王 震, 畢燕會, 周志剛, 2

2個重組海帶a-碳酸酐酶(CA)的酶活性比較研究

王 震1, 畢燕會1, 周志剛1, 2

(1. 上海海洋大學 水產(chǎn)遺傳資源開發(fā)利用教育部重點實驗室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學 國家海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心, 上海 201306)

為了探究海帶()a-CA1和a-CA2是否具有催化CO2的可逆水合反應和酯酶活性, 作者通過原核表達得到這兩種a-CA的可溶性的異源重組蛋白。分別用電極法和酯酶活性檢測法來檢測重組a-CA1(ra-CA1)和ra-CA2的水合酶活性和酯酶活性, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), ra-CA1的水合酶活性(1.52±0.120 U/mg)幾乎是ra-CA2(0.54±0.046 U/mg)的3倍, 表明ra-CA1催化CO2的水合能力明顯大于ra-CA2。而兩者的酯酶活性并沒有顯著的差別(ra-CA1比活力: 0.697±0.176 U/g, ra-CA2比活力: 0.743±0.129 U/g), 說明催化乙酸對硝基苯酯(-NPA)生成對硝基苯酚(-NP)的能力是沒有顯著差別的。實驗結(jié)果證實這2個a-CA為功能蛋白, 可能參與海帶無機碳吸收和儲存過程, 因此, 本研究為海帶無機碳吸收和儲存機制的解析提供了生物化學依據(jù)。

海帶();a-碳酸酐酶(CA); 原核表達; 水合酶活性; 酯酶活性

碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA; EC 4.2.1.1)是一種金屬酶, 絕大多數(shù)是以鋅(Zn)原子作為金屬配合物, 催化CO2的可逆水合反應, 實現(xiàn)CO2與HCO3–之間的快速轉(zhuǎn)化[1-3]。CA普遍存在于包括具有光合作用的所有生物中[4], 基于保守的核苷酸序列, CA目前被分為a、b、g、d、e、z、h、q和i9個亞型[5-11]。不同亞型CA序列沒有相似性, 屬于催化功能的趨同進化。

早在1967年, 在孔石莼()中首次檢測到大型海藻的CA活性[12]。隨后, 對不同海域150種海藻進行CA活性檢測, 發(fā)現(xiàn)CA普遍存在于這些受檢的海藻中[13]。但這些均是對藻體CA總活性或胞內(nèi)及胞外CA總活性的報道, 尚無法完成CA家族單個成員在藻體內(nèi)的活性檢測。海帶()是一種大型褐藻, 具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)價值。通過對海帶全長轉(zhuǎn)錄組分析, 目前認為海帶CA家族具有11個成員, 分屬a-、b-和g-CA亞型[14]。類似地, BI等[15]成功測得海帶配子體的胞內(nèi)及胞外CA總活性, 岳國峰等[16]報道胞外CA在海帶孢子體無機碳吸收中起著主要作用。為深入研究各CA成員在海帶無機碳吸收和儲存中的作用, 通過分子細胞學手段, 余貞等[17]自海帶配子體細胞中, 率先報道了第1個CA的基因特征; 隨后, 利用膠體金免疫電鏡手段, YE等[18]確定了a-CA1于海帶配子體細胞的葉綠體中發(fā)揮作用; BI等[19]明確了a-CA2位于海帶配子體細胞壁中; BI等[20]證實了γ-CA位于線粒體中。這些研究為海帶無機碳富集機制解析提供了分子細胞學證據(jù), 但具體各CA在海帶內(nèi)是否發(fā)揮功能, 還需對其活性進行鑒定。

基于YE等[18]和BI等[19]的研究結(jié)果, 本研究首先通過原核表達獲得a-CA1和a-CA2的可溶性重組蛋白; 然后分離純化可溶性的重組a-CA1和a-CA2, 利用電極法檢測它們水合反應活性。鑒于a-CA還能催化羧酸酯[21]的水解反應, 利用分光光度法檢測了它們的酯酶活性, 并探討抑制劑AZ對重組a-CA酯酶活性的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。本研究的結(jié)果不僅從功能上鑒定了這2個海帶a-CA基因, 也有助于進一步比較分析兩者的生化特性, 為海帶無機碳利用途徑的解析奠定扎實的生物化學基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物材料

在溫度(17±1) ℃、光強40mmol photons/(m2·s)和光周期16 h/8 h(光照/黑暗)條件下[22], 將海帶雌、雄配子體培養(yǎng)于PES培養(yǎng)基[23]中; 每2個星期更換1次培養(yǎng)基。將大腸桿菌()的DH5a感受態(tài)細胞及BL21(DE3)感受態(tài)細胞(天根生化科技(北京)有限公司)接種于Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中。

