文/劉寧 杜迎春 何亞鵬

細(xì)鱗鮭（）屬鮭形目（Salm oniformes）、鮭科（Salm onidae）、細(xì)鱗魚屬（），是我國名貴的陸封型冷水性珍稀魚類，具有重要的生態(tài)、科學(xué)和社會(huì)價(jià)值。近年來，由于棲息地破壞、環(huán)境污染、過度捕撈等因素的影響，細(xì)鱗鮭在我國的分布區(qū)域急劇縮小，種群數(shù)量銳減，2012年被列為北京市二級(jí)保護(hù)水生野生動(dòng)物，2021年被列為國家二級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物。

棲魚肉桿菌（），也被稱為居魚肉桿菌、居魚乳桿菌。Ross和Toth于1974年首次報(bào)道從感染“擬腎病”的3齡虹鱒分離到棲魚肉桿菌，據(jù)B.Austin等記述，截至1999年該菌引起的魚病曾僅發(fā)生在歐洲和北美，鑒于該菌引發(fā)魚病的報(bào)道極少，尚不清楚其何時(shí)傳入我國。本研究從患病死亡的人工養(yǎng)殖細(xì)鱗鮭體內(nèi)分離得到1優(yōu)勢菌株QY-3，經(jīng)生化鑒定、16S rDNA序列分析確定為棲魚肉桿菌，用該菌感染健康細(xì)鱗鮭能夠引起發(fā)病、死亡，且能夠從病魚體內(nèi)再次分離得到該菌，確定了該菌的致病性。由該菌引起的疾病造成人工養(yǎng)殖細(xì)鱗鮭一定規(guī)模的死亡，給該物種的保護(hù)和恢復(fù)帶來了不利影響。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)用魚

自然患病細(xì)鱗鮭10尾，健康細(xì)鱗鮭24尾，均取自北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心。

2.實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏分析儀、標(biāo)準(zhǔn)藥敏試紙、DNA Marker DL2000、2×Taq PCR Master Mix和瓊脂糖凝膠等。

3.引物

利用oligo6軟件設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rDNA引物27f和1492r，由北京華大科技有限公司合成，引物序列見表1。

高校作為行業(yè)專門人才培養(yǎng)的主體，必須積極應(yīng)對就業(yè)環(huán)境和國際形勢所發(fā)生的變化，在人才培養(yǎng)模式上要注重理論教學(xué)與實(shí)踐能力培養(yǎng)相結(jié)合的人才培養(yǎng)模式，積極探索適合社會(huì)企業(yè)需求的人才培養(yǎng)新機(jī)制。

表1 16S rDNA基因PCR擴(kuò)增引物序列

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.患病魚體的剖檢

無菌條件下按照從外到內(nèi)的順序，對具有典型病癥的細(xì)鱗鮭進(jìn)行臨床檢查，檢查體表、鰓、內(nèi)臟等有無病變。

2.細(xì)菌的分離、純化

無菌條件下，用接種環(huán)蘸取病變部位溢出液，主要集中在鰓、肝、脾等器官組織，采用劃線法接種于TSA平板和5%綿羊血平板上，25℃恒溫培養(yǎng)18h～24h，觀察細(xì)菌的生長狀況及菌落特征，挑選形態(tài)、色澤一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化，反復(fù)純化2次以獲得單菌落，4℃保藏備用。

3.細(xì)菌的生化鑒定

4.16S rDNA基因擴(kuò)增

以分離純化菌液、陽性對照菌液及陰性對照無菌水作為模板，用50μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中引物濃度為10μmol/L，反應(yīng)體系見表2。PCR反應(yīng)條件設(shè)置為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。通過電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并對目的條帶進(jìn)行回收、測序。

表2 PCR反應(yīng)體系

5.人工感染實(shí)驗(yàn)

選取健康細(xì)鱗鮭24尾，分別飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室2個(gè)水循環(huán)控溫魚缸內(nèi)，實(shí)驗(yàn)開始前暫養(yǎng)7d，以適應(yīng)環(huán)境。設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組細(xì)鱗鮭12尾。按照平板計(jì)數(shù)法制成10CFU/mL的細(xì)菌懸液，通過背鰭基部注射方式進(jìn)行感染，注射劑量為0.2mL，對照組注射0.2mL無菌肉湯。以15d作為實(shí)驗(yàn)周期，期間每天觀察受試細(xì)鱗鮭的活力、攝食、發(fā)病癥狀及死亡情況，并做好相關(guān)記錄。最后，對感染發(fā)病細(xì)鱗鮭進(jìn)行剖檢、細(xì)菌分離、PCR鑒定，確定分離細(xì)菌的致病性。

6.藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選取了26種抗菌藥物，根據(jù)美國臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦的K-B瓊脂法進(jìn)行，將培養(yǎng)24h的菌液均勻涂布于檢測平板上，每個(gè)平板貼5張紙片，將平板倒置25℃培養(yǎng)24h，測量抑菌圈直徑，藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按照NCCLs手冊2005版進(jìn)行分析。

