陶莉，王玉婷

(1.武漢市第四醫(yī)院藥學部，武漢 430033；2.武漢大學藥學院，武漢 430071)

景天祛斑膠囊由黃芪、紅景天、當歸、紅花、珍珠、杜鵑花、制何首烏和枸杞子8味藥材組方而成，用于氣滯血瘀所致黃褐斑、痤瘡的治療[1]。臨床研究表明，景天祛斑膠囊能顯著提高血中超氧化物歧化酶抗氧化活性，增加血氧生成量，凈化血液并增強其流動性，改善微循環(huán)及性激素失調所導致皮膚炎癥，使皮膚微循環(huán)血液充沛、彈性增加，恢復肌膚細胞活力[2]；與谷胱甘肽聯(lián)合用藥可明顯降低黃褐斑患者卵泡雌激素、黃體生成素和雌二醇水平，有效降低患者血清雌激素水平，對黃褐斑臨床治療效果顯著[3-4]；聯(lián)合點陣激光可在短期內(nèi)迅速改善皮損癥狀，有效調節(jié)女性體內(nèi)性激素平衡，療效確切，復發(fā)率低[5-6]。中藥及其制劑，尤其是多味中藥材組成的復方制劑，大多數(shù)藥效物質基礎尚不明確，所含成分復雜多樣，成分間相互協(xié)調、相互制約，現(xiàn)有的單指標成分質量控制模式[1，7-9]難以全面反映其整體質量，嚴重制約了中醫(yī)藥國際化和標準化的進展，依據(jù)中藥質量標志物[10-11]確認原則，建立多指標成分綜合評價模式近年來已逐步應用于中藥復方制劑的質量評價中。本實驗以君藥紅景天所含特征成分紅景天歐素、紅景天寧和大花紅景天素為首選，同時兼顧臣藥當歸所含主要藥效成分阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯，佐藥黃芪所含主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷和毛蕊異黃酮為定量控制指標成分，采用高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫法對上述10種成分含量進行同時測定，并采用SPSS 26.0版統(tǒng)計軟件對所測含量結果進行聚類分析、主成分分析等化學計量學分析，以期為景天祛斑膠囊質量控制和整體評價提供檢測依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；BT25S型電子分析天平(德國Sartorius公司，感量：0.01 mg)；KQ-300型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號：111920-201907，含量：96.8%)對照品來源于中國食品藥品檢定研究院；芒柄花苷(批號：PRF8081121，含量：99.6%)、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷(批號：PRF8101143，含量：99.1%)、毛蕊異黃酮(批號：PRF8062601，含量：99.6%)、大花紅景天素(批號：PRF9031426，含量：99.7%)和歐當歸內(nèi)酯(批號：PRF10021443，含量：97.7%)對照品均來源于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；紅景天歐素(批號：CFS202001，含量：98.0%)和紅景天寧(批號：CFS201802，含量：98.2%)對照品來源于武漢天植生物技術有限公司；阿魏酸松柏酯(批號：17112023，含量：94.4%)和藁本內(nèi)酯(批號：17111023，含量：98.1%)對照品來源于上海同田生物技術股份有限公司。景天祛斑膠囊(規(guī)格：每粒裝0.5 g，批號：06190101，06190103，06190105，06190108，06190201，06190213，06190302，06200219，06200302，06200304，編號依次為S1～S10)來源于青海晶珠藏藥高新技術產(chǎn)業(yè)股份有限公司。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1色譜條件 以乙腈(A)-0.2%甲酸(B)為流動相，梯度洗脫(0～9 min，8.0%A；9～20 min，8.0%→17.0%A；20～32 min，17.0%→35.0%A；32～48 min，35.0%→64.0%A；48～55 min，64.0%→8.0%A)，流速：0.9 mL·min-1；采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃；檢測波長分別為254 nm(0～20 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷和毛蕊異黃酮)[12-14]、382 nm(20～32 min檢測紅景天歐素、紅景天寧和大花紅景天素)[15]和280 nm(32～55 min檢測阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯)[16-17]；進樣量10 μL。