1.2 RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol試劑法(Clontech公司)抽提海帶配子體總RNA, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)對RNA進行反轉(zhuǎn)錄, 合成cDNA。具體操作參照各試劑盒的說明書進行。-20 ℃保存cDNA備用。

1.3 海帶a-CA2原核表達載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將BI等[19]已經(jīng)建立并攜帶pET28a-aCA2表達載體的大腸桿菌, 通過目的基因的誘導表達和SDS- PAGE檢測, 發(fā)現(xiàn)絕大部分重組的(recombinant)a- CA2(ra-CA2)是以包涵體的形式表達, 不利于后續(xù)的酶活性檢測。因而, 本研究選擇了表達載體pET- 32a(上海友科生物科技有限公司)來構(gòu)建pET32a-aCA2。

根據(jù)pET-32a多克隆位點的堿基序列及a-CA2基因切去信號肽所對應的cDNA序列, 設(shè)計上游引物HEP-F(ggatccCAACGGCAGCGTGGACCCA, 小寫字母為BamHI酶切識別位點)和下游引物HEP-R (ctcgagTCACACTATGTAAACGGCGCGCCCG, 小寫字母為XhoI酶切識別位點)。用這對引物以合成的cDNA為模板進行PCR以擴增目的基因。反應程序為: 94 ℃預變性4 min; 94 ℃變性30 s, 66.7 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 35個循環(huán); 72 ℃延伸10 min。

PCR擴增結(jié)束后, 取20mL樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Aidlab公司)說明書純化PCR產(chǎn)物, 將其連接至pMD19-T克隆載體(TaKaRa公司); 然后利用熱激法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞, 用藍白斑方法篩選陽性克隆; 通過菌液PCR進行重組子的鑒定, 并將挑取的陽性重組子送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因的序列分析。

利用質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取pMD19T-aCA2和表達質(zhì)粒pET-32a, 并用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和XhoI(TaKaRa公司)將這兩種質(zhì)粒于37 ℃分別進行雙酶切反應4 h, 再將純化的目的產(chǎn)物用T4連接酶連接, 得到含目的片段的重組表達質(zhì)粒pET32a-aCA2。按上述同樣方法經(jīng)藍白斑篩選和測序后, 利用熱激法將測序正確并經(jīng)雙酶切驗證的pET32a-aCA2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)宿主細胞, 得到轉(zhuǎn)基因株ET32a-aCA2/ BL21。將測序正確的菌液與20%的甘油以1︰1(v/v)的比例混勻, 凍存于-80 ℃冰箱備用。用pET-32a空載作陰性對照。

1.4 a-CA2重組蛋白的誘導表達與電泳檢測

采用Ye等[18]的方法, 將攜帶重組表達質(zhì)粒pET32a-aCA2和空載pET-32a的菌液分別接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中, 先后進行活化、放大培養(yǎng)至菌液的OD600值為0.6～0.8, 添加終濃度為1.0 mmol/L的異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG), 在37 ℃下、以180 r/min的轉(zhuǎn)速誘導表達4 h后收集菌體, 用25 mL的1′磷酸緩沖液(PBS)(pH 8.0)重懸菌體。取50 μL重懸的全菌與2×蛋白上樣緩沖液以1︰1的比例混合, 在液氮和30 ℃水浴鍋中反復凍融3次并超聲破碎至溶液透亮; 在4 ℃下、以14 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min; 收集上清并用1′PBS按10︰1(菌液: 1′PBS)的比例重懸沉淀, 分別留樣以用于十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的檢測。

1.5 a-CA2重組蛋白的免疫印跡

鑒于ra-CA2是與表達質(zhì)粒pET-32a中的聚His標簽融合表達的, 因此可以利用商用的抗聚His標簽的特異性抗體來進行Western印跡分析。按照陳晶等[24]的方法, 將全菌經(jīng)SDS-PAGE后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上, 以抗聚His標簽抗體(上海友科生物科技有限公司)作為一抗, HRP標記的羊抗兔二抗作為二抗, 對融合表達的目的蛋白進行免疫印跡檢測。最后按增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)的說明書顯影, 并拍照記錄。

1.6 a-CA2重組蛋白的純化

收集轉(zhuǎn)基因菌株pET32a-aCA2/BL21的沉淀和上清液, 經(jīng)SDS-PAGE檢測, 發(fā)現(xiàn)上清液和沉淀中都出現(xiàn)目的蛋白表達的條帶。將上清液抽濾后, 按照Bio-ScaleTMMini ProfinityTMIMAC Cartridges蛋白親和層析純化預裝柱(Bio-Rad公司)的說明書, 用含不同濃度咪唑的緩沖液(50 mmol/L KH2PO4、300 mmol/L KCl, pH 8.0)洗脫以純化ra-CA2。

洗脫液經(jīng)SDS-PAGE檢測后, 收集含目的蛋白的部分。先用50倍體積的20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0) 4 ℃透析12 h; 再用50倍體積的去離子水透析12 h; 最后, 在4 ℃下用PEG-20000對樣品進行濃縮并利用BRADFORD方法[25]測定其濃度, 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 海帶a-CA1重組蛋白的誘導表達和純化

將YE等[18]已經(jīng)建立并攜帶pET28a-aCA1表達載體的大腸桿菌, 按上述步驟經(jīng)菌株活化、擴培、破碎和SDS-PAGE檢測, 發(fā)現(xiàn)ra-CA1大部分以可溶性蛋白的形式表達在上清液中。因此, 可按上述親和層析法, 從該轉(zhuǎn)基因菌株的上清液中直接純化目的蛋白, 用于后續(xù)酶活性的檢測。

1.8 重組a-CA的CO2水合反應酶活性檢測

根據(jù)Wilbur等[26]的電極法原理測定純化后ra-CA的CO2水合酶活性。在預冷的4 mL巴比妥緩沖液(pH 8.4)中加入1 mL純化后的重組蛋白溶液(1.216 mg/mL), 待pH計讀數(shù)穩(wěn)定在8.3后, 立即加入3 mL飽和的CO2水(將CO2通入到0 ℃的去離子H2O中, 持續(xù)通氣1 h以上), 記錄pH下降1個單位所需的時間, 整個反應過程的溫度控制在0 ℃左右。以不加重組蛋白的為對照組, 測定下降一個pH單位所需要的時間, 每組3個重復, 將1個酶活性單位(U)定義為(0–)/[26]; 其中,0和代表分別代表不加酶液和加入酶液后pH下降1個單位所用的時間(min); 這樣, ra-CA的比活力則以“(0-)//mg蛋白質(zhì)”來計算。

1.9 重組a-CA酯酶活性的測定

a-CA能將乙酸對硝基苯酯(-NPA)水解成對硝基苯酚(-NP)[27]。本研究將0.2 mL 1×PBS溶液、0.6 mL的重組蛋白(0.533 mg/mL)與0.1 mL的-NPA迅速混合以構(gòu)建酯酶反應體系, 并利用分光光度法立即記錄下此時的OD405, 隨后每隔3 min測1次OD405。以Tris-HCl緩沖液為對照, 根據(jù)對照組和實驗組的OD405數(shù)值變化來檢測ra-CA的酯酶活性, 每組3個重復。若1個酶活性單位(U)定義為在0 ℃下、每min產(chǎn)生1mmol的-NP[28], 那么, ra-CA的比活力即可用“(–0)×//g蛋白質(zhì)”來計算; 其中、0分別代表加酶組和對照組產(chǎn)生的-NP濃度(mmol/mL),為總反應體積(mL),為反應時間(min)。反應體系中所產(chǎn)生的-NP可根據(jù)-NP濃度與OD405之間的標準曲線求得。

1.10 抑制劑AZ對重組a-CA酯酶活性的影響

在預實驗的基礎(chǔ)上, 本研究在上述酯酶反應體系中, 添加10、30、50、100、200、250及500mmol/L等不同梯度濃度的AZ, 然后每隔3 min記錄在405 nm下的吸光度。最后按上述酯酶比活力的公式計算不同梯度濃度AZ處理后的ra-CA酶活性, 并計算相應的抑制率, 從而推算出IC50的抑制劑濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET32a-aCA2原核表達載體的構(gòu)建

基于a-CA2的全長cDNA序列、pMD19-T及pET-32a多克隆位點的序列, 設(shè)計帶酶切識別位點的引物HEP-F和HEP-R, 以海帶配子體的cDNA為模板, 擴增到a-CA2的開放閱讀框(ORF)序列, 連接至克隆質(zhì)粒pMD19-T上以構(gòu)建pMD19T-aCA2; 提取該質(zhì)粒, 用BamHI和XhoI對其及表達質(zhì)粒pET-32a分別進行雙酶切反應, 連接目的片段以構(gòu)建pET32a-aCA2。提取pET32a-aCA2, 經(jīng)BamHI和XhoI的雙酶切反應, 其產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測, 只觀察到目的基因大小(816 bp)和載體序列大小(5854 bp)的片段(圖1泳道1); 目的基因的序列分析結(jié)果進一步表明, 已準確地將a-CA2插入至表達質(zhì)粒pET-32a中。

2.2 ra-CA2的誘導表達、純化和免疫印跡檢測

將pET32a-aCA2轉(zhuǎn)化大腸桿菌, 獲得轉(zhuǎn)基因細胞系。經(jīng)放大培養(yǎng)并添加IPTG誘導培養(yǎng)后, 收集菌體, 反復凍融以破碎細胞, 提取分別得到上清液和沉淀中的蛋白, 經(jīng)SDS-PAGE電泳, 發(fā)現(xiàn)上清液(圖1泳道2)和沉淀(圖1泳道3)中均出現(xiàn)目的蛋白的條帶; 它的預測分子量大小為45.57 kD, 包含29.27 kD由目的基因編碼的蛋白和15.3 kD由表達質(zhì)粒pET-32a中His標簽及多克隆位點堿基所編碼的多肽。由于利用表達質(zhì)粒pET-32a中的His標簽融合表達目的蛋白, 因此, 可利用商業(yè)提供的抗聚His標簽的抗體, 對轉(zhuǎn)基因細胞系中的總蛋白進行Western免疫印跡。結(jié)果(圖1泳道4)顯示, 在目的蛋白大小處只出現(xiàn)單一條帶的信號, 說明該處的重組蛋白中含有His標簽; 印跡所對應的分子量大小約為45 kD, 與目的蛋白的預測分子量大小相符, 從而表明重組表達的就是目的基因2所編碼的蛋白。

圖1 a-CA2原核表達載體雙酶切凝膠電泳圖及重組a-CA2表達和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE與免疫印跡圖譜

M1.DNA分子量標準; M2.預染蛋白質(zhì)分子量標準; 泳道1. 重組表達質(zhì)粒pET32a-aCA2的雙酶切產(chǎn)物; 泳道2和3. 重組菌的上清液和沉淀部分; 泳道4. 重組菌的全菌蛋白; 泳道5-11. 經(jīng)含5、10、50、100、150、200和250 mmol/L咪唑緩沖液洗脫的產(chǎn)物

M1.1 kb DNA Ladder Marker; M2.PageRulerTMPrestained Protein Ladder; Lane 1. Double enzyme digested products of the construct pET32a-aCA2; Lanes 2 and 3. supernatant and insoluble, respectively, fractions of the transformed bacteria; Lane 4. crude proteins of the transformed bacteria; Lanes from 5 through 11. the eluted products with a buffer solution containing 5, 10, 50, 100, 150, 200 and 250 mmol/L imidazole, respectively

利用Bio-ScaleTM Mini ProfinityTM IMAC Cartridges蛋白親和層析純化預裝柱, 對自上清中提取的粗蛋白依次用含不同濃度咪唑的洗脫緩沖液來洗脫以純化目的蛋白。其洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳和染色, 結(jié)果(圖1泳道5-11)顯示, 用含150 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫下來的蛋白, 在目的蛋白大小處只顯現(xiàn)一條帶(圖1泳道9)而無雜帶。因此, 可以利用含150 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液來純化重組的a-CA2。

2.3 ra-CA1的誘導表達、純化和免疫印跡檢測

將YE等[18]已經(jīng)建立并攜帶pET28a-aCA1表達載體的大腸桿菌, 按上述ra-CA2的方法進行誘導表達。全菌蛋白的電泳結(jié)果顯示: 相對于未誘導表達的菌株(圖2泳道1), 在約34 kD處出現(xiàn)一不同的條帶(圖2泳道2); 其大小與重組a-CA1大小(30.3 kD)及目的基因上游His標簽和多克隆位點等堿基編碼蛋白(2.2 kD)之和相近; 利用His標簽抗體進行免疫印跡, 結(jié)果顯示在目的蛋白大小處只出現(xiàn)一條印跡(圖2泳道5); 這些結(jié)果均表明, 該條帶即為目的蛋白條帶。轉(zhuǎn)基因菌株上清液及沉淀物的SDS凝膠電泳結(jié)果顯示,a-CA1經(jīng)誘導培養(yǎng)后主要表達在上清液中(圖2泳道3)。按上述ra-CA2親和層析的方法純化ra-CA1; 不同濃度咪唑洗脫緩沖液的SDS凝膠電泳結(jié)果顯示, 20 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液有利于從上清液中純化到ra-CA1(圖2泳道9); 這樣就可以利用含20 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液來純化重組的a-CA1。

2.4 ra-CA的CO2水合反應活性

利用上述經(jīng)親和層析純化制備的ra-CA1和ra-CA2, 分別構(gòu)建體外的CO2水合反應(即CO2+ H2O?HCO3–+H+)體系, 經(jīng)電極法測定可知: 在不加ra-CA1的體系中, 需要約239 s的時間, pH才能自8.0下降到7.0; 但在加入ra-CA1的體系中, 只需要約84 s的時間, pH就下降到7.0; 從而表明ra-CA1具有加速CO2的水合反應能力。經(jīng)計算可知, ra-CA1的水合反應比活力為1.52±0.120 U/mg蛋白(3次重復試驗的平均值±標準差, 以下同, 圖3)。同樣, 檢測結(jié)果表明, ra-CA2約需要140 s的時間, 使反應體系的pH下降1個單位; 經(jīng)計算可知, ra-CA2的水合反應比活力為0.54±0.046 U/mg蛋白(圖3), 極顯著地低于ra-CA1的CO2水合酶活性(<0.01)。

2.5 ra-CA的酯酶水解活性

a-CA能將p-NPA水解成p-NP, 而后者在405 nm波長處具有特殊的吸收峰, 可用于p-NP的定量或定性分析。因此在a-CA酯酶活性檢測之前, 需建立p-NP量與OD405之間的關(guān)系式。在預實驗的基礎(chǔ)上, 通過檢測, 作者發(fā)現(xiàn)在0.05～6mmol/L的p-NP之間, OD405與p-NP的量呈現(xiàn)正比例的線性關(guān)系, 從而建立=0.015 9+0.017 9(2=0.980 7)。該方程式中的代表OD405,代表p-NP的濃度(mmol/L)。

圖2 ra-CA1表達和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE與免疫印跡圖譜

M. 預染蛋白質(zhì)分子量標準; 泳道1. 未經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因菌株的全菌蛋白; 泳道2、5和6. 經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因菌株的全菌蛋白; 泳道3和4. 重組菌株的上清液和沉淀部分; 泳道7. 流穿; 泳道8-12. 經(jīng)含10、20、50、200和500 mmol/L咪唑緩沖液洗脫的產(chǎn)物

M. Prestained Protein Ladder; Lane 1: crude proteins expressed in the transgenic bacterium cultured without addition of IPTG; Lanes 2, 5 and 6. crude proteins expressed in the transgenic bacterium cultured with IPTG as an inducer; Lanes 3 and 4. soluble and insoluble fractions extracted from the transgenic bacterium after induced culture with addition of IPTG; Lane 7. Flow through; Lanes from 8 through 12. the eluted products with a buffer solution containing 10, 20, 50, 200 and 500 mmol/L imidazole, respectively

圖3 ra-CA1和ra-CA2的CO2水合反應及p-NPA的酯酶水解活性

利用制備的ra-CA1和ra-CA2分別構(gòu)建體外水解p-NPA的酯酶反應體系, 經(jīng)分光光度計檢測, 發(fā)現(xiàn)隨著反應時間的延長, OD405值也會相應地增加, 說明加入的ra-CA能水解p-NPA, 使p-NPA逐漸水解從而生成p-NP。但在不添加重組蛋白的對照組中, 12 min時, OD405值就不再發(fā)生明顯的變化, 表明此時這個反應體系幾乎不產(chǎn)生新的p-NP。為此, 作者以12 min的反應時間來計算酶促反應的活性。

檢測后經(jīng)計算可知, ra-CA1的酯酶比活力為0.697±0.176 U/mg; ra-CA2的酯酶比活力為0.743±0.129 U/mg, 經(jīng)統(tǒng)計分析, 二者差異不顯著(>0.05)。

2.6 抑制劑AZ對ra-CA酯酶活性的影響

在上述建立的體外酯酶反應體系中添加不同濃度的抑制劑AZ來探究該抑制劑對ra-CA酯酶活性的影響, 結(jié)果表明當AZ的濃度增加到250mmol/L或500mmol/L, 反應體系中的OD405幾乎不再發(fā)生顯著變化, 說明此時兩個重組a-CA的酯酶活性已接近完全被抑制(表1)。

表1 不同濃度乙酰唑胺(AZ)對ra-CA酯酶活性的抑制率

利用SigmaPlot 4.0軟件對表1的數(shù)據(jù)進行非線性回歸, 從而計算出ra-CA1的IC50=30.2mmol/L, ra-CA2的IC50=53.6mmol/L。由此可以看出ra-CA1對AZ的敏感度明顯高于ra-CA2。

3 討論

本研究根據(jù)已報道的海帶配子體a-CA1和a-CA2的cDNA序列[18, 19], 利用原核表達技術(shù), 在大腸桿菌中異源表達了這兩個a-CA的可溶性蛋白, 經(jīng)親和柱層析純化并利用純化的ra-CA構(gòu)建了體外CO2水合反應的體系, 利用電極法檢測了它們的水合反應活性, 這不僅從功能上鑒定了這兩個基因, 也有助于進行兩者的功能比較并分析它們可能的生物學作用。

