孫祖浩，所信君，夏賢友，趙爽，竇妍，于春水△

學(xué)習(xí)和記憶與海馬神經(jīng)元內(nèi)基因的協(xié)同表達(dá)有關(guān)［1-2］，而基因表達(dá)受RNA 修飾的調(diào)控。RNA 甲基化是常見修飾，受YTH 蛋白家族N6 甲基腺嘌呤RNA 結(jié)合蛋白1（Ythdf1）、甲基轉(zhuǎn)移酶3（Mettl3）、磷酸化C端結(jié)構(gòu)域相互作用因子1（Pcif1）、脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（Fto）和alkB 同源基因5（Alkbh5）的調(diào)控［3-4］。研究表明，條件性敲除海馬組織Ythdf1或Mettl3可損害小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能［5-6］；慢病毒介導(dǎo)的Mettl3在海馬組織的過表達(dá)或Cre-LoxP系統(tǒng)介導(dǎo)的Fto敲低可導(dǎo)致小鼠小腦發(fā)育異常［7-8］；CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的海馬Fto敲低或短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）干擾介導(dǎo)的表達(dá)下調(diào)內(nèi)側(cè)前額葉皮層Fto可增強(qiáng)小鼠的恐懼記憶［9-10］。Pcif1是新發(fā)現(xiàn)的一種RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，可催化N～6，2′-O-二甲基腺嘌呤（m6Am）的形成［11-12］。敲除HEK293T細(xì)胞的Pcif1可以減少RNA 的m6Am 修飾，從而增加mRNA 的穩(wěn)定性［13-14］；選擇性敲低腫瘤組織Pcif1表達(dá)可以抑制腫瘤發(fā)生和腫瘤組織的化療耐藥性［15］。目前鮮見Pcif1對(duì)學(xué)習(xí)記憶調(diào)節(jié)作用的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探索RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶Pcif1對(duì)海馬相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶的調(diào)控及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 周齡雄性C57BL/6J Nifdc 小鼠27 只，體質(zhì)量25～30 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：

IACUC E2015093）。

1.1.2 主要試劑及儀器AgeⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；Plko.1-puro、pCMV-VSV-G、psPAX2和RS-AAV-CMVNLS-EGFP 質(zhì)粒購(gòu)自連云港市創(chuàng)瑞生物制品貿(mào)易有限公司；異氟烷購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；RIPA 裂解緩沖液、PMSF 和CCK-8 試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蛋白上樣緩沖液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF 膜購(gòu)自德國(guó)默克集團(tuán)；β 分泌酶1（BACE1）、胱天蛋白酶3（Caspase 3）、突觸后致密蛋白95（PSD95）和GAPDH 兔抗鼠一抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；Pcif1、B 細(xì)胞淋巴瘤-2 相關(guān)蛋白X（Bax）、B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）兔抗鼠一抗和羊抗兔二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司；嘌呤霉素購(gòu)自安諾倫（北京）生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和Trizol 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。立體定位注射儀和Morris 水迷宮設(shè)備購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；Western blot實(shí)驗(yàn)設(shè)備購(gòu)自美國(guó)伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；冰凍切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯株式會(huì)社；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)碧迪公司。

1.2 研究方法

1.2.1 在線數(shù)據(jù)庫(kù)查詢Pcif1在大腦的表達(dá)情況 檢索Tabula Muris 數(shù)據(jù)庫(kù)（tabula-muris.ds.czbiohub.org）查詢Pcif1在小鼠大腦常見細(xì)胞中的RNA 表達(dá)水平［16］。檢索Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)查詢Pcif1在小鼠大腦重要區(qū)域的蛋白水平［17］。檢索Human Brain Transcriptome（https://hbatlas.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)查詢Pcif1在人腦重要區(qū)域的從出生到衰老的轉(zhuǎn)錄水平［18］。

1.2.2 shRNA 的設(shè)計(jì)及慢病毒和腺相關(guān)病毒的包裝 靶向小鼠Pcif1的shRNA 序列的引物委托北京擎科生物科技有限公司合成，上游引物：5′-CCGGCCATCCATGTTTCGTGAAATTCTCGAGAATTTCACGAAACATGGATGGTTTTTG-3′；下游引物：5′-AATTCAAAAACCATCCATGTTTCGTGAAATTