馬維梅，鄭玉才，李志雄，楊 佳，賴世雄，饒開晴

(西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川成都 610041)

家禽與哺乳動物不同，其胚胎發(fā)育所需物質營養(yǎng)均來源于種蛋，而家禽卵黃的營養(yǎng)組成中碳水化合物占比很少。在雞胚發(fā)育后期，雞胚的肺呼吸和肌肉生長需要消耗大量能量，但殘余的卵黃僅能滿足維持需求，機體需動用機體儲存的能量來滿足生長發(fā)育，導致孵化期的弱雛率和死亡率升高，腸道發(fā)育遲緩，生長受阻。雞胚發(fā)育后期，由于基礎代謝增強，肺呼吸、轉身及破殼等活動需要大量能量，而種蛋能量和營養(yǎng)物質的缺乏會限制孵化后期的雞胚發(fā)育，降低種蛋的孵化性能。

近年相關研究表明，生命早期的營養(yǎng)狀況可對動物機體組織、器官的結構和功能產(chǎn)生長期以致終生的程序化影響。種蛋浸泡是早期營養(yǎng)給予的一種方法，國內對于種蛋浸泡的最早研究是在1994年。研究發(fā)現(xiàn)，種蛋在入孵前用抗生素藥液浸泡 20 min，可提高雛雞出雛率和健雛率，維生素B浸泡種蛋可縮短其孵化時間。另有研究表明，黃芪多糖浸泡種蛋可以顯著提高雛雞血清和肝臟組織中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性，降低MDA的含量，從而提高雛雞機體的抗氧化性能。

雞胚在發(fā)育過程中，胚胎期血管生成情況可反映雞胚的生長發(fā)育狀況。研究發(fā)現(xiàn)，高原低氧環(huán)境下蛋內注射硫酸銅可提高胚胎期藏雞和肉雞雞胚尿囊膜上血管生成相關基因VEGF的表達量，促進血管的生成，從而提高血液的運輸效率。人類學相關研究也發(fā)現(xiàn)，VEGF基因表達量影響血管的發(fā)育，而且其基因表達量和血管數(shù)量及血管面積成正相關。另外，機體的生長發(fā)育是由生長激素及其受體GHR調控的。GHR廣泛分布于全身，在肝臟中含量最高，其通過與靶器官上的受體結合誘導產(chǎn)生IGFs，進而調節(jié)機體的生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，蛋內注射IGF-1可顯著提高雞胚胎期的胸肌和腿肌的生長發(fā)育和出雛后的飼料轉化率。

銀耳多糖(tremella polysaccharide，TP)是一種從銀耳中提取的具有生物學活性的天然植物成分，主要由阿拉伯木糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、果糖和半乳糖等組成，具有促進動物生長性能、提高免疫力、改善腸道微生態(tài)、抗氧化、抗腫瘤等功能，且無毒副作用，其添加到飼料中在一定程度上能取代飼用抗生素。在孵化期間，由于雞胚代謝率、氧氣消耗的提高和組織多不飽和脂肪酸水平高，肉仔雞胚胎對氧化應激的敏感性增強，胚胎會利用超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等多種酶來對抗氧化應激。研究發(fā)現(xiàn)，對-半乳糖致亞急性衰老小鼠灌胃100、200、400 mg/kg體質量劑量銀耳多糖溶液，小鼠血清、肝臟、腦組織中的SOD、過氧化氫酶(catalase，CAT)、GSH-Px和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)顯著增強，且MDA含量的異常上升受到明顯抑制，表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。目前，銀耳多糖相關的研究主要集中在多糖的提取及加工方式，對于其在生產(chǎn)中的相關研究多集中于人類學及豬和小鼠，但家禽相關的研究目前未見報道。因此，本研究旨在通過使用銀耳多糖浸泡種蛋，來探討其對雞胚血管生成和雛雞生長性能及抗氧化性能的影響，旨在為銀耳多糖在家禽生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

132枚肉雞種蛋，購買于富瑞康農業(yè)有限公司；銀耳多糖純度90%，購自上海源葉生物科技有限公司。試驗于2021年1月12日至7月20日在西南民族大學動物醫(yī)學實驗室L2-222進行。

