李龍召, 黃平平, 徐奎棟, 4, 趙 峰, 4

DNA/RNA提取及處理方法對評價沉積物中纖毛蟲分子多樣性的影響

李龍召1, 2, 黃平平3, 徐奎棟1, 2, 4, 趙 峰1, 2, 4

(1. 中國科學院海洋研究所海洋生物分類與系統(tǒng)演化實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 山東省生物物理重點實驗室, 德州學院生物物理研究院, 山東 德州 253023; 4. 中國科學院海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071)

環(huán)境DNA(eDNA)技術結(jié)合高通量測序已廣泛應用于評價微型生物多樣性與群落構(gòu)成。相較于eDNA, RNA在環(huán)境中易降解, 環(huán)境RNA(eRNA)可更準確地反映群落近期生命活性狀態(tài)。理論上, 基于eRNA檢獲的生物多樣性要低于eDNA檢獲的總體多樣性。但前期已發(fā)表研究顯示同一站點eDNA獲得的多樣性低于eRNA檢獲量, 推測可能原因包括: 1)樣本量不同; 2)RNA中存在DNA污染。為驗證假設, 本研究以陸架區(qū)2個站位沉積物中的纖毛蟲為實驗對象, 系統(tǒng)性比較4種DNA/RNA提取方法: DNA直接提取(0.9 g沉積物), 大樣本量DNA直接提取(2 g), DNA洗脫法(2 g), RNA直接提取法(2 g); 以及3種RNA提取后的處理方法: 無DNA酶反轉(zhuǎn)錄, 含DNA酶反轉(zhuǎn)錄, 先純化RNA再反轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果表明, 大樣本量(2 g)DNA直接提取法所檢獲的可操作分類單元(OTUs)約為小樣本量(0.9 g)的2倍。相同樣本量下, DNA洗脫法檢獲的OTUs最多, 而DNA直接提取檢獲的OTUs低于有/無DNA酶反轉(zhuǎn)檢獲的數(shù)量, 先純化再反轉(zhuǎn)錄所獲得OTUs最少。就群落構(gòu)成而言, DNA洗脫法和RNA純化可有效降低浮游類群比例, 可更真實展現(xiàn)底棲群落的構(gòu)成。綜上, 建議使用DNA洗脫法評價沉積物中微型生物的總體多樣性; 采用eRNA研究具有生命活性的生物群落時, 反轉(zhuǎn)錄之前可純化RNA, 以獲得更加準確的具有生命活性的群落信息。

eDNA; eRNA; DNA/RNA提取; 纖毛蟲; 分子多樣性

真核微生物包含原生生物, 小型后生生物和單細胞真菌等所有自養(yǎng)和異養(yǎng)類型[1-3]。海洋底棲真核微生物是食物網(wǎng)中的重要一環(huán), 在物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮重要作用, 并維持著海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[4-6]。纖毛蟲作為海洋底棲真核微生物中重要一員, 作用廣泛, 例如作為指示物種和遺傳發(fā)育研究的模式生物[7], 以及穩(wěn)定微食物網(wǎng)[8]等功能。研究海洋底棲纖毛蟲多樣性有利于深入了解生物地球化學循環(huán)過程[4-6, 8], 對認知海洋生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。

近年來, 環(huán)境DNA(eDNA)[9-11]和高通量測序技術的快速發(fā)展[12], 為研究纖毛蟲等微型生物的分子多樣性提供新的思路與方法。eDNA是指從環(huán)境樣本中提取的總DNA, 無需分離目標生物[13]。eDNA在環(huán)境樣本中存在時間長, 構(gòu)成復雜, 來源廣泛, 包含豐富的物種遺傳信息, 既可檢獲具有活性的生物, 又可檢獲休眠狀態(tài)生物以及來源于生物分泌物或者死亡個體的胞外DNA[14-15]。目前, 許多研究針對樣本的空間異質(zhì)性和反映生物群落的時效性, 以及實驗流程的可重復性和穩(wěn)健性展開探討, 以期得到統(tǒng)一規(guī)范的實驗流程[16-20]?；緦嶒灹鞒贪? 采樣及樣品保存→DNA/RNA提取→引物設計, PCR擴增, 測序獲得樣本序列信息→數(shù)據(jù)分析, 獲得生物群落信息[21]。目前, 提取方法的選用不盡相同, 已有多份研究探討不同的DNA提取方法對分子多樣性的影響[16, 22]。整體上, 試劑盒技術成熟, 在進行DNA提取時操作規(guī)范, 流程統(tǒng)一, 獲得的DNA純度高, 系統(tǒng)誤差較小。目前大多數(shù)的分子研究都采用試劑盒提取[16-18, 22]。在使用試劑盒提取沉積物的研究中, 樣本量和提取方法的選用爭議較大[16, 18]。小的樣本量(0.2～0.5 g)有利于機械化流程的開展[16], 而大樣本量(>2 g)能更真實反映生物群落信息[23]。

相較于eDNA, RNA在環(huán)境中存在時間短[24], 作為細胞代謝的過程產(chǎn)物, 環(huán)境RNA(eRNA)能更為準確地反映群落活躍狀態(tài)[25-26]。eRNA作為一種新技術, 尚缺乏一套標準化的方法來進行樣本收集、處理和分析[27]。理論上, 同一樣品, 基于eRNA檢獲的生物多樣性要低于eDNA的檢獲量。然而, 課題組前期研究以及其他報道[16, 18]發(fā)現(xiàn), 采用目前國際主流的DNA直接提取法(0.9 g沉積物)獲得的多樣性低于RNA方法(2 g沉積物)獲得的多樣性[28]。推測可能原因包括1)樣本量不同; 2)在RNA反轉(zhuǎn)錄過程中, 污染基因組DNA的存在會對下游分析產(chǎn)生較大影響, 使得分子多樣性結(jié)果偏高[29-30]。

為驗證本研究提出的假設, 以陸架區(qū)2個站位沉積物中的纖毛蟲為實驗對象, 系統(tǒng)性比較4種DNA/RNA提取方法: DNA直接提取(0.9 g沉積物), 大樣本量DNA直接提取(2 g), DNA洗脫法(2 g), RNA直接提取法(2 g); 以及3種RNA提取后的處理方法: 無DNA酶反轉(zhuǎn)錄, 含DNA酶反轉(zhuǎn)錄, 先純化RNA再反轉(zhuǎn)錄。旨在評價: 1) 不同沉積物樣本量對基于eDNA技術檢獲的纖毛蟲分子多樣性的影響。2) 相同樣本量, 不同DNA/RNA提取方法對分子多樣性評價的影響。3) 不同RNA處理方法對評估纖毛蟲分子多樣性的影響。以期提出利用eDNA/eRNA研究海洋沉積物中真核微生物的分子多樣性的最佳研究策略。

1 實驗方法

1.1 樣品采集與樣品保存

2018年8月搭乘“科學三號”科學考察船于黃海3600-3(35°39′86″N, 112°29′71″E)和3600-6站位(36°00′07″N, 123°00′02″E), 利用0.1 m2改進型的Gray-Ohara箱式采泥器, 進行沉積物樣品采集。在每個站位采集含有上覆水的未受擾動的沉積物, 刮取0～2 cm表層沉積物約20 g放入封口袋中, 3600-3站位采集4個重復, 3600-6站位采集3個重復。置于–20 ℃超低溫冰箱中保存, 以待后續(xù)DNA提取。

1.2 分子生物學方法

1.2.1 DNA/RNA提取

1) 取0.9 g沉積物, 采用Power Soil DNA Isolation Kit(Qiagen, Germany)進行DNA提取, 分3次進行, 每次0.3 g (DNA直接提取0.9 g); 2) 取2 g沉積物, 采用Power Max Soil DNA Isolation kit(Qiagen, Germany)進行DNA提取, 每個重復提取1份DNA (DNA直接提取2 g); 3) 取2 g沉積物, 采用Power Soil RNA Isolation Kit(Qiagen, Germany)提取RNA, 同時采用RNA Power Soil?DNA Elution Accessory Kit(Qiagen, Germany)于同一樣品洗脫DNA, 每個重復提取1份RNA和1份DNA(DNA洗脫法2 g)。