本研究的結(jié)果指出, 海帶ra-CA2的水合反應比活力為1.52 U/mg蛋白, 而ra-CA2的為0.54 U/mg蛋白(圖3)。兩者的水合反應比活力, 雖然明顯低于衣藻周質(zhì)b-CA(比活力為4.2 U/mg)[29]和三角褐指藻()類囊體腔q-CA(比活力為30.9 U/mg)[10], 但卻高于自生長于南極冰中一種衣藻(sp. ICE-L)以及綠潮藻滸苔()經(jīng)異源重組的a-CA(比活力分別為0.437 和0.267 U/mg)[30, 31]。至于酯酶活性, 海帶ra- CA與南極冰中那種衣藻(sp. ICE-L) (0.319 U/mg[30])的結(jié)果相近。

值得指出的是, 本研究所檢測的酶活性是攜帶His標簽的融合蛋白, 而非海帶配子體的天然a-CA。盡管His標簽的分子量小, 對目標蛋白的酶活性及結(jié)構(gòu)等的負面影響較小[32], 但越來越多的研究[33]表明,它的負面影響不容忽視。同時, 在ra-CA的純化過程中, 作者使用了IMAC蛋白親和層析純化預裝柱(即Ni柱); 在此過程中,a-CA的金屬輔基Zn2+有可能被Ni柱中的氨三乙酸吸附[34]。另外, 人類a-CA的催化作用機理是目前研究最透徹的, 作者將海帶的a-CA氨基酸序列與人類水合反應活性很高(a-CAII)、中等(a-CAI)及很低(a-CAIII)的3個a-CA[35]作比較, 發(fā)現(xiàn), 海帶的a-CA1和a-CA2均與人類水合反應活性很低的a-CAIII的氨基酸序列最接近, 一致性和相似性分別為27.57%和44.40%, 及28.52%和43.35%。這些都可能是導致海帶ra-CA催化活性較低的原因。因此, 若進行海帶a-CA的酶促反應動力學研究, 建議使用分離純化的天然蛋白或?qū)⑷诤媳磉_蛋白的標簽利用蛋白酶除去。

岳國峰等[16]曾利用AZ處理海帶雌配子體細胞, 發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液的pH與對照之間沒有發(fā)生顯著變化, 說明沒有胞外CA參與無機碳的吸收; 但最近BI等[15]自海帶配子體中檢測到胞外CA的活性。據(jù)BI等[19]報道,a-CA2因位于配子體細胞的周質(zhì)空間發(fā)揮作用, 因而屬于胞外CA。本研究自重組的a-CA2中檢測到酶活性, 不僅支持了海帶配子體胞外CA具有生物學活性的觀點[15], 也表明a-CA2應對海帶配子體胞外CA的活性作出較大的貢獻。鑒于衣藻()[2]、硅藻(,)[3]及高等植物[36]的細胞中都存在不同類型的胞外CA, 作者推測海帶配子體細胞也可能存在著其他類型但目前尚未知的胞外CA, 它們的共同作用, 才能使配子體細胞的胞外CA活性達到33.92 U/g鮮質(zhì)量[15]。

同樣, 通過本研究還可以了解到,a-CA1應是海帶配子體胞內(nèi)CA的活性[15]的主要貢獻者, 因為a-CA1位于配子體細胞的葉綠體中[18]; 但位于線粒體的g-CA[20]的貢獻也不能被忽視。這樣才能使海帶配子體細胞胞內(nèi)CA的活性達到36.83 U/g鮮質(zhì)量[15]。但這些胞內(nèi)、胞外CA與海帶配子體細胞吸收和利用無機碳之間存在著什么關(guān)系, 有待進一步揭示。

[1] Cannon G C, Heinhorst S, Kerfeld C A. Car-boxysomal carbonic anhydrases: Structure and role in microbial CO2fixation[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2010, 1804(2): 382-392.

[2] Moroney J V, Ma Y, Frey W D, et al. The carbo-nic anhydrase isoforms of: intracellular location, expression, and physiological roles[J]. Photosynth Res, 2011, 109(1/3): 133-149.

[3] Hopkinson B M, Dupont C L, Matsuda Y. The physiology and genetics of CO2concentrating mechanisms in model diatoms[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2016, 31: 51-57.

[4] Badger M R, Price G D. The role of carbonic anhydrase in photosynthesis[J]. Annu Rev Plant Biol, 1994, 45(1): 369-392.