1.2 方法

1.2.1 種蛋的浸泡與孵化 挑選質量相近的132枚種蛋，隨機分為3組，每組44枚種蛋，編號，稱質量并記錄。用75%乙醇消毒孵化盤及種蛋，鈍端朝上放入孵化器進行常規(guī)孵化。孵化期間，溫度和濕度的調控及翻蛋參照孵化器說明書進行設定。孵化至7胚齡時，分別采用0、20、40 mg/L銀耳多糖溶液浸泡3組種蛋6 min，浸泡時間參照蘇蘭利方法，8、9胚齡時同樣重復1次，浸泡后繼續(xù)孵化。

1.2.2 14胚齡尿囊膜血管的固定 孵化至13胚齡時隨機選取6枚/組孵化的種蛋，在氣室端開孔，緩慢滴入2 mL甲醇-丙酮(1∶1)混合固定液，固定1 h后，將尿囊膜與殼膜一起剪下，貼在載玻片上，等待風干，在顯微鏡下拍照分析。采用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對顯微鏡下拍照的圖像進行處理并分析，以一定區(qū)域內血管面積與尿囊膜面積的比值及小血管(直徑<50 μm)數(shù)目作為最終參考數(shù)據(jù)。

1.2.3 14胚齡采集尿囊膜 孵化至14胚齡時隨機選取10枚/組孵化的種蛋，采集完整的尿囊膜稱質量并分裝至標記好的EP管內，液氮下速凍，隨后轉入-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 1日齡雛雞生長性能和抗氧化性能的測定 其他種蛋繼續(xù)孵化至出雛，待全部孵出后稱量出雛質量，然后頸部采血，再采集腦組織、肝臟、胸肌、腿肌、小腸并分別稱質量；分裝至1.5 mL離心管中并盡快放入液氮速凍，隨后再轉入-80 ℃冰箱保存。血清和肝臟組織的SOD酶活性、GSH-Px酶活性及MDA含量使用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

1.2.5 基因表達量的測定 提取雞胚絨毛尿囊膜和肝臟的總RNA，并進行總RNA質量鑒定，經(jīng)鑒定RNA質量完整、無降解和污染后，再進行 cDNA的合成和質量檢測，最后實時熒光定量PCR分別檢測絨毛尿囊膜上、mRNA的相對表達量和肝臟、mRNA的相對表達量。以-作為內參，PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 試驗結果

2.1 銀耳多糖浸泡種蛋對雞胚血管生成的影響

2.1.1 13胚齡肉雞 由表2可知，與對照組相比，銀耳多糖低、高濃度組的血管面積/尿囊膜面積的值均顯著高于對照組(<0.05)，高濃度組與低濃度組相比顯著增加(<0.05)；低、高濃度組的小血管數(shù)目和對照組相比均顯著增加，且高濃度組顯著高于低濃度組(<0.05)。

表2 銀耳多糖浸泡種蛋對13胚齡雞胚尿囊膜血管生成的影響

2.1.2 14胚齡肉雞 由表3可知，高濃度組的雞胚尿囊膜mRNA的相對表達量與對照組相比顯著上調(<0.05)，而低濃度組與對照組相比差異不顯著(>0.05)。不同濃度銀耳多糖溶液浸泡種蛋對14胚齡肉雞尿囊膜上mRNA的相對表達量均無顯著影響(>0.05)。

表3 銀耳多糖浸泡種蛋對14胚齡絨毛尿囊膜VEGF和FGF2基因表達的影響

2.2 銀耳多糖浸泡種蛋對胚蛋比和器官指數(shù)的影響

由表4可知，低濃度組肝臟指數(shù)與對照組相比有增加的趨勢(0.05<<0.1)，而其余器官指數(shù)和高濃度組的所有器官指數(shù)與對照組相比差異均不顯著(>0.05)。

表4 銀耳多糖浸泡種蛋對出雛肉雞器官指數(shù)的影響

2.3 銀耳多糖浸泡種蛋對雛雞抗氧化性能的影響

由表5可知，高、低濃度組血清中的MDA含量均顯著低于對照組(<0.05)；與對照組相比，高濃度組血清中的SOD活性有增強的趨勢(0.05<<0.1)，但低濃度組血清中SOD活性并無顯著變化(>0.05)；低、高濃度銀耳多糖組血清中的GSH-Px活性與對照組相比均無顯著差異(>0.05)。

表5 銀耳多糖浸泡種蛋對出雛肉雞血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

由表6可知，與對照組相比，低濃度組和高濃度組肝臟GSH-Px、SOD活性均無顯著差異(>0.05)。與對照組相比，低濃度組肝臟MDA含量顯著降低(<0.05)，高濃度組MDA含量有降低的趨勢。

