袁喜安 戴 旋 鄒 苗 郭玉琳 王超男 顏 彬 吳緒峰 馬全富

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬湖北婦幼保健院腫瘤婦科 湖北 武漢 430070

異位妊娠（ectopic pregnancy，EP）是婦產(chǎn)科常見的急腹癥之一，近年來發(fā)病率有明顯升高的趨勢，目前占所有妊娠的1%～2%［1］，嚴(yán)重影響育齡期女性的生育能力和生命安全。因此，EP的早期診治對(duì)其具有重要的臨床意義［2］。目前臨床上常用的診斷方法是人絨毛膜促性腺激素（HCG）聯(lián)合超聲檢查，但早期異位妊娠臨床表現(xiàn)不典型，診斷較困難，40%～50%的異位妊娠患者在急診初診中被誤診［3］。早期診斷異位妊娠的方法除陰道超聲檢查、診斷性刮宮、腹腔鏡探查等外，檢測患者的血清標(biāo)志物也是常用的預(yù)測方法。本研究旨在對(duì)早期正常宮內(nèi)妊娠者和確診EP患者的血清血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、促血管生成素（angiopoietin，Ang）-1和Ang-2濃度進(jìn)行檢測，探討其在EP診斷中的價(jià)值，從而為臨床提供更為簡便易行、安全可靠的早期診斷方法。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2016—2018年在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬湖北婦幼保健院婦科診斷為異位妊娠的患者53例，依據(jù)病史、體格檢查，結(jié)合B超檢查確診；正常妊娠組來自門診同期就診共50例。兩組在年齡、孕產(chǎn)史、體質(zhì)量指數(shù)、停經(jīng)時(shí)間方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有對(duì)象均排除其他引起VEGF、Ang-1、Ang-2值升高的相關(guān)疾病。該實(shí)驗(yàn)獲得了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，所有研究對(duì)象實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了充分告知并簽字同意。

1.2 方法兩組均未經(jīng)任何治療，就診時(shí)采集空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取血清置于-80℃冰箱待檢。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測定血清中VEGF、Ang-1和Ang-2的含量，試劑盒購自欣博盛生物公司QuantiCyto?Human VEGF ELISA kit（Lot#：H160617-108a）和美國Ray-Bio公司的Ray Bio?Human ANGPT 1 ELISA Kit（Lot#：0617160102）、RayBio?Human ANGPT 2 ELISA Kit（Lot#：0617160224）。ELISA操 作 參照試劑盒說明書，每一樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，使用酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）檢測光密度（OD）值，檢測波長為450 nm。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算未知樣品的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，定量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異性的統(tǒng)計(jì)推斷采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，組間差異性統(tǒng)計(jì)推斷采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。各指標(biāo)診斷效力/價(jià)值的評(píng)價(jià)采用受試者工作特征(ROC）曲線分析，指標(biāo)聯(lián)合診斷的疾病預(yù)測模型及預(yù)測概率值計(jì)算采用二元Logistic回歸。ROC曲線分析及差異的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采用Med Calc 19.1軟件。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異位妊娠組母體外周血中血清VEGF、Ang-1、Ang-2濃度與早期宮內(nèi)妊娠組比較異位妊娠組母體外周血中血清VEGF濃度中位數(shù)234.6 pg/mL，明顯高于早期宮內(nèi)妊娠組（77.3 pg/mL），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而HCG（2 096.0 U/L）和Ang-2（11.8 ng/mL）的血清水平對(duì)比正常早孕組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ang-1在兩組間的血清濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1，異位妊娠組和正常宮內(nèi)早孕組VEGF、Ang-1、Ang-2三指標(biāo)的血清濃度值散點(diǎn)圖分析見圖1。

圖1 異位妊娠和正常早孕組VEGF、Ang-1、Ang-2母體外周血清濃度散點(diǎn)圖***P＜0.05

表1 異位妊娠與正常早孕組相關(guān)指標(biāo)的比較

2.2 ROC曲線分析以評(píng)價(jià)VEGF和Ang-2診斷異位妊娠的效力鑒于VEGF和Ang-2在兩組間的血清濃度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故將其納入ROC曲線分析以評(píng)價(jià)其診斷異位妊娠的效力。通過ROC曲線分析得出，以VEGF單一指標(biāo)診斷異位妊娠的最佳血清濃度截?cái)嘀担╟ut-off值）為196.931 pg/mL（圖2），靈敏度為77.4%，特異度為92.0%，ROC曲線下面積（AUC）為0.889（P＜0.001），陽性預(yù)測值（PPV）為89.1%，陰性預(yù)測值（NPV）為78.9%。以Ang-2單一指標(biāo)診斷異位妊娠的最佳血清濃度截?cái)嘀?為14.075 ng/mL（圖2），AUC為0.854（P＜0.001）。靈敏度、特異度、PPV、NPV分別為79.2%、80.0%、80.8%、78.4%。VEGF和Ang-2聯(lián)合診斷異位妊娠時(shí)ROC的AUC為0.916（P＜0.001），靈敏度、特異度、PPV、NPV分別為81.1%、92.0%、91.5%、82.1%。VEGF+Ang-2聯(lián)合診斷的AUC、靈敏度、特異度、PPV和NPV都較VEGF或Ang-2單獨(dú)診斷時(shí)高（見表2），但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，聯(lián)合診斷的AUC值與VEGF或Ang-2單獨(dú)診斷時(shí)的AUC值差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（VEGFvs聯(lián)合：P=0.146；Ang-2vs聯(lián)合：P=0.052）。見圖2。