[5] Hewett-Emmett D, Tashian R E. Functional diversity, conservation, and convergence in the evolution of the α-, β-, andg-carbonic anhydrase gene families[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1996, 5(1): 50-77.

[6] Lee R B Y, Smith J A C, Rickaby R E M. Cloning, expression and characterization of thed-carbonic anhydrase of()[J]. Journal of Phycology, 2013, 49(1): 170-177.

[7] So A K C, Espie G S, Williams E B, et al. A novel evolutionary lineage of carbonic anhydrase (eclass) is a component of the carboxysome shell[J]. Journal of Bacteriology, 2004, 186(3): 623-630.

[8] Lane T W, Saito M A, George G N, et al. A cad-mium enzyme from a marine diatom[J]. Nature, 2005, 435(7038): 42.

[9] Del Prete S, Vullo D, Fisher G M, et al. Disco-very of a new family of carbonic anhydrases in the ma-laria pathogen–theh-carbonic anhydrases[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Let-ters, 2014, 24(18): 4389-4396.

[10] Kikutani S, Nakajima K, Nagasato C, et al. Thylakoid luminalq-carbonic anhydrase critical for growth and photosynthesis in the marine diatom[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(35): 9828-9833.

[11] Jensen E L, Clement R, Kosta A, et al. A new widespread subclass of carbonic anhydrase in marine phytoplankton[J]. ISME Journal, 2019, 13(8): 2094- 2106.

[12] Ikemori M, Nishida K. Carbonic anhydrase in the marine alga[J]. Physiologia Plantarum, 1968, 21(2): 292-297.

[13] 畢燕會, 衛(wèi)寧寧, 李佳莉, 等. 碳酸酐酶(CA)在大型海洋褐藻獲取與利用無機碳過程中的作用[J]. 生命科學, 2019, 31(3): 296-309.

BI Yanhui, WEI Ningning, LI Jiali, et al.The role of carbonic anhydrase in inorganic carbon acquisition and utilization by brown seaweeds[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2019, 31(3): 296-309.

[14] Bi Y H, Li J L, Zhou Z G. Full-length mRNA sequen-cing inand identification of carbonic anhydrase genes[J]. Aquaculture and Fisheries, 2019, 4(2): 53-60.

[15] Bi Y H, LIANG C L, Li J L, et al. Effects of inorganic carbon concentration and pH on carbonic anhydrase acti-vity of gametophytes of[J]. Aqua-culture and Fisheries, 2021, 6(1): 51-55.

[16] 岳國峰, 王金霞, 王建飛, 等, 海帶幼孢子體的光合碳利用[J]. 海洋與湖沼, 2001, 32(6): 647-652.

YUE Guofeng, WANG Jinxia, WANG Jianfei, et al. Inorganic carbon acquisition by juvenile sporophyte of()[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2001, 32(6): 647-652.

[17] 余貞, 畢燕會, 周志剛. 海帶配子體碳酸酐酶(CA)基因的克隆及其特征分[J]. 水產(chǎn)學報, 2011, 35(9): 1343- 1353.

YU Zhen, BI Yanhui, ZHOU Zhigang. Cloning and characterization of carbonic anhydrase (CA) gene fromgametophytes[J]. Journal of Fisheries of China, 2011, 35(9): 1343-1353.

[18] YE R X, YU Z, SHI W W, et al. Characterization ofa- type carbonic anhydrase (CA) gene and subcellular localization ofa-CA in the gametophytes of[J]. Journal of Applied Phycology, 2014, 26(2): 881-890.

[19] Bi Y H, Qiao Y M, Wang Z, et al. Identification and characterization of a periplasmica-carbonic anhy-drase (CA) in the gametophytes of(Phaeophyceae)[J]. Journal of Phycology, 2021, 57(1): 295-310.

[20] Bi Y H, Du A Y, Li J L, et al. Isolation and characterization of ag-carbonic anhydrase localized in the mitochondria of[J]. Chemosphere, 2021, 266: 129162.

[21] Pocker Y, Stone J T. The catalytic versatility of erythrocyte carbonic anhydrase. III. Kinetic studies of the enzyme-catalyzed hydrolysis of p-nitrophenyl acetate[J]. Biochemistry, 1967, 6(3): 668-678.

[22] 周志剛, 吳超元. 海帶無性繁殖系的形成及孢子體誘導[J]. 生物工程學報, 1998, 14(1): 109-111.

ZHOU Zhigang, Wu Chaoyuan. Clone culture ofand induction of its sporophytes[J]. Chi-nese Journal of Biotechnology, 1998, 14(1): 109-111.

[23] Starr R C, Zeikus J A. UTEX-The culture collection of algae at the University of Texas at Austin 1993 list of cultures[J]. Journal of Phycology, 1993, 29(S2): 1-106.