表6 銀耳多糖浸泡種蛋對出雛肉雞肝臟SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

2.4 銀耳多糖浸泡種蛋對雛雞肝臟IGF-1、GHR mRNA相對表達量的影響

由表7可知，銀耳多糖高濃度組與對照組和低濃度組相比，mRNA相對表達量顯著上調(<0.05)，低濃度組基因表達與對照組相比沒有顯著差異(>0.05)。與對照組相比，銀耳多糖高濃度組mRNA的相對表達量有上調的趨勢(0.05<<0.1)，而低濃度組無顯著變化(>0.05)。

表7 銀耳多糖浸泡種蛋對出雛肉雞肝臟GHR和IGF-1基因表達的影響

3 討論

3.1 銀耳多糖浸泡種蛋對雞胚血管生成的影響

大量研究表明，在胚胎早期給予外源性營養(yǎng)物質能促進胚胎的生長發(fā)育，并且能夠對家禽產(chǎn)生短期或長期潛在的影響。在雞胚發(fā)育過程中，絨毛尿囊膜上豐富的血管是雞胚與外界氣體交換的通道。雞胚通過尿囊膜上密集的血管網(wǎng)也可獲得所需的營養(yǎng)物質，其經(jīng)過血管運送至胚胎各部位加以利用，并排出機體代謝產(chǎn)生CO。相關研究表明，血管生成面積/尿囊膜面積(VA/CAM)的值比較客觀、準確、快速地定量雞胚尿囊膜的血管生成情況。在本試驗中，和對照組相比，20、40 mg/L銀耳多糖溶液浸泡種蛋均顯著增加了絨毛尿囊膜上血管面積和小血管數(shù)量，而且隨著銀耳多糖溶液濃度的增加，其血管生成的效果更加顯著。血管生成數(shù)量與血管生成面積呈正相關，血管面積隨血管數(shù)目的變化而變化。研究發(fā)現(xiàn)，麥冬多糖處理雞胚，顯著提高了絨毛尿囊膜上血管數(shù)量。試驗研究結果和以上研究結果大體一致，但也有不一致之處，如紅花多糖處理雞胚絨毛尿囊膜可以通過抑制腫瘤血管的生成，縮小血管的橫截面積，說明植物多糖影響血管生成的原因可能與多糖種類有關。

血管的生成受多種血管生成因子調控，包括堿性成纖維細胞生長因子FGF2及血管內皮細胞生長因子VEGF。VEGF與胚胎血管的形成是分不開的，一些因素通過影響VEGF的活性或表達，進而影響胚胎期尿囊膜上血管的生成。為探明銀耳多糖溶液促進雞胚血管生成的作用機制，試驗測定了尿囊膜上血管生成相關的因子VEGF和FGF2的相對表達量。結果發(fā)現(xiàn)，高濃度組絨毛尿囊膜上的相對表達量顯著上調，低濃度組基因的相對表達量較對照組相比雖有一定程度的上調，但差異不顯著，蛋白水平是否有差異有待進一步研究；而低、高濃度的銀耳多糖對雞胚尿囊膜上mRNA的表達均無顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)，基因的相對表達量與血管密度呈正相關。研究表明，在培養(yǎng)人靜脈內皮細胞中給予不同劑量的瘦素，能促進細胞增殖，顯著上調細胞基因表達，但基因的相對表達量無顯著變化。也有研究發(fā)現(xiàn)，蛋內注射地塞米松對雞胚絨毛尿囊膜上的表達量無顯著影響。所以，銀耳多糖對雞胚的尿囊膜上血管的作用機制可能是通過上調絨毛尿囊膜上基因的表達，從而促進血管生成，而的相對表達量對血管生成的作用有待進一步研究。