表2 VEGF、Ang-2單獨(dú)和聯(lián)合診斷早期異位妊娠的價(jià)值（ROC曲線參數(shù)）

圖2 VEGF、Ang-2單獨(dú)和聯(lián)合診斷EP的ROC曲線

3 討論

目前的數(shù)據(jù)表明，妊娠6～9周的單胎孕婦的稽留流產(chǎn)率約為2%，其發(fā)病因素復(fù)雜，涉及胚胎染色體異常、內(nèi)分泌異常、細(xì)胞凋亡異常、子宮胎盤循環(huán)障礙、環(huán)境因素等多方面。妊娠過程中，從受精卵著床到胎盤形成的每個(gè)階段都與新生血管的生成和豐富的血液供應(yīng)有著密切的關(guān)系。參與血管生成調(diào)節(jié)的因子眾多，其中血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素等在調(diào)節(jié)血管生成中發(fā)揮著重要作用［4，5］。本研究在中國人群中證實(shí)了血清VEGF、Ang-1和Ang-2是可以作為預(yù)測異位妊娠的潛在生物標(biāo)志。

成功的妊娠從胚胎著床到胎盤形成過程離不開血管的重塑，即血管新生及其通透性的改變，在眾多血管生成因子的參與下，滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入母體子宮，侵入子宮螺旋小動(dòng)脈，建立母體與胎兒之間的血管網(wǎng)，從而實(shí)現(xiàn)其營養(yǎng)交換［6］。這一過程中，VEGF-VEGFR、Ang-Tie-2在調(diào)節(jié)血管生成中發(fā)揮著尤為重要的作用，如果這一變化未能按時(shí)、充分發(fā)生，則會(huì)影響胚胎的正常發(fā)育，甚至出現(xiàn)流產(chǎn)。

Ang-1可維持胎盤血管的生長，Ang-2為Ang-1的天然競爭拮抗劑，減小血管的穩(wěn)定性，促進(jìn)血管重塑，兩者共同作用對(duì)胎盤有保護(hù)作用［7］。Ang-2對(duì)血管生成的影響與VEGF有關(guān)，Ang-2單獨(dú)存在時(shí)，可抑制新生血管的形成，并促進(jìn)成熟血管退化；而與VEGF同時(shí)存在時(shí)，則可使血管保持在可塑狀態(tài)，促使內(nèi)皮細(xì)胞出芽以形成新的血管分支，促進(jìn)血管生成和血管重建［8］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)異位妊娠組血HCG（2 096.0 U/L）較正常妊娠組低（6 563.0 U/L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ang-2（11.8 ng/mL）的血清水平對(duì)比正常早孕組（16.8 ng/mL）明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但Ang-1在兩組間的血清濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明Ang-2可作為異位妊娠診斷的一個(gè)輔助性標(biāo)志物。

VEGF有多種功能，而其最主要的作用發(fā)生在血管內(nèi)皮細(xì)胞，高濃度的VEGF與許多生殖過程有關(guān)：如卵泡的生長過程、子宮內(nèi)膜的增生過程已及早孕期妊娠黃體的維持和囊胚著床過程等。在缺氧的條件下VEGF的表達(dá)增加，異位妊娠中VEGF的產(chǎn)生和分泌似乎會(huì)增高，有研究發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層對(duì)管壁的浸潤程度越高，VEGF的水平越高［6］。VEGF可作為宮外孕的診斷標(biāo)志之一。我們研究發(fā)現(xiàn)異位妊娠組血VEGF（234.6 pg/mL），明顯高于正常妊娠組（77.3 pg/mL），這一結(jié)果與VEGF的作用機(jī)制相符。

Felemban等［9］將研究對(duì)象分為宮內(nèi)正常妊娠組、胚胎停育組與輸卵管妊娠組，比較3組VEGF水平后得出結(jié)論，把VEGF水平為200 pg/mL作為鑒別異位妊娠與正常宮內(nèi)孕的截?cái)嘀?，其靈敏度為88%，特異度為100%。我們的研究中將VEGF的Cut-off值設(shè)為大于196.931 pg/mL，診斷為宮外孕的靈敏度為77.4%，特異度為92.0%。結(jié)論同F(xiàn)elemban等［9］的報(bào)道基本一致。Ang-2的單獨(dú)Cutoff值設(shè)為小于14.075 pg/mL，診斷異位妊娠的敏感性和特異性分別是79.2%和80.0%。而兩者聯(lián)合檢測的AUC、靈敏度、特異度、PPV和NPV分別為0.916、81.1%、92.0%、91.5%、82.1%，都 較VEGF或Ang-2單獨(dú)診斷時(shí)高，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)比較，聯(lián)合診斷的AUC值與VEGF或Ang-2單獨(dú)診斷時(shí)的AUC值差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未能提高檢測效率。我們的研究在中國人群中證實(shí)了血清VEGF和Ang-2是可以作為預(yù)測異位妊娠的潛在生物標(biāo)志物，對(duì)超聲及HCG診斷不明的異位妊娠可以起到輔助診斷的作用。