2.2混合對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯對照品各適量，用70%甲醇制成濃度分別為0.836，0.498，0.614，0.362，1.138，0.692，0.116，1.754，1.318和0.172 mg·mL-1的混合對照品貯備液。精密吸取貯備液1.0 mL，用70%甲醇稀釋至20 mL，制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷41.8 μg·mL-1、芒柄花苷24.9 μg·mL-1、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷30.7 μg·mL-1、毛蕊異黃酮18.1 μg·mL-1、紅景天歐素56.9 μg·mL-1、紅景天寧34.6 μg·mL-1、大花紅景天素5.8 μg·mL-1、阿魏酸松柏酯87.7 μg·mL-1、藁本內(nèi)酯65.9 μg·mL-1、歐當歸內(nèi)酯8.6 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備 取景天祛斑膠囊內(nèi)容物細粉2.0 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加70%甲醇20 mL，經(jīng)30 min超聲處理，放涼，用70%甲醇稀釋至刻度，混合均勻，濾過，即得景天祛斑膠囊供試品溶液。取按景天祛斑膠囊質量標準項下處方比例和制備工藝制備的缺黃芪、缺紅景天和缺當歸的3種陰性供試品各適量，按照上述方法分別制成陰性供試品溶液。

2.4系統(tǒng)適用性實驗 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液及“2.3”項4種溶液各10 μL，進樣分析，記錄色譜圖(圖1)。結果景天祛斑膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯峰形對稱，拖尾因子符合《中華人民共和國藥典》(2015年版)規(guī)定；理論板數(shù)按各成分色譜峰計均≥4000；被檢測色譜峰與相鄰色譜峰均能有效分離(分離度>1.5)；陰性供試品對景天祛斑膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯含量的同時測定無干擾。

1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；2.芒柄花苷；3.9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷；4.毛蕊異黃酮；5.紅景天歐素；6.紅景天寧；7.大花紅景天素；8.阿魏酸松柏酯；9.藁本內(nèi)酯；10.歐當歸內(nèi)酯。

2.5含量測定方法學驗證

2.5.1線性關系考察 精密吸取“2.2”項混合對照品貯備液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0和4.0 mL，分別用70%甲醇稀釋至20 mL，制成系列混合對照品溶液，依次注入液相色譜儀，測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯的峰面積，以峰面積(Y)對質量濃度(X，μg·mL-1)進行回歸，得10種成分的回歸方程和線性范圍(表1)。

表1 景天祛斑膠囊中10種成分的回歸方程、相關系數(shù)(r)和線性范圍

2.5.2精密度實驗 精密吸取景天祛斑膠囊(編號：S1)同一份供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，計算得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯峰面積的RSD分別為1.01%，0.97%，0.82%，1.13%，0.68%，0.74%，1.21%，0.53%，0.61%和1.05%。

2.5.3重復性實驗 取同一批次景天祛斑膠囊(編號：S1)，按“2.3”項方法制備供試品溶液并進樣檢測，平行進行6份實驗，計算得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯含量的RSD分別為1.33%，1.69%，1.52%，1.68%，1.29%，1.26%，1.85%，1.12%，1.41%和1.75%。

2.5.4穩(wěn)定性實驗 取景天祛斑膠囊(編號：S1)同一份供試品溶液，于0，2，6，12，18和24 h各進樣10 μL，考察景天祛斑膠囊供試品溶液的穩(wěn)定性，結果該溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.99%，1.02%，0.79%，1.15%，0.74%，0.66%，1.18%，0.55%，0.59%和1.06%。

