孫紅霞，劉春旭，安學俊，崔光華，王靖宇，佟雙喜，楊曉秋

(1.北華大學藥學院，吉林 吉林 132013，2.北華大學附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)位列第一的惡性腫瘤，膀胱癌在臨床上的治療方法主要為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(TUR-Bt)，但術后5 a復發(fā)率高達60%～70%，且有25%左右的患者復發(fā)后會進展為浸潤性膀胱癌[1].臨床上為防止患者術后復發(fā)，常輔以膀胱灌注(免疫抑制劑或化療藥物)，但均存在不同程度的全身或局部毒副反應，且仍有20%左右的患者雖經(jīng)膀胱灌注治療但腫瘤仍會復發(fā)[2].而根治性膀胱切除術加尿流改道術后仍有高達50%的患者可能出現(xiàn)轉移，且對轉移性膀胱癌患者采用的化療方案療效不能持久，患者5 a生存率僅為20%～40%[2].鑒于目前膀胱癌灌注藥物及化療藥物療效的不穩(wěn)定性及其顯著的毒副作用，尋找安全有效、來源于天然產(chǎn)物的抗腫瘤藥物是近年來腫瘤藥物研發(fā)的熱點.

五味子為木蘭科多年生落葉木質藤本植物，五味子多糖(SCP)是從五味子中提取出來的，具有多種生物學活性，如保肝、增強免疫、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等作用，特別是其抗腫瘤活性日益受到廣泛關注[3-5]，SCP抗腫瘤作用已經(jīng)明確，但有關其抑制膀胱癌細胞生長抑制的作用迄今國內外尚未見報道.鑒于課題組前期篩選五味子功效成分時觀察到其可能對膀胱癌有一定抑制作用，但未做深入研究，因此，本實驗擬觀察SCP對體外生長膀胱癌細胞的抑制作用并探討其作用機制，為五味子深度開發(fā)利用和探索研制抗膀胱癌作用的中藥新藥提供藥理學基礎.

1 材料與方法

1.1 材 料

北五味子多糖由吉林省五味子開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化科學研究中心制備.首先通過超臨界CO2流體萃取，將北五味子中水溶性成分和脂溶性成分分離，然后利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動、高加速度、強烈空化效應及攪拌作用，經(jīng)超聲波預處理40 min后進行浸提，再經(jīng)酶法與三氯乙酸結合脫蛋白得北五味子粗多糖，提取率為77.6%，純度可達50%以上.

人膀胱癌T24細胞株(上?；鄯f生物科技有限公司)；細胞培養(yǎng)基DMEM(批號：12100046，Gibco公司，美國)；胎牛血清(批號：SH30396.03，Hyclone公司，美國)；胰蛋白酶 (批號：25200-056，Gibco公司，美國)；MTT(批號：11465007001，Sigma公司，日本)；Annexin V-FITC流式細胞凋亡檢測試劑盒(批號：E-CK-A111，武漢伊萊瑞特生物科技公司)；β-actin(批號：sc-69879)、PTEN(批號：sc-377573)、PI3K、p-PI3K(批號：sc-365290)、AKt、 p-Akt(批號：sc-5298)、一抗鼠抗人、二抗兔抗鼠(Santa cruz公司，美國)；CO2培養(yǎng)箱(BBD6220，Hyclone公司，美國)；酶標儀(MR-96A，武漢邁瑞科技有限公司)；高速冷凍離心機(Avanti J-15R，貝克曼公司，美國)；凝膠成像系統(tǒng)(Invitrogen，E-Gel Imager，Hyclone公司，美國)；奧林巴斯倒置顯微鏡(CKX53，奧林巴斯株式會社，日本)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人膀胱癌細胞T24細胞株在含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃，含5%CO2細胞的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).實驗使用細胞均為接種后24 h處于對數(shù)生長期的細胞.

1.2.2 分組及處理

實驗設空白對照組和SCP 50、100、200 μg/mL 3個不同劑量實驗組.取對數(shù)生長期的T24細胞3×104/mL 接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24 h后加入不同濃度的 SCP(50、100、200 μg/mL)，作用48 h后胰酶消化、離心，將細胞懸浮于磷酸鹽緩沖液(PBS)中備用.

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期膀胱癌T24細胞，用胰酶消化后，以4×103/孔接種于96孔板培養(yǎng)24 h，然后加入SCP，使其終濃度分別為0(即未加藥)、50、100、200 μg/mL；培養(yǎng)0(即細胞接種于96孔板24 h后)、48 h后，再加入5 mg/mL MTT，20 μL/孔，孵育4 h，棄上清液；加DMSO 150 μL/孔，避光振蕩10 min.同時設空白對照組，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測吸光度OD490nm值.細胞增殖抑制率計算：抑制率(IR)=[1-(A值(實驗孔)-A值(空白孔))/(A值(對照孔)-A值(空白孔)]×100%.