[24] 陳晶, 王麗麗, 石微微, 等. 海帶配子體中孢子形成相關(guān)蛋白(SRP)基因的克隆及其原核表達[J]. 水產(chǎn)學報, 2010, 34(8): 1165-1173.

Chen Jing, WANG Lili, SHI Weiwei, et al. Clo-ning of srp gene from the gametophytes ofand its expression in[J]. Journal of Fisheries of China, 2010, 34(8): 1165-1173.

[25] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1/2): 248-254.

[26] Wilbur K M, Anderson N G. Electrometric and colorimetric determination of carbonic anhydrase[J]. Journal of Biological Chemistry, 1948, 176(1): 147- 154.

[27] Verpoorte J A, Mehta S, Edsall J T. Esterase activities of human carbonic anhydrases B and C[J]. Journal of Biological Chemistry, 1967, 242(18): 4221- 4229.

[28] Bhakta A, Bandyopadhyay M, Dasgupta S, et al. Effect of NaHS on carbonic anhydrase activity of human erythrocyte[J]. Asian Journal of Medical Sciences, 2016, 7(3): 23-27.

[29] Ynalvez R A, Xiao Y, Ward A S, et al. Identification and characterization of two closely relatedb- carbonic anhydrases from[J]. Physiologia Plantarum, 2008, 133(1): 15-26.

[30] Qu C, He Y, Zheng Z, et al. Cloning, expression analysis and enzyme activity assays of the α-carbonic anhydrase gene fromsp. ICE-L[J]. Molecular Biotechnology, 2018, 60(1): 21-30.

[31] Wang Y, Liu F, Wang M, et al. Characterization and transcriptional analysis of one carbonic anhydrase gene in the green-tide-forming algaa ()[J]. Phycological Research, 2020, 68(1): 90-97.

[32] Porath J. Immobilized metal ion affinity chromatography[J]. Protein Expression and Purification, 1992, 3(4): 263-281.

[33] Arnau J, Lauritzen C, Petersen G E, et al. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins[J]. Protein Expression and Purification, 2006, 48(1): 1-13.

[34] Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003, 60(5): 523-533.

[35] Supuran C T, Scozzafava A, Casini A. Carbonic anhydrase inhibitors[J]. Medicinal Research Reviews, 2003, 23(2): 146-189.

[36] DiMario R J, Clayton H, Mukherjee A, et al. Plant carbonic anhydrases: structures, locations, evolution, and physiological roles[J]. Molecular Plant, 2017, 10(1): 30-46.

Comparative analysis of enzyme activities of two recombinanta-carbonic anhydrases (a-CAs) of

WANG Zhen1, BI Yan-hui1, ZHOU Zhi-gang1, 2

(1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources Conferred by Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. International Research Center for Marine Biosciences Conferred by Ministry of Science and Technology, Shanghai 201306, China)

In order to explore whether the two reported alpha carbonic anhydrases (a-CA1 anda-CA2) ofwere active, the soluble recombinant proteins of them expressed inwere obtained. After purification, the hydratase activity as well as esterase activity of the two recombinanta-CAs (ra-CA1 and ra-CA2) were detected. The results showed that the hydratase activity of ra-CA1 (1.52±0.120 U/mg) was almost three times higher than that of ra-CA2 (0.54±0.046 U/mg), indicating that ra-CA1exibited much higher catalytic activity for CO2hydration than ra-CA2. There was no significant difference between the esterase activities of ra-CA1 (0.697±0.176 U/g) and ra-CA2 (0.743±0.129 U/g), indicating that there was no significant difference between the two ra-CAs in catalyzing the conversion of p-nitrophenyl acetate (p-NPA) to p-nitrophenol (p-NP). The results confirmed that these twoa-CAs were functional proteins, and might participate in the process of inorganic carbon absorption and storage in. This study provided biochemical proofs for the CO2concentrating mechanism of this kelp.

;a-carbonic anhydrase (CA); procaryotic expression; hydration activity; esterase activity

Jan. 5, 2022

[National Natural Science Foundation of China, No. 41376136; The National Key R & D Program of China, No. 2018YFD0901500]

S968.31

A

1000-3096(2022)07-0061-09

10.11759/hykx20220105001

2022-01-05;

2022-02-23

國家自然科學基金項目(41376136); 國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0901500)

王震(1990—), 男, 山東菏澤人, 碩士研究生, 主要從事藻類生物技術(shù)研究, E-mail: 740352930@qq.com; 周志剛(1964—),通信作者, E-mail: zgzhou@shou.edu.cn

(本文編輯: 譚雪靜)