二、結(jié)果

（一）病魚的臨床癥狀

該病出現(xiàn)在親魚和產(chǎn)后的細(xì)鱗鮭中，病魚背部體色變暗近黑色，腹部膨脹，皮膚表面有出血點(diǎn)、膿腫，經(jīng)剖檢皮下肌肉出血，鰓、肝臟、腎臟、脾臟等顏色變淺（見圖1）。

圖1 自然患病細(xì)鱗鮭的臨床癥狀

（二）菌落的形態(tài)特征與理化特性

分離菌株QY-3在TSA培養(yǎng)基上生長良好，25℃培養(yǎng)24h～48h，能形成圓形、邊緣整齊、有光澤半透明的菌落，顏色呈微白色至淺米色；在5%綿羊血平板上形成圓形、邊緣整齊、奶油色光滑的菌落，與在TSA平板上的基本一致（見圖2），經(jīng)染色為革蘭氏弱陽性（著色較淺）。經(jīng)BD-PhoenixTM100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定及對比《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（見表3）初步鑒定為棲魚肉桿菌（KC213947.1）。與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》相比，QY-3菌株僅精氨酸雙水解酶、阿拉伯糖、乳糖、木糖、蔗糖的利用上與鑒定手冊上的棲魚肉桿菌標(biāo)準(zhǔn)存在差異，可能與不同分離菌株之間存在差異有關(guān)，具體還有待深入研究。

圖2 分離菌株QY-3在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

表3 分離菌株QY-3的生理生化鑒定

（三）PCR擴(kuò)增結(jié)果

分離菌株QY-3經(jīng)16S rDNA基因擴(kuò)增后的序列條帶如圖3所示，其條帶位置與陽性對照的條帶位置一致，在1500bp左右。將QY-3的16S rDNA基因序列遞交NCBI進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果與GenBank database中棲魚肉桿菌（KC213947.1）具有較高的同源性。這與全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定的結(jié)果一致，即可確定分離菌株QY-3為棲魚肉桿菌。

（四）人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

患病細(xì)鱗鮭精神沉郁，食量減少，病魚失去平衡，離群獨(dú)游，常出現(xiàn)陣發(fā)性急游；體色變暗，背部皮下出血，嚴(yán)重個(gè)體背部膿腫或潰瘍，病魚常用體側(cè)磨蹭池底或池壁，眼球突出。剖檢發(fā)現(xiàn)腹腔積水，肝臟、腎臟有壞死（見圖4），后期實(shí)驗(yàn)組12尾細(xì)鱗鮭全部感染發(fā)病，至15d實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束時(shí)僅有2尾存活且呈垂死狀態(tài)，死亡率極高，詳見表4。對具有典型病癥的細(xì)鱗鮭進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)及16S rDNA基因擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)分離菌株與已鑒定的QY-3一致。由此，診斷棲魚肉桿菌（）為引起細(xì)鱗鮭發(fā)病的病原菌。

表4 QY-3細(xì)鱗鮭人工感染實(shí)驗(yàn)

圖3分離菌株QY-3 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 人工感染細(xì)鱗鮭的臨床癥狀

（五）藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用26種常用抗菌藥物做敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（見表5）顯示，分離菌株QY-3對氨芐西林等10種抗生素敏感；對新霉素和呋喃妥因2種抗生素中度敏感；對羧芐西林等14種藥物耐受。

表5 分離菌株QY-3的藥物敏感性

（六）組織病理學(xué)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)對人工感染發(fā)病細(xì)鱗鮭的肝臟組織切片進(jìn)行了觀察，如圖5所示，肝索結(jié)構(gòu)疏松、紊亂；血管壁破損，內(nèi)皮細(xì)胞脫落壞死；血管內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞出現(xiàn)大量凝集。

圖5 人工感染患病細(xì)鱗鮭的組織病理學(xué)

三、討論

本研究從自然患病的細(xì)鱗鮭中分離得到QY-3菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定為棲魚肉桿菌，通過人工感染實(shí)驗(yàn)、組織病理學(xué)觀察進(jìn)一步證明該菌是引起細(xì)鱗鮭發(fā)病的致病菌，并且發(fā)病癥狀與文獻(xiàn)記載的癥狀基本一致。通過藥物敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌對26種抗生素中的14種表現(xiàn)出耐藥性，因此，在對感染棲魚肉桿菌的細(xì)鱗鮭用藥治療過程中應(yīng)注重抗生素藥物的選取和用量，避免盲目用藥擴(kuò)大其耐藥性。此外，人工感染實(shí)驗(yàn)表明，健康細(xì)鱗鮭從感染到發(fā)病、死亡均要經(jīng)過一定的時(shí)間，在這一時(shí)間段內(nèi)及時(shí)采取用藥等措施，對治愈疾病以及對保護(hù)和恢復(fù)該物種資源具有重要意義。