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期

SCP作用24 h后，收集空白對照組和SCP不同濃度組的T24細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液.用PBS洗滌1次，細胞沉淀用預冷的70%乙醇在-20 ℃固定過夜.取固定后的細胞用PBS洗滌2次并懸浮之，加入終濃度為50 mg/L的核糖核酸酶A(RNaseA)36 ℃水浴30 min，再加入800 μL碘化丙啶(PI)染液至終濃度為50 mg/L，搖勻后4 ℃避光靜置30 min，200目尼龍網(wǎng)過濾.應用流式細胞儀分析細胞周期及凋亡情況，低于G1期DNA含量細胞為凋亡細胞.

1.2.5 Hoechst 33258熒光染色法檢測細胞凋亡

將對數(shù)生長期T24細胞按3×105/孔接種于6孔板，細胞貼壁融合60%～70%后，吸出孔內培養(yǎng)基，加入SCP使其終濃度分別為0(空白對照組)、50、100、200 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸盡孔內培養(yǎng)基，加入0.5 mL固定液，10 min后去固定液，用PBS洗2次，加入0.5 mL Hoechst33258染色液，避光染色5 min.在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)(激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm)，了解細胞凋亡情況.實驗重復3次.

1.2.6 Western blot法檢測蛋白表達

收集不用濃度SCP處理48 h的T24細胞，提取蛋白質后BCA法測定其總蛋白含量.分別取各組40 μg總蛋白上樣，隨后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入適量稀釋的Bax、 Bcl-2 (1∶1 000)、 cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、β-actin (1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶500)，室溫下?lián)u蕩孵育2 h；采用ECL發(fā)光液發(fā)光，與發(fā)光試劑充分反應后，應用分析軟件分析各顯影條帶的A值(p-Akt與Akt的比值)、各目標蛋白與β-actin的比值.

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 MTT法檢測SCP對細胞增殖及抑制率的影響

不同劑量的SCP均能抑制T24細胞的OD值，SCP干預后，OD值呈下降趨勢，SCP作用后OD值與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05及P<0.01).SCP各組抑制率分別為18.69%、39.13%及64.76%.見表1.

表1 MTT法檢測SCP對細胞增殖抑制率的影響

2.2 倒置顯微鏡下觀察T24細胞形態(tài)學的改變

使用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化.在用SCP 50、100、200 μg/mL處理前列腺癌T24細胞24 h后，直接置于顯微鏡下觀察，可見處理后的細胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)細胞凋亡形態(tài)學變化，細胞體積縮小、皺縮、變圓，與周圍細胞脫離，死細胞呈明亮的圓形，與對照組比較，活細胞數(shù)量明顯減少.見圖1.

圖1 SCP對膀胱癌細胞形態(tài)學影響(×40)

2.3 FCM檢測SCP對細胞周期分布(凋亡峰)的影響

前列腺癌T24細胞經(jīng)SCP不同濃度處理48 h后，流式細胞儀檢測可見在G1期峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，說明不同濃度SCP能引起T24細胞的凋亡，SCP 3個組的細胞凋亡率分別為28.73%、38.35%和60.52%，與對照組比較有顯著性差異(P<0.05).同時，SCP高劑量組影響了T24細胞的生長周期分布，G0/G1期的T24細胞最高達80.71%，與對照組比較，T24細胞G0/Gl期的細胞數(shù)目明顯增多，而S期和G2/M期細胞數(shù)目減少，即SCP使T24細胞生長阻滯在G0/G1期，從而誘導了細胞凋亡的發(fā)生.見圖2.

組別與對照組比較，*.P<0.05，#. P<0.01.

2.4 Hoechst 33258熒光法檢測SCP對膀胱癌細胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下可以清晰地觀察到細胞核內染色質的固縮與斷裂，呈現(xiàn)出典型的細胞凋亡學形態(tài)特征.圖3 b、d可看到固縮的細胞核，細胞核皺縮是細胞凋亡最明顯的特征之一，SCP能夠使T24細胞核嚴重皺縮，誘導細胞凋亡.與對照組比較，SCP干預組隨劑量增加出現(xiàn)凋亡數(shù)目的細胞明顯增多(P<0.05).見圖3.

圖3 Hoechst 33258 熒光染色觀察SCP對T24細胞凋亡的影響(×400)

2.5 WB檢測SCP對凋亡相關蛋白cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

與空白對照組比較，各給藥干預組Bcl-2蛋白表達逐漸減少，Bax蛋白表達逐漸增加(P<0.05)；與空白對照組比較，cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的蛋白表達量隨SCP劑量增加而逐漸增加(P<0.05)，呈現(xiàn)明顯的量效關系.見圖4(a、b、c、d、e).

