條件不同有關(guān)[79]。 疏水相互作用是促進(jìn)直鏈淀粉與脂肪酸復(fù)合的主要驅(qū)動(dòng)力，而范德華力對(duì)于維持直鏈淀粉-脂肪酸二元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要貢獻(xiàn)（見(jiàn)圖3（c））[79，89-90]。直鏈淀粉與脂肪酸結(jié)合形成V6型螺旋復(fù)合物，因此用直鏈淀粉鏈的n號(hào)殘基到n+6 號(hào)殘基質(zhì)心之間的距離來(lái)表示螺旋結(jié)構(gòu)的緊密程度， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)量的該螺旋間距為（8.05±0.10）×10-10m[91-92]，而分子模擬結(jié)果顯示隨著測(cè)量部位不同該間距的大小也不同，其中在直鏈淀粉未與脂肪酸復(fù)合的部分此間距會(huì)明顯大于實(shí)驗(yàn)值，說(shuō)明未與脂肪酸結(jié)合的直鏈淀粉的部分螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，螺旋間距變大[16-17]。 通過(guò)分析直鏈淀粉與脂肪酸復(fù)合過(guò)程中二面角（φ，ψ）的分布，發(fā)現(xiàn)這些角度主要位于φ=115°、ψ=105°附近的區(qū)域（見(jiàn)圖3（d））[93]，這與先前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[94]。

圖3 表征分子間相互作用力及淀粉螺旋結(jié)構(gòu)變化的常用參數(shù)Fig. 3 Common parameters to characterize intermolecular interactions and changes in starch helical structure

此外，通過(guò)分子模擬還發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉和單甘酯也能形成V 型單螺旋復(fù)合物，并且脂質(zhì)的疏水性烷基鏈結(jié)合在直鏈淀粉的螺旋空腔內(nèi)，其親水性部分位于螺旋外側(cè)[95-96]。 而對(duì)于甘油二酯，直鏈淀粉也能與其中一條疏水烷基鏈復(fù)合形成淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物[81，97]。 此外，雖然分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明直鏈淀粉與甘油三酯也能在沒(méi)有水分子參與的情況下形成淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物[98]，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甘油二酯和甘油三酯很難與淀粉在水熱加工過(guò)程中形成有序的復(fù)合物[18，99]，這是由于甘油二酯和甘油三酯過(guò)高的疏水性，導(dǎo)致其很難在水體系中與淀粉發(fā)生相互作用。 可見(jiàn)，分子動(dòng)力學(xué)模擬雖然可以在理論上檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的可行性，但模擬結(jié)果的可信度還需要實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支撐，采用實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論計(jì)算相互印證是研究分子間相互作用機(jī)制的有效方法。

3.2 直鏈淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

目前已有大量研究表明直鏈淀粉與蛋白質(zhì)和脂肪酸在特定條件下可以自組裝形成三元復(fù)合物[21，45，47]。為了更加深入地了解三元復(fù)合物的形成機(jī)制， 馮濤等采用分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)直鏈淀粉、β-乳球蛋白肽段、α-亞油酸在373 K 溫度下的復(fù)合過(guò)程進(jìn)行研究。 結(jié)果表明當(dāng)模擬達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，α-亞油酸可作為橋梁將直鏈淀粉和β-乳球蛋白肽段連接起來(lái)形成三元復(fù)合物，并通過(guò)計(jì)算分子間相互距離發(fā)現(xiàn)α-亞油酸對(duì)于三元復(fù)合物的形成具有重要貢獻(xiàn)。通過(guò)研究直鏈淀粉-α-亞油酸-β-乳球蛋白三元復(fù)合物的SASA 在模擬過(guò)程中的變化， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)三元復(fù)合物的親水面積大于疏水面積，說(shuō)明該三元復(fù)合物具有良好的溶解性，并且通過(guò)能量計(jì)算證實(shí)該過(guò)程是一個(gè)熱力學(xué)自發(fā)的過(guò)程[100]。 此外，Bhopatkar 等使用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究了直鏈淀粉、 亞油酸、1-萘酚和β-乳球蛋白肽段（帶正電）之間的相互作用，結(jié)果表明脂肪酸作為橋梁將直鏈淀粉和β-乳球蛋白肽段連接形成三元復(fù)合物，并且1-萘酚也包含在直鏈淀粉螺旋空腔內(nèi)，位于脂肪酸疏水尾附近[15]。通過(guò)計(jì)算直鏈淀粉、β-乳球蛋白、 脂肪酸和1-萘酚之間的相互距離以定量分析其構(gòu)象轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步明確了脂肪酸和直鏈淀粉在維持體系穩(wěn)定中具有關(guān)鍵作用，并且在復(fù)合物自組裝過(guò)程中，體系的自由能逐漸降低，說(shuō)明三元復(fù)合物的形成為自組裝過(guò)程[15]。然而，由于上述研究均利用帶正電肽段代替β-乳球蛋白且未計(jì)算組分間相互作用力，有關(guān)三者之間的相互作用機(jī)制仍缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論計(jì)算的相互印證，需要今后進(jìn)一步研究。

4 展 望

在當(dāng)今計(jì)算機(jī)應(yīng)用技術(shù)高速發(fā)展的年代，分子動(dòng)力學(xué)模擬已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物和化工等領(lǐng)域的前沿研究中， 但其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用還相對(duì)較少。 食品中淀粉與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等組分的相互作用十分復(fù)雜且研究手段有限，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算的研究方式是實(shí)現(xiàn)分子運(yùn)動(dòng)可視化、 組分相互作用數(shù)據(jù)化的一種行之有效的方法。分子動(dòng)力學(xué)模擬可以提供一個(gè)完全不同的視角來(lái)觀察原子、 分子和微粒在特定溶劑中的運(yùn)動(dòng)軌跡，并且提供有關(guān)目標(biāo)分子的以下信息：分子在模擬過(guò)程中的構(gòu)象變化， 模擬前后分子的均方根偏差、均方根波動(dòng)和回轉(zhuǎn)半徑，分子與其他組分的親水和疏水表面積，分子運(yùn)動(dòng)的非共價(jià)驅(qū)動(dòng)力，以及分子與其他組分的氫鍵數(shù)量和結(jié)合自由能等。 盡管如此，由于分子動(dòng)力學(xué)模擬需要已知分子的明確結(jié)構(gòu)，這很大程度上限制了無(wú)法獲得準(zhǔn)確分子結(jié)構(gòu)組分（部分非淀粉多糖及蛋白質(zhì)等）的相關(guān)研究，并且模擬中使用的有限時(shí)間和空間尺度阻礙了模擬與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的定量比較。 盡管如此，隨著各基礎(chǔ)學(xué)科與技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，分子動(dòng)力學(xué)模擬將成為研究淀粉與其他食品組分相互作用以及新型食品研發(fā)的強(qiáng)有力的工具，并對(duì)基于分子動(dòng)力學(xué)模擬更加深入地理解不同食品組分相互作用以及調(diào)控復(fù)合物的形成和自組裝結(jié)構(gòu)方面具有重要意義。