2.5.5加樣回收率實驗 取已知毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯含量的景天祛斑膠囊(編號：S1)內(nèi)容物細粉9份，每份1.0 g，隨機平分成3組，精密稱定，精密加入混合對照品溶液(毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.297 mg·mL-1、芒柄花苷0.181 mg·mL-1、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷0.219 mg·mL-1、毛蕊異黃酮0.126 mg·mL-1、紅景天歐素0.385 mg·mL-1、紅景天寧0.267 mg·mL-1、大花紅景天素0.039 mg·mL-1、阿魏酸松柏酯0.657 mg·mL-1、藁本內(nèi)酯0.473 mg·mL-1、歐當歸內(nèi)酯0.064 mg·mL-1)1.0，2.0和3.0 mL各一組，再按“2.3”項方法制成加樣供試品溶液，精密吸取上述9種溶液各10 μL，進樣檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯的峰面積并計算10種成分的加樣回收率及RSD值(表2)。

表2 景天祛斑膠囊中10種成分的加樣回收率實驗結果

續(xù)表2 景天祛斑膠囊中10種成分的加樣回收率實驗結果

續(xù)表2 景天祛斑膠囊中10種成分的加樣回收率實驗結果

2.6含量測定結果 取景天祛斑膠囊樣品10批，每批次分別按“2.3”項方法制備供試品溶液3份，注入高效液相色譜儀中檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯的峰面積，計算10種成分的含量(表3)。

表3 景天祛斑膠囊中10種成分含量測定結果

2.7化學計量學分析

2.7.1聚類分析 將“2.6”項景天祛斑膠囊樣品含量測定結果導入SPSS 26.0版軟件，采用組間聯(lián)接系統(tǒng)聚類分析方法，以歐氏距離為測度，對10批景天祛斑膠囊樣品進行聚類分析，得聚類分析樹狀圖(圖2)。由圖2可知，10批景天祛斑膠囊樣品聚為3類，樣品S9、S10和S8聚為第Ⅰ類，樣品S2、S3、S1和S4聚為第Ⅱ類，樣品S6、S7和S5聚為第Ⅲ類。中藥制劑不同于化學藥制劑，其所用中藥材因種屬基源、產(chǎn)地來源、藥材生長年限、采收時節(jié)以及原藥材加工、貯藏等因素影響，直接影響產(chǎn)品的質量和最終療效，從分類結果可以看出，景天祛斑膠囊中目標化合物含量差異與樣品生產(chǎn)期間相關，同一期間生產(chǎn)的產(chǎn)品聚為一類，不同生產(chǎn)期間原藥材的質量差異是其主要因素，重點關注原藥材種屬基源、產(chǎn)地來源等關鍵因素，提示藥品生產(chǎn)企業(yè)加強原藥材源頭質量控制，嚴格控制藥材的進貨渠道，完善藥材內(nèi)控質量標準的建立，同時關注制劑生產(chǎn)過程的參數(shù)控制，從原藥材源頭和生產(chǎn)過程中加強產(chǎn)品質量穩(wěn)定性控制。

圖2 10批景天祛斑膠囊聚類分析樹狀圖

2.7.2主成分分析 采用SPSS 26.0版軟件對10批景天祛斑膠囊樣品進行主成分分析，將“2.6”項景天祛斑膠囊樣品含量測定結果導入軟件，得主成分分析碎石圖(圖3)、特征值和方差貢獻率表(表4)及成分矩陣表(表5)。以累積方差貢獻率>85%、初始特征值>1為提取標準，結果前4個主成分初始特征值均>1，累積方差貢獻率為86.681%，表明提取前4個主成分可代表景天祛斑膠囊10種目標化合物86.681%的信息。從表5成分矩陣結果可以看出，毛蕊異黃酮、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、紅景天歐素和芒柄花苷對主成分1貢獻較大，大花紅景天素、藁本內(nèi)酯、紅景天寧和歐當歸內(nèi)酯對主成分2貢獻較大，阿魏酸松柏酯對主成分3貢獻較大，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對主成分4貢獻較大。采用綜合主成分值(F)評價各指標成分的權重，按照計算公式F=33.370F1+25.582F2+15.950F3+11.778F4(其中33.370，25.582，15.950和11.778分別為主成分1～4的方差貢獻率，F(xiàn)1～F4分別為各目標成分中主成分1～4得分)，計算目標成分綜合主成分值(表5)，結果10種目標成分綜合主成分值從高至低依次為9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、大花紅景天素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、藁本內(nèi)酯、紅景天歐素、阿魏酸松柏酯、紅景天寧和歐當歸內(nèi)酯，建議將綜合主成分值較高的指標成分9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、大花紅景天素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷納入該制劑的質量控制標準中。