圖4 Western blot檢測SCP對Bcl-2，Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達的影響

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占我國泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率的第一位，2014年統(tǒng)計顯示其發(fā)病率為6.61/10萬，在惡性腫瘤發(fā)病率中占第九位[6-8].流行病學研究[9]表明：化學致癌物是膀胱癌的致病元兇，如存在于煙草中的芳香胺類化合物等，與膀胱癌相關的癌基因有H-Ras、BcL-2、c-erbB-2等[9]，與膀胱癌細胞凋亡相關的基因主要有死亡受體基因家族、Bcl-2基因家族、Caspase基因家族.Bcl-2基因家族包括Bad、Bcl-2、Bcl-xL等基因，有些基因具有抗凋亡作用，如Bcl-2等；有的基因具有促凋亡作用，如Bax等.Bax與Bcl-2的功能相反，Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白.Bcl-2蛋白和Bax蛋白能夠形成二聚體，這兩種蛋白的比值調控細胞的凋亡，Bcl-2/Bax比值增高時抑制細胞凋亡，比值降低時促進細胞凋亡.

細胞凋亡途徑有線粒體途徑、內質網(wǎng)途徑、死亡受體途徑.Caspase家族(cysteinyl aspeantate-specific proteinase family)是指一群含有半胱氨酸的蛋白酶，在凋亡執(zhí)行過程中起著至關重要的作用，而且細胞凋亡的過程實際上是Caspase被活化并發(fā)生凋亡蛋白酶的級聯(lián)反應[10].半胱氨酸蛋白酶家族有14 名成員，Caspase-3、9均參與細胞凋亡，Caspase介導凋亡的第一個途徑是線粒體途徑，涉及Caspase-9，這一過程需要Caspase-9的激活[11-13]，Caspase-3處于細胞凋亡的下游，是凋亡級聯(lián)反應中最關鍵的酶之一，是凋亡的終結執(zhí)行者之一.Caspase-3 是參與細胞凋亡的關鍵蛋白酶，通常情況下，Caspase-3以沒有活性的酶原形式(pro-Caspase-3)存在于胞漿中.凋亡發(fā)生時，pro-Caspase-3被激活，表現(xiàn)為激活型，即cleaved Caspase-3.有研究[14-15]表明，Caspase-3與Bcl-2相互作用促進了細胞凋亡的發(fā)生.

五味子是我國常用的一種傳統(tǒng)中藥，有多種生物學活性.SCP是五味子作用的主要成分之一，主要組成成分有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖等.本研究結果發(fā)現(xiàn)：SCP能夠抑制膀胱癌細胞的體外增殖作用，3種劑量的SCP干預作用結果與對照組比較，差異明顯(P<0.05).形態(tài)學觀察結果顯示：SCP作用后，能明顯地誘導T24細胞出現(xiàn)凋亡，出現(xiàn)細胞核固縮或胞質化，與后面的促凋亡結果相一致.細胞周期是反映細胞增殖是否活躍的指標，SCP作用后，可使細胞S期比例減少，G0/G1期比例增加，G2/M相應下降，說明SCP能夠阻止T24細胞的增殖作用.SCP誘導凋亡峰值出現(xiàn)，凋亡率明顯升高，與對照組比較有明顯差異(P<0.05).凋亡是由一系列凋亡基因參與的過程，其中Bax、Bcl-2在凋亡過程中起重要作用，Bax、Bcl-2相互作用改變線粒體膜通透性，促進CytC釋放，激活Caspase-9啟動凋亡進程，進而激活Caspase-3[16-17].本研究結果顯示：SCP能夠明顯升高促凋亡基因Bax蛋白表達，降低Bcl-2抗凋亡基因蛋白表達，使二者比例發(fā)生改變，起到促進凋亡作用.作為Caspase-9的下游基因，與Caspase-3共同參與了線粒體的凋亡途徑，即Caspase-9激活了Caspase-3，再通過ROCK啟動細胞凋亡的發(fā)生.作為Akt的下游信號，Caspase-9、Caspase-3在凋亡中的作用十分關鍵，SCP能夠促進二者的激活，使cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3的蛋白表達增加，最終啟動T24細胞凋亡.

因此，SCP能夠抑制T24細胞增殖，促進其凋亡，其作用可能與激活促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9啟動凋亡過程，促進下游基因bcl-2活化，SCP通過調控細胞周期、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡作用最終抑制癌癥的發(fā)生.