王 博，陳美瓊，郭翔宇，楊詩琪，曹權(quán)富，張俊杰，朱 梅

(北華大學(xué)理學(xué)院，吉林 吉林 132013)

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)為馬齒莧科一年生草本植物，又稱長壽菜、長命菜，在我國分布廣泛[1-2]，是國家衛(wèi)健委劃定的藥食兩用植物之一[3].馬齒莧含有多糖、生物堿、多酚、黃酮等活性物質(zhì)，具有提高免疫功能、抗感染、抗氧化等生物學(xué)活性[4].多糖是馬齒莧的主要活性成分之一，具有抗氧化、增強免疫功能、保護(hù)神經(jīng)、抗菌、抗病毒、抗糖尿病和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[2，5-6].抗氧化活性是馬齒莧多糖的主要功能活性，李慧如[7]采用水提醇沉法提取的馬齒莧多糖POP和楊電增等[8]采用雙酶法提取的馬齒莧多糖具有清除體外自由基的作用，牛廣財?shù)萚9]發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖能有效抑制衰老小鼠血清及肝、腦中的SOD活力的下降，還能顯著降低衰老小鼠體內(nèi)MDA的含量.近年來，植物多糖的抗氧化活性備受關(guān)注，許多植物多糖已成為天然抗氧化劑的來源.

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

供試材料馬齒莧全草(PortulacaoleraceaL.，采自吉林省樺甸市，經(jīng)北華大學(xué)理學(xué)院侯宇老師鑒定為馬齒莧)；黑腹果蠅(Drosophila melanogaster，北華大學(xué)理學(xué)院遺傳實驗室).

95%乙醇、無水乙醇、乙醚、甲醇、苯酚、Tris、濃硫酸(國產(chǎn)分析純)；標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖(北京索萊寶科技有限公司)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，上海麥克林生化科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所).

1.2 主要儀器

GalanzWD900B微波爐(順德格蘭仕電器廠有限公司)；DL-5-B 型離心機(上海嘉鵬科技有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；XS-10 500 g多功能粉碎機(上海兆申科技有限公司)；722S可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限公司)；冷凍干燥機(上海皓莊儀器有限公司).

2 試驗方法

2.1 馬齒莧多糖的提取

將新鮮馬齒莧洗凈、干燥、粉碎、過篩，準(zhǔn)確稱取馬齒莧粉末10 g，按一定液料比浸泡12 h，沸水提取2 h，微波處理，4 ℃條件下4倍體積95%乙醇沉淀12 h，4 000 r/min離心10 min，沉淀依次用無水乙醇、乙醚反復(fù)洗滌，50 ℃真空干燥箱烘干至質(zhì)量恒定，sevage法脫蛋白[12]，得馬齒莧粗多糖.

2.2 馬齒莧多糖含量測定及提取率計算

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：采用苯酚-硫酸法[13]，以葡萄糖濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、以測定波長490 nm處的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]，得回歸方程y=0.012 7x+0.003 4，R2=0.996 3.依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測樣品吸光值，計算多糖含量及提取率：

多糖質(zhì)量=多糖含量×多糖溶液體積，多糖提取率=多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%.

2.3 馬齒莧多糖提取單因素試驗

按照2.1的方法提取馬齒莧多糖，固定反應(yīng)條件為液料比V(mL)∶m(g)=30∶1、微波時間15 min、微波功率540 W，測定不同粉碎度(20、40、60、80、100目)對多糖提取率的影響；固定反應(yīng)條件為粉碎度60目、微波時間15 min、微波功率540 W，測定不同液料比(V(mL)∶m(g)=10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)對多糖提取率的影響；固定反應(yīng)條件為粉碎度60目、液料比V(mL)∶m(g)=30∶1、微波功率540 W，測定不同微波時間(5、10、15、20、25 min)對多糖提取率的影響；固定反應(yīng)條件為粉碎度60目、液料比V(mL)∶m(g)=30∶1、微波時間15 min，測定不同微波功率(180、360、540、720、900 W)對多糖提取率的影響.

2.4 馬齒莧多糖提取條件響應(yīng)面試驗設(shè)計

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以提取率為響應(yīng)值，粉碎度、液料比和微波時間為自變量，根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken模型[15]，進(jìn)行三因素三水平試驗設(shè)計(見表1)，優(yōu)化微波輔助水提醇沉馬齒莧多糖提取工藝.