圖3 主成分分析碎石圖

表4 主成分特征值和方差貢獻率

表5 成分矩陣表及綜合主成分值

3 討論

3.1目標成分的選擇 景天祛斑膠囊中紅景天、紅花益氣活血、散瘀止痛，共為君藥；當歸補血活血[18]，珍珠解毒生肌、潤膚祛斑，杜鵑花和血解毒，共為臣藥；黃芪補氣升陽、生津養(yǎng)血、斂瘡生肌，制何首烏、枸杞子補肝腎、益精血、化濁降脂，為佐使藥。8味中藥材所含成分相互協(xié)同、相互制約，共奏活血行氣、祛斑消痤的臨床功效?，F(xiàn)代研究表明，紅景天可有效治療黃褐斑、痤瘡、多形性日光疹等多種皮膚病[19]，具有抗氧化、抗輻射、防老化等作用，其中紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素等為其黃酮類主要活性成分；毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷和毛蕊異黃酮等黃酮類為黃芪的代表性成分，具有抗氧化、消除自由基等作用，能夠有效祛斑、美白[20]；阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯等為當歸的代表性成分。依據(jù)中藥質量標志物確認原則，選取上述10種成分作為定量控制目標成分，以期為全面評價景天祛斑膠囊整體質量，確保產(chǎn)品質量和臨床療效一致性提供基礎數(shù)據(jù)。

3.2流動相的選擇 本實驗在流動相優(yōu)化選擇時，參考相關文獻重點考察了乙腈-水[21]、甲醇-水[22-23]、乙腈-甲酸溶液[12-13，16-17]、乙腈-冰醋酸溶液流動相體系。結果顯示以乙腈-甲酸溶液為流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫時，基線平穩(wěn)，10種目標化合物色譜峰的分離度較好。遂進一步對甲酸的濃度(0.1%甲酸[15，17，23]，0.2%甲酸[13，16]和0.3%甲酸[12])以及有機相與水相的洗脫比例進行了優(yōu)化，最終優(yōu)化出乙腈-0.2%甲酸溶液為流動相，按“2.1”項洗脫比例進行梯度洗脫，同時檢測景天祛斑膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯含量。

筆者在本實驗采用HPLC法對景天祛斑膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、紅景天歐素、紅景天寧、大花紅景天素、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯含量進行了同時測定，建立了該制劑高效快速的多指標成分質量控制模式，同時對含量測定結果進行了聚類分析、主成分分析等化學計量學方法分析。本文所建立的測定方法操作簡便，結果準確、可靠，重復性好，為景天祛斑膠囊多指標成分定量控制提供了實驗依據(jù)。從檢測結果可以看出，定量測定目標成分含量存在著一定批間差異，差異有統(tǒng)計學意義，表明建立景天祛斑膠囊多指標成分控制方法對穩(wěn)定產(chǎn)品質量具有重要意義。從聚類分析和主成分分析結果來看，景天祛斑膠囊中目標成分含量差異與該制劑的生產(chǎn)期間相關，提出了引起產(chǎn)品質量差異的可能因素，明確了重點關注的目標成分，為藥品生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門進一步完善該制劑質量控制措施，最終達到產(chǎn)品質量和臨床療效的穩(wěn)定性提供了參考依據(jù)。