1.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄

對提取的RNA采用3種不同的方式反轉(zhuǎn)錄處理獲取cDNA: 1) 采用不含DNA酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script II 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa, Japan)直接反轉(zhuǎn)錄(無DNA酶反轉(zhuǎn)); 2) 采用含DNA酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒5X All-In-One Master Mix (Gentaur, Europe)進行反轉(zhuǎn)錄(含DNA酶反轉(zhuǎn)); 3) 先采用TURBO DNA-free? Kit(Thermo Fisher, USA)對提取的RNA進行純化, 純化后的RNA采用Prime Script II 1st strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄(先純化再反轉(zhuǎn))(圖1)。

1.2.3 PCR與高通量測序

采用巢式PCR技術擴增纖毛蟲的18S rRNA基因的V4高變區(qū), 選用纖毛蟲特異性引物CilF、Cil RⅠ、Cil RⅡ、Cil RⅢ[31], 以及真核微生物18S V4 高變區(qū)通用引物EukF、EukR[32]進行擴增, 每個樣品設置3份PCR重復及1份陰性空白對照, 具體巢式PCR流程參考文獻[33]。擴增后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量及片段長度(480 bp), 將同一個樣品的3份PCR產(chǎn)物合并, 送至測序公司開展測序。

1.3 生物信息分析

測序數(shù)據(jù)進行拼接得到原始數(shù)據(jù)(raw data), 經(jīng)過質(zhì)量控制和去嵌合體得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(clean data)。質(zhì)量控制包括: 1) 將Raw Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(≤19)堿基數(shù)達到設定長度(3)的第一個低質(zhì)量堿基位點截斷; 2) 進一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags。對有效數(shù)據(jù)進行去冗余、去單一序列和 97%相似度的OUT (operational taxonomic units, 可操作分類單元)聚類分析, 根據(jù) OTU 聚類結(jié)果, 對每個 OTU的代表序列與 SILVA 數(shù)據(jù)庫比對作物種注釋, 得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況, 即OTU表格。利用EXCEL進行統(tǒng)計, 采用R進行單因素方差分析, 并繪制箱線圖, 折線圖, 韋恩圖。使用PRIMER v6軟件中的CLUSTER應用程序, 對同一樣本量(2 g)的所有樣本進行聚類分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 提取和處理方法對纖毛蟲物種豐富度的影響

基于不同樣品量的DNA直接提取法比較結(jié)果顯示, 0.9 g樣本量所獲得的OTUs數(shù)明顯低于2 g樣本量所獲得的OTUs數(shù)。在3600-3站位, 直接提取DNA: 0.9 g樣本平均獲得96個OTUs, 2 g樣本量每個測序樣本平均獲得152個OTUs。在3600-6站位, 直接提取DNA: 0.9 g樣本量平均獲得83個OTUs, 2 g樣本量每個測序樣本平均獲得161個OTUs。

在相同樣本量(2 g)的情況下, 以3600-3站位為研究對象, 結(jié)果表明: 采用DNA洗脫法平均檢獲的OTUs最高; 其他方法排序: 依次為無DNA酶反轉(zhuǎn), 含DNA酶反轉(zhuǎn), DNA直接提取以及RNA先純化再反轉(zhuǎn)的方法。以3600-6站位為研究對象, DNA洗脫法平均所檢獲的OTUs亦最高; 其他依次為含DNA酶反轉(zhuǎn)、DNA直接提取、無DNA酶的反轉(zhuǎn)以及RNA先純化再反轉(zhuǎn)的方法(圖2)。在3600-3站位, 不同提取方法下的單因素方差分析(方差齊性檢驗= 0.3, 符合正態(tài)分布)顯示, 不同提取方法之間存在顯著差異(= 0.023); 在3600-6站位, 不同提取方法下的單因素方差分析(方差齊性檢驗= 0.1, 符合正態(tài)分布)顯示, 不同提取方法之間存在極顯著差異(= 0.007 5)。

圖2 3600-3與3600-6站位同一樣本量不同提取處理方法所獲得的OTU數(shù)量

2.2 提取處理方法與纖毛蟲生物群落結(jié)構(gòu)的關系

總體來看, 直接DNA提取的方法獲得大量的浮游類纖毛蟲(Choreotrichia 以及Oligotrichia)序列。采用樣本量0.9 g, 在3600-3和3600-6站位平均獲得的浮游類纖毛蟲相對豐度最高(52%±0.155%; 51%±0.079%); 采用樣本量2 g, 平均獲得的浮游類纖毛蟲相對豐度次之(41%±0.145%; 38%±0.157%); 其余的方法(DNA洗脫法與RNA提取方法)所獲得的浮游類群相對豐度較低。在3600-3站位, 無DNA酶反轉(zhuǎn)錄方法獲得的浮游類纖毛蟲較高, 平均相對豐度為20.9%±0.116%, 其余依次為洗脫DNA方法(20.2%± 0.156%)、含DNA酶的反轉(zhuǎn)錄方法(13.9%±0.028%)以及RNA先純化再反轉(zhuǎn)方法(11.5%±0.076%)。在3600-6站位, 無DNA酶反轉(zhuǎn)錄方法獲得的浮游類纖毛蟲亦較高, 平均相對豐度為13.4%±0.073%, 其余依次為含DNA酶的反轉(zhuǎn)錄方法(7.9%±0.054%)、DNA洗脫方法(7.0%±0.015%)以及RNA先純化再反轉(zhuǎn)方法(1.5%±0.002%) (圖3)。

圖3 每個測序樣本浮游類群(舞毛亞綱和寡毛亞綱)相對豐度折線圖

在樣本量相同的情況下, 綜合所有重復, 分析不同方法獲得的纖毛蟲總體上以及刪除浮游類群后所共有和特有的OTUs。結(jié)果表明, DNA洗脫法檢獲的特有OTUs數(shù)最多, 3600-3站位總體上51個, 刪除浮游類群后47個; 3600-6站位總體上71個, 刪除浮游類群后57個。而DNA提取法在兩個站位檢獲的特異OTUs數(shù)波動較大(總體上, 3600-3: 6個; 3600-6: 33個)。有或無DNA酶反轉(zhuǎn)所檢獲的特異OTUs數(shù)亦較高, 先純化再反轉(zhuǎn)所檢獲的特異OTUs數(shù)最低。以不同的RNA反轉(zhuǎn)錄方法為研究對象, 總體上看, 無論是在3600-3, 還是在3600-6站位; 含DNA酶反轉(zhuǎn)錄所獲得的分子多樣性和無DNA酶反轉(zhuǎn)錄所共檢的OTUs比例較高, 均在50%以上。在3600-3站位, 總體上含DNA酶和無DNA酶共檢獲OTUs占比67.8%; 去除浮游類群后為65.6%。在3600-6站位, 總體上含DNA酶和無DNA酶共檢獲OTUs占比52%。去除浮游類群后發(fā)現(xiàn)為52.7%。綜合兩個站位, 對比含DNA酶反轉(zhuǎn)和先純化再反轉(zhuǎn)的方法發(fā)現(xiàn), 無論是否去除浮游類群, 先純化再反轉(zhuǎn)所檢獲的特異OTUs占比較少, 均在10%以下, 分別為6.9%, 7.8%, 2.9%, 3.3%(圖4)。

分別對3600-3和3600-6站位相同樣本量(2 g)的測序樣本聚類分析, 結(jié)果顯示: 在3600-3站位, 無DNA酶反轉(zhuǎn)以及含DNA酶反轉(zhuǎn)獲得的纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)較為相似, 然后與DNA洗脫法獲得的樣本群落聚合; 在3600-6站位, 含DNA酶反轉(zhuǎn)獲得的樣本群落首先與DNA洗脫法獲得的樣本群落聚合, 其次與無DNA酶反轉(zhuǎn)獲得的樣本群落聚合, 最后與DNA直接提取獲得的樣本群落聚合。結(jié)果顯示, 無論是在哪個站位, 先純化再反轉(zhuǎn)所獲得的樣本群落信息與其他方法均在相似度50%以下聚合(圖5)。

3 討論

3.1 樣本量對纖毛蟲分子多樣性的影響

研究表明, 不同樣本量對重建土壤微生物群落(細菌, 真菌等)信息存在影響[34-36]。Nascimento等[18]利用不同的巖芯采樣量評估了樣本量對于真核生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響, 分析得出隨著樣本量的增加, 群落結(jié)構(gòu)信息隨之穩(wěn)定; 而在Pearman等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)在低重復樣品數(shù)的情況下, 不同樣本量檢獲的群落差異不顯著。為降低沉積物樣品異質(zhì)性的影響, 我們的研究將每種處理方式設置3～4個重復, 結(jié)果顯示不同樣本量對纖毛蟲分子多樣性的評價具有重要影響。采用同種提取方法, 0.9 g樣本量平均所獲得的OTUs數(shù)約為2 g樣本量所獲得的OTUs數(shù)的1/2。從側(cè)面證明樣品量小是導致從0.9 g沉積物直接提取DNA獲得的多樣性低于從2 g沉積物提取RNA獲得的多樣性的重要因素。

圖4 3600-3與3600-6站位總體上和刪除浮游類群(舞毛亞綱以及寡毛亞綱)后, 不同RNA處理方法之間共有和特有OTUs

生物群落構(gòu)成分析結(jié)果顯示0.9 g樣本量所檢測到的浮游類纖毛蟲占比最多, 說明小樣本量的DNA提取方法檢測能力有限, 富集于海底的浮游物種的DNA會干擾底棲群落的研究。提取DNA時, 由于小樣本量抽樣不全[18], 會導致多樣性的漏檢, 進而形成生物群落構(gòu)成的偏好性等。

3.2 不同提取方法對纖毛蟲分子多樣性的影響

利用eDNA作為物種檢測手段已經(jīng)十分成熟, 但目前仍沒有一套統(tǒng)一規(guī)范的實驗流程?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明, 從環(huán)境樣品中提取DNA, 不同的提取處理方法會導致分析結(jié)果的差異[16, 22]。本研究發(fā)現(xiàn)相較DNA提取法, DNA洗脫法可檢獲更多的OTUs, 這可能歸因于直接提取DNA時, 腐殖質(zhì)含量高, 更易與DNA的結(jié)合, 進而使得獲得的生物遺傳信息降低[37]。DNA洗脫法可更高效除去腐殖質(zhì)的影響, 獲得更為全面的分子多樣性信息, 可為 eDNA研究提供可靠的模板[38]。

相較于eDNA, RNA在環(huán)境中存在時間短[24], 作為細胞代謝的過程產(chǎn)物, 環(huán)境RNA(eRNA)能更準確地反映群落近期的生命活性狀態(tài)[25-26]。相較于有/無DNA酶反轉(zhuǎn)錄, 先純化再反轉(zhuǎn)錄所獲得的OTUs數(shù)量明顯偏低; 有DNA酶反轉(zhuǎn)錄所獲得的OTUs比無DNA酶反轉(zhuǎn)錄所獲得的少, 推測可能是樣本中殘留的基因組DNA所致。這表明在RNA反轉(zhuǎn)錄過程中去除基因組污染是必要的[39]。

分析不同提取和處理方法所得群落信息, 發(fā)現(xiàn)采用RNA反轉(zhuǎn)錄方法所獲得的浮游生物占比較少, 且純化后RNA獲得浮游生物占比最少。先純化再反轉(zhuǎn)錄所獲得的群落單獨聚合, 并與其他方法之間存在差異(相似度小于50%)?？紤]到RNA作為一種易降解的活性遺傳物質(zhì)[40], 我們推測先純化再反轉(zhuǎn)的方法可去除環(huán)境樣本中較長時間內(nèi)的基因組DNA等污染, 因此導致RNA先純化再反轉(zhuǎn)獲得的OTUs也較少, 且群落構(gòu)成與其他方法存在差異, 這也從側(cè)面證實RNA先純化再反轉(zhuǎn)可更加準確的展現(xiàn)具有生命活性的生物群落。