表1 響應(yīng)面Box-Behnken試驗因素與水平

2.5 馬齒莧多糖體外抗氧化活性測定

2.5.1 DPPH·清除活性的測定

參照IMJONGJAIRAK S等[16]的方法，向1 mL濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL的多糖樣液中加入1 mL濃度為 0.2 μmoL/L的DPPH甲醇溶液，混勻，陰涼避光處放置30 min，在517 nm波長處分別測定吸光值(A樣品).同樣方法，向以上各濃度1 mL多糖樣液中加入1 mL無水乙醇，混勻后在517 nm波長處分別測定吸光值(A對照)；取1 mL DPPH和1 mL超純水混勻，在517 nm波長處測定吸光值A(chǔ)空白.計算馬齒莧多糖對DPPH·的清除率：DPPH·清除率=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100%.

2.5.2 ·OH清除活性的測定

參照張曉艷等[1]和聶爍等[17]的方法，向1 mL濃度為1、2、3、4、5 mg/mL的多糖樣液中加入1 mL 濃度為8 mmol/L的FeSO4溶液、水楊酸-50%乙醇溶液和H2O2，充分混勻后靜置1 h，在510 nm波長處分別測定吸光值(A樣品).同樣方法，用超純水替代多糖樣液測定空白組吸光值(A空白)；用50%乙醇溶液替代水楊酸和50%乙醇的混合溶液測定對照組吸光值(A對照).計算馬齒莧多糖對·OH的清除率：·OH清除率=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100%.

2.6 馬齒莧多糖在果蠅體內(nèi)抗氧化活性測定

2.6.1 果蠅體內(nèi)SOD活力的測定

參照文獻(xiàn)[19]的方法(略有改動)，取250只剛羽化的雄果蠅隨機分為5組，在相同體積培養(yǎng)基(多糖濃度分別為0、5、10、15、20 mg/mL)中培養(yǎng)7 d后，加生理鹽水研磨成濃度為1∶20 mg/μL的果蠅勻漿，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明測定SOD活力.

2.6.2 果蠅體內(nèi)MDA含量的測定

試驗步驟同2.6.1，按照試劑盒說明測定MDA含量.

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 粉碎度對馬齒莧多糖提取率的影響

試驗2.3結(jié)果顯示：粉碎度為20目時，馬齒莧多糖提取率最低，60目時馬齒莧多糖提取率最高，為6.08%，80目時提取率呈下降趨勢.這說明可能在一定范圍內(nèi)馬齒莧多糖的溶解性隨粉碎度的增加而增強，但超過一定范圍會使多糖附著在樣品顆粒表面，降低其溶解性[20].因此，選粉碎度為60目為最適條件.見圖1.

圖1 粉碎度對馬齒莧多糖提取率的影響

3.1.2 液料比對馬齒莧多糖提取率的影響

試驗2.3結(jié)果顯示：當(dāng)液料比為V(mL)∶m(g)=30∶1 時，馬齒莧多糖提取率最高，為6.22%；當(dāng)液料比V(mL)∶m(g)=40∶1、50∶1時，馬齒莧多糖提取率逐漸下降.這可能是由于液料比過低時多糖不能充分溶出，而液料比過高時多糖會溶解，不易沉淀析出[21].故最佳液料比選為V(mL)∶m(g)=30∶1.見圖2.

圖2 液料比對馬齒莧多糖提取率的影響

3.1.3 微波時間對馬齒莧多糖提取率的影響

試驗2.3結(jié)果顯示：當(dāng)微波時間為10 min時，馬齒莧多糖提取率最高，為6.13%，微波時間15、20、25 min時提取率逐漸下降.推測微波時間過長，增加了熱量積累，引發(fā)多糖降解，從而導(dǎo)致提取率降低[22]，因此，微波時間在10 min時最為合適.見圖3.

圖3 微波時間對馬齒莧多糖提取率的影響

3.1.4 微波功率對馬齒莧多糖提取率的影響

試驗2.3結(jié)果顯示：當(dāng)微波功率為180 W時，馬齒莧多糖提取率最低，當(dāng)微波功率為360、540 W時，提取率呈上升趨勢，分別為6.05%和6.09%，當(dāng)微波功率為720 W和900 W時提取率逐漸下降，推測微波功率高于一定范圍時引起多糖部分降解，提取率下降.考慮到能量損耗，微波功率360 W為最佳提取功率.見圖4.

