張申平,周 靜,徐紅斌,葉 青

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院 國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(乳及乳制品檢測(cè)與監(jiān)控技術(shù)),上海 200233)

凝膠鎮(zhèn)痛貼屬于冷敷止痛類(lèi)產(chǎn)品,由背襯層、凝膠層、防黏層等部分組成。凝膠層包含水、醇類(lèi)化合物等易揮發(fā)成分(如薄荷腦、樟腦、冰片、水楊酸甲酯)[1-2]以及止痛藥成分(利多卡因)[3]。其中,止痛藥能夠透過(guò)皮膚毛孔直達(dá)患處,起到止痛作用;水等易揮發(fā)成分的大量揮發(fā)會(huì)帶走熱量,在止痛的同時(shí)還能起到冷敷消腫的作用。薄荷腦從薄荷的葉和莖中提取而來(lái),一般有D型和L型兩種異構(gòu)體,凝膠鎮(zhèn)痛貼中主要使用消旋的薄荷腦,即DL-薄荷腦。該成分的含量對(duì)凝膠鎮(zhèn)痛貼的效果有較大影響,因此提供合適的檢測(cè)方法對(duì)凝膠鎮(zhèn)痛貼產(chǎn)品的質(zhì)量控制極為重要。

薄荷腦相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有QB/T 1793-2014《天然薄荷腦》,QB/T 1792-2011《合成薄荷腦》和《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版(ChP 2020),但其適用的檢測(cè)對(duì)象均為薄荷腦粉末,不包括含薄荷腦成分的成品。文獻(xiàn)方法在粉末[4-5]及液體[6-7]基質(zhì)樣品中應(yīng)用較多,且存在較大基質(zhì)效應(yīng),需要通過(guò)樣品稀釋、鹽析等方法消除[8]。溶劑萃取法是貼敷類(lèi)薄荷腦產(chǎn)品的主要前處理方法[1,9],相關(guān)文獻(xiàn)通過(guò)采用極性溶劑提取,附火焰離子化檢測(cè)器的氣相色譜法(FID-GC)檢測(cè),但有機(jī)溶劑消耗量過(guò)多,成本較高,同時(shí)也未對(duì)測(cè)定值與產(chǎn)品標(biāo)簽值的差異進(jìn)行分析。鑒于此,本工作優(yōu)化了提取溶劑、提取時(shí)間等參數(shù),以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)提取樣品,以FID-GC測(cè)定凝膠鎮(zhèn)痛貼中薄荷腦的含量,并與ChP 2020中檢測(cè)薄荷腦粉末的方法進(jìn)行比對(duì),以期為凝膠鎮(zhèn)痛貼中薄荷腦含量的監(jiān)控提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU GC-2010Plus型氣相色譜儀,配FID;DHG-9053A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱;Reax Control型渦旋振蕩器;MS204S型電子天平(感量0.1 mg);Milli-Q 型超純水機(jī)。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:5 000 mg·L-1,稱(chēng)取0.05 g(精確到0.1 mg)薄荷腦標(biāo)準(zhǔn)品,用乙酸乙酯溶解并定容至10 mL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.02,0.1,0.2,0.4,1 mL于10 mL 容量瓶中,用乙酸乙酯稀釋至刻度,得到10,50,100,200,500 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

薄荷腦標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.8%,規(guī)格為100 mg;乙醇、甲醇、乙酸乙酯均為色譜純;DMF 為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

VF-17ms毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.15μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃。柱升溫程序:0～15 min,由50 ℃升溫至300 ℃,保持3 min。檢測(cè)器溫度300 ℃;載氣為高純氮?dú)?流量30 mL·min-1;柱流量1.50 mL·min-1,氫氣流量30 mL·min-1,空氣流量300 mL·min-1,尾吹氣流量20 mL·min-1;進(jìn)樣體積1μL;不分流進(jìn)樣。

1.3 試驗(yàn)方法

稱(chēng)取約0.1 g(精確到0.1 mg)樣品,撕掉防黏層后置于頂空瓶中,加入5 mL DMF,迅速蓋好蓋子,振蕩10 s,于80℃烘箱中加熱1 h。冷卻至室溫,分取2 mL,以5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心1 min。取上清液100μL 置于進(jìn)樣瓶中,用乙酸乙酯定容至1 mL,按照儀器工作條件測(cè)定。

稱(chēng)取約0.1 g樣品(記為m1,精確到0.1 mg),撕掉防黏層并置于錐形瓶中,加入50 mL 水,于95 ℃振蕩加熱至凝膠層與背襯層分離。將背襯層取出,用乙醇清洗其表面至無(wú)凝膠殘留,置于105 ℃烘箱中加熱30 min,移至干燥器中放置30 min,稱(chēng)取質(zhì)量(記為m2,精確到0.1 mg)。凝膠層質(zhì)量m即為m1-m2,并由此計(jì)算凝膠層中薄荷腦的質(zhì)量分?jǐn)?shù),所得結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后兩位。