3.2 銀耳多糖浸泡種蛋對雛雞抗氧化性能和生長性能的影響

機體在代謝過程中會產(chǎn)生大量的自由基，其與細胞膜上的不飽和脂肪酸反應，均能損害細胞膜結構，進而影響細胞膜的生物學功能。植物多糖能提高機體的抗氧化功能，它是通過清除機體內產(chǎn)生的多余自由基來抑制細胞內氧化應激，從而減少細胞損傷。在本試驗中，銀耳多糖溶液浸泡種蛋對出雛肉雞體質量、小腸、胸肌、肝臟、腦指數(shù)的影響均不顯著。銀耳多糖溶液浸泡種蛋后，高、低濃度組的出雛肉雞血清MDA含量顯著低于對照組，低濃度組肝臟MDA含量和對照組相比顯著降低。這說明添加銀耳多糖后雛雞氧化產(chǎn)物減少，抗氧化性能增強，雖然出雛雞的血清和肝臟的GSH-Px和SOD活性較對照組相比差異均不顯著，但高濃度組血清SOD活性較對照組有增強的趨勢，其他抗氧化指標有無影響有待進一步研究。研究表明，20 mg/L黃芪多糖溶液浸泡種蛋可顯著提高出雛雞的肝臟和免疫器官的抗氧化性能。也有研究發(fā)現(xiàn)，給-半乳糖致衰老模型小鼠持續(xù)灌胃8周銀耳多糖溶液100、200、400 mg/kg(bw)，小鼠血清、肝臟和腦組織GSH-Px活性、SOD活性和總抗氧化能力均顯著增強。而相關的體外研究也表明，多糖的體外研究試驗以維生素C為對照，比較枸杞多糖、白術多糖、當歸多糖對雞胚肝細胞的抗氧化能力的影響。結果發(fā)現(xiàn)，3種多糖均能抑制過氧化氫引起的雞胚肝細胞活力的降低、細胞內ROS含量升高，提高抗氧化酶活性，從而增強雞胚肝細胞的抗氧化能力。除此之外，蛋內注射500 μL白霉素、抗壞血酸、槲皮素，對肉仔雞的孵化率、早期生長性能和肝臟抗氧化性能均無顯著影響。所以，給予胚胎外源營養(yǎng)素對雛雞的抗氧化性能影響結果的差異可能和雞的品種、不同的營養(yǎng)素及添加量有關。本試驗銀耳多糖溶液浸泡種蛋可通過提高血清SOD活性和降低MDA含量，進而提高出雛肉雞的抗氧化性能。

銀耳多糖是一種酸性雜多糖?；A飼糧中添加戊聚糖可促進肉雞體質量和器官發(fā)育，說明戊聚糖可能作為生理增強劑促進肉雞生長。本試驗結果表明，銀耳多糖浸泡種蛋對雛雞的小腸、肝臟、腦、胸肌等器官指數(shù)沒有顯著影響。但與對照組相比，低濃度組肝臟指數(shù)有增加的趨勢。家禽的生長發(fā)育受神經(jīng)內分泌生長軸調控，主要依賴“下丘腦-垂體-靶器官”。其過程為：下丘腦調控生長激素，通過垂體分泌釋放，經(jīng)血液循環(huán)到達肝臟，與肝細胞膜表面的生長激素受體特異性結合，啟動信號轉導機制，從而促進IGFs基因的表達。肝臟是生長激素最重要的靶器官，也是表達量最高的器官。胰島素樣生長因子1(IGF-1)屬于胰島素樣生長因子家族成員，主要產(chǎn)生于肝細胞，也調控家禽生長發(fā)育和細胞生長。產(chǎn)生的IGF-1可以促進肌肉的生長發(fā)育，加快蛋白質合成。本試驗結果顯示，高濃度銀耳多糖浸泡種蛋，顯著提高了肝臟mRNA的相對表達量；同時，高濃度組肝臟mRNA表達量與對照組相比有增加趨勢。體外研究也表明，IGF-1促進衛(wèi)星細胞的增殖。IGFs系統(tǒng)包括IGF-1、IGF-2等其他因子，肝臟GH通過與肝上的GHR結合誘導產(chǎn)生IGFs，進而調節(jié)機體的生長發(fā)育。本試驗中銀耳多糖多胚蛋比及各器官指數(shù)均無顯著影響，但高濃度銀耳多糖浸泡種蛋上調了與生長軸上相關基因的表達，對出雛后肉雞的生長發(fā)育有無影響仍有待進一步研究。

4 結論

高、低濃度組銀耳多糖溶液浸泡種蛋均能促進肉雞雞胚尿囊膜上血管生成，提高雛雞的抗氧化性能和生長性能，其中，40 mg/L銀耳多糖浸泡種蛋效果較好，但銀耳多糖溶液浸泡種蛋能否促進出雛后肉雞的生長發(fā)育等問題還有待進一步探究。