圖4 微波功率對馬齒莧多糖提取率的影響

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

3.2.1 模型的建立及方差分析

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以馬齒莧多糖提取率為響應(yīng)值(y)，粉碎度(A)、料液比(B)和微波時間(C)為主要因素，設(shè)計三因素三水平共17組試驗，根據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)(見表2)利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程：y=6.21+0.432 5A+0.121 3B+0.381 3C-0.120 0AB-0.395 0AC+0.397 5BC-0.754 8A2-0.642 3B2-0.452 2C2.見表2.

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

3.2.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析

由圖5可見，AC 和BC 交互作用的等高線圖為橢圓形，響應(yīng)面圖坡度較陡，交互作用顯著；AB交互作用的等高線圖接近圓形，響應(yīng)面圖坡度較緩，交互作用不顯著.由圖5 a可見，粉碎度響應(yīng)曲面坡度較陡，說明粉碎度對馬齒莧多糖提取率的影響高于液料比；由圖5 b可見，粉碎度與微波時間響應(yīng)曲面坡度相似，說明粉碎度和微波時間對馬齒莧多糖提取率的影響相似；由圖5 c可見，微波時間響應(yīng)曲面坡度較陡，說明微波時間對馬齒莧多糖提取率的影響高于液料比.應(yīng)用Design-Expert 8.0 分析結(jié)果顯示：馬齒莧多糖最優(yōu)提取工藝條件為粉碎度62.98目、液料比V(mL)∶m(g)=32.21∶1、微波時間12.27 min，在此條件下提取率為6.34%.為驗證響應(yīng)面模型是否可靠，結(jié)合實際情況最終確定優(yōu)化條件為粉碎度60目、液料比V(mL)∶m(g)=32∶1，微波時間12 min，試驗3次，得馬齒莧多糖(POPC)提取率的平均值為6.31%，該值與預(yù)測結(jié)果相近，說明經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化后微波輔助水提醇沉馬齒莧多糖的提取工藝條件合理可行.

圖5 各因素交互作用對提取率的響應(yīng)面和等高線

3.3 馬齒莧多糖體外抗氧化活性

DPPH·在乙醇溶液中呈深紫紅色，被還原劑還原后顏色變淡甚至消失，可作為評價POPC抗氧化活性的依據(jù).試驗2.5.1結(jié)果見圖6.POPC對DPPH·的清除率雖然明顯弱于陽性對照組Vc，但隨POPC濃度升高對DPPH·的清除率呈持續(xù)增強趨勢，且濃度為5 mg/mL時清除率最高，為(38.85±2.31)%，經(jīng)計算IC50值為6.79 mg/mL.可見，POPC具有一定清除DPPH·的能力.

圖6 POPC對DPPH·的清除率

·OH 氧化能力極強，可與水楊酸反應(yīng)生成紫色物質(zhì)，加入抗氧化劑后，溶液顏色變淺甚至消失[23].試驗2.5.2結(jié)果見圖7.POPC對·OH的清除率弱于陽性對照組Vc，但對·OH的清除率在試驗濃度范圍內(nèi)有劑量依賴性，濃度為5 mg/mL時清除率最高，為(43.87±2.09)%，結(jié)果表明：POPC具有良好清除·OH的能力，經(jīng)計算得其清除·OH活性的IC50值為6.59 mg/mL.

圖7 POPC對·OH的清除率

圖8 POPC對的清除率

3.4 馬齒莧多糖果蠅體內(nèi)抗氧化活性測定

試驗2.6結(jié)果(見圖9～10)顯示：POPC各劑量組較空白對照組均能提高果蠅體內(nèi) SOD 活力，且隨劑量增加呈先上升后下降趨勢，POPC濃度為10 mg/mL時，果蠅體內(nèi)SOD活力最高，SOD活力比空白對照組提高了(191.97±2.25)%.POPC濃度為15、20 mg/mL時，果蠅體內(nèi)SOD活力呈下降趨勢，推測高濃度POPC反而抑制SOD活力；POPC各劑量組的果蠅體內(nèi)MDA含量均低于空白對照組，呈隨劑量增加先降低后升高的趨勢，濃度為15 mg/mL時果蠅體內(nèi)MDA含量最低，比空白對照組降低了 (66.40±1.91)%.

圖9 POPC對SOD活力的影響

圖10 POPC對MDA含量的影響

4 結(jié) 論

綜上，本試驗結(jié)果可為馬齒莧多糖提取條件的優(yōu)化研究及其作為抗氧化藥品、功能性食品的開發(fā)利用提供試驗依據(jù)，為進(jìn)一步深入研究馬齒莧多糖的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性及構(gòu)效關(guān)系提供一定的實驗基礎(chǔ).