圖5 3600-3和3600-6站位相同樣本量(2 g)測序樣本聚類分析圖

4 結(jié)論

增加樣本量(0.9 g至2 g范圍內(nèi))可檢獲更多的OTUs。相較于DNA提取法, DNA洗脫法可更加全面的反映微型生物的群落結(jié)構(gòu)。RNA在環(huán)境樣本中存在時間短, 可反映具有生命活性的微生物群落信息情況, 但直接提取的eRNA中存在DNA污染, 提取后直接反轉(zhuǎn)錄, 會檢獲較高比例的浮游類群。RNA提取純化后再反轉(zhuǎn)錄可有效降低浮游類群比例, 可更加真實展現(xiàn)具有生命活性的底棲生物群落。綜上, 我們推薦采用DNA洗脫法評價沉積物中微型生物的整體多樣性; 采用eRNA研究具有生命活性的生物群落時, 反轉(zhuǎn)錄之前可先純化RNA, 以獲得更加準確的具有生命活性的底棲生物群落信息。

致謝: 中國科學院海洋研究所徐雨協(xié)助樣品采集, 謹致謝忱。

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Effects of DNA and RNA extraction methods for the evaluation of ciliate diversity in marine sediments

LI Long-zhao1, 2, HUANG Ping-ping3, XU Kui-dong1, 2, 4, ZHAO Feng1, 2, 4

(1. Department of Marine Organism Taxonomy and Phylogeny Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Shandong Key Laboratory of Biophysics, Institute of Biophysics, Dezhou University, Dezhou 253023, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Environmental DNA (eDNA) has been used along with high-throughput sequencing to evaluate microbial diversity and community composition. Compared with eDNA, environmental RNA (eRNA) degrades easily and can be used to investigate the community of active taxon. The species richness obtained by eRNA is lower than that by eDNA in theory. However, previous studies have shown that the diversity obtained by eDNA at the same site is lower than that detected by eRNA. This unexpected finding may be attributed to the difference in the sample size and the DNA contamination in RNA. To test this hypothesis, we estimated the effects of DNA and RNA extraction methods on ciliate diversity in sediments obtained from the continental shelf area. Four extraction methods were performed: DNA direct extraction with 0.9 g sediments, DNA direct extraction with 2 g sediments, DNA elution, and RNA direct extraction from 2 g sediments. Meanwhile, three types of eRNA treatments before the reverse transcription, including the addition of DNA enzyme, no addition of DNA enzyme, and purifying RNA, were also compared. The results revealed that the number of operational taxonomic units (OTUs) detected from 2 g sediments was about twice that from the 0.9 g sediments by DNA direct extraction. Using the same sample size, the highest number of OTUs was detected via DNA elution and the lowest number by purified RNA. The number of OTUs detected by DNA direct extraction was lower than that by eRNA, irrespective of the addition of DNA enzyme. In terms of community composition, DNA elution and RNA purification can effectively reduce the proportion of planktonic groups, thereby improving the estimates of the composition of the benthic community. In summary, the DNA elution method is recommended for evaluating the total diversity of microorganisms in marine sediments. eRNA can be used after purification to investigate active communities.

eDNA: eRNA; DNA / RNA extraction; ciliate; molecular diversity

Sep. 22, 2021

[National Natural Science Foundation of China, No. 41876171]

Q958

A

1000-3096(2022)07-0052-09

10.11759/hykx20210922001

2021-09-22;

2021-10-28

國家自然科學基金資助項目(41876171)

李龍召(1997—), 男, 安徽定遠人, 碩士研究生, 主要從事海洋真核微生物多樣性研究, E-mail: 15375544229@163.com; 趙峰(1987—),通信作者, 副研究員, E-mail: fzhao@qdio.ac.cn

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)