2 結(jié)果與討論

2.1 頂空-GC的測(cè)定效果

以3個(gè)含薄荷腦5%～6%(標(biāo)簽值,質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)的凝膠鎮(zhèn)痛貼樣品為待測(cè)對(duì)象,考察了頂空-GC的測(cè)定效果。參考文獻(xiàn)[10],設(shè)定頂空-GC 的提取溶劑為乙酸乙酯,頂空溫度為120～150 ℃,頂空時(shí)間為30～60 min。結(jié)果顯示,在不同組合條件下,頂空-GC 測(cè)得3個(gè)樣品中薄荷腦的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.68%～3.38%,遠(yuǎn)小于標(biāo)簽值,說(shuō)明頂空-GC 不適用于凝膠鎮(zhèn)痛貼中薄荷腦含量的測(cè)定。溶劑萃取-GC可根據(jù)凝膠特性選擇提取溶劑,針對(duì)性強(qiáng)。因此,試驗(yàn)擬采用該方法測(cè)定凝膠鎮(zhèn)痛貼中薄荷腦含量。

2.2 提取溶劑的選擇

薄荷腦可溶于乙酸乙酯、甲醇、乙醇、DMF等有機(jī)溶劑,因此試驗(yàn)考察了這4種提取溶劑對(duì)含薄荷腦5%～6%的凝膠鎮(zhèn)痛貼樣品中薄荷腦提取效果的影響。結(jié)果顯示,4種溶劑提取薄荷腦時(shí)的測(cè)定值依次為4.77%,4.84%,1.75%,5.34%,其中用極性較大的DMF提取時(shí)薄荷腦的測(cè)定值與標(biāo)簽值基本一致。因此,試驗(yàn)選擇的提取溶劑為DMF。

2.3 提取時(shí)間的選擇

在較高的提取溫度下,合適的提取時(shí)間有利于薄荷腦從凝膠基質(zhì)中釋放完全。因此,試驗(yàn)考察了80 ℃下提取時(shí)間分別為0.5,1,2,3,4,5 h時(shí)對(duì)含薄荷腦5%～6%的凝膠鎮(zhèn)痛貼樣品中薄荷腦提取效果的影響。結(jié)果顯示,6種提取時(shí)間下薄荷腦的測(cè)定值分別為4.69%,5.26%,5.24%,5.31%,5.25%,5.32%,提取時(shí)間不小于1 h時(shí),測(cè)定值變化不大,且和標(biāo)簽值基本一致。從檢測(cè)效率等方面考慮,試驗(yàn)選擇的提取時(shí)間為1 h。

在最優(yōu)試驗(yàn)條件下,DMF、50 mg·L-1薄荷腦標(biāo)準(zhǔn)溶液以及樣品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 DMF、薄荷腦標(biāo)準(zhǔn)溶液以及樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of DMF,menthol standard solution and sample solution

由圖1可知,薄荷腦的保留時(shí)間在5.40 min附近,而16.44 min處的峰為溶劑中雜質(zhì)的峰,不影響薄荷腦的測(cè)定。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照儀器工作條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以薄荷腦的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,薄荷腦標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為10～500 mg·L-1,線性回歸方程為y＝1.928×104x+4.307×104,相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

分別以3 倍、10 倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果分別為0.02,0.07 mg·kg-1。

2.5 精密度試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法制備樣品溶液并連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果為0.61%,說(shuō)明儀器精密度良好。

按照試驗(yàn)方法分析6份同批次樣品,所得測(cè)定值的RSD 為1.4%,說(shuō)明方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法制備樣品溶液并分別放置0,6,12,24,36,48 h 后進(jìn)樣,所得測(cè)定值的RSD 為1.3%,說(shuō)明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)實(shí)際樣品(本底值為94.51 mg·L-1)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)量分別為72,90,108 mg·L-1,每個(gè)加標(biāo)濃度水平重復(fù)測(cè)定3次,計(jì)算回收率。結(jié)果顯示,3個(gè)加標(biāo)濃度水平下的測(cè)定值分別為164.43,184.24,205.37 mg·L-1,所得回收率為97.1%,99.7%,103%,說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度高,適用于凝膠鎮(zhèn)痛貼中薄荷腦含量的測(cè)定。

2.8 方法比對(duì)

分別采用本方法和ChP 2020中薄荷腦粉末的檢測(cè)方法分析10份含薄荷腦5%～6%的凝膠鎮(zhèn)痛貼樣品。結(jié)果顯示,本方法的測(cè)定值為5.23%～5.31%,ChP 2020的測(cè)定值為4.81%～5.14%。

在95%置信度下采用t檢驗(yàn)法驗(yàn)證兩種方法的顯著性差異,所得t值(16.357)大于臨界值t9,0.05(2.262),說(shuō)明兩種方法存在顯著性差異。本方法測(cè)定值高于ChP 2020的,且在標(biāo)簽值范圍內(nèi),說(shuō)明了開(kāi)發(fā)本方法的必要性。

2.9 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析6個(gè)凝膠鎮(zhèn)痛貼樣品,其中前3個(gè)和后3個(gè)樣品中薄荷腦的標(biāo)簽值(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為5%～6%和6.5%～7.5%,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果顯示,6個(gè)樣品中薄荷腦的測(cè)定值分別為5.29%,5.36%,5.31%,4.47%,5.28%,7.14%,除第4個(gè)和第5個(gè)樣品的測(cè)定值顯著低于標(biāo)簽值(6.5%～7.5%),其他樣品的測(cè)定值均和標(biāo)簽值吻合,說(shuō)明溶劑萃取-GC 可作為該類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)控方法。

本工作以溶劑萃取法提取凝膠鎮(zhèn)痛貼中的薄荷腦,以GC測(cè)定其含量,該方法精密度、準(zhǔn)確度好,可用于實(shí)際樣品的檢測(cè),能為鎮(zhèn)痛貼產(chǎn)品的質(zhì)量控制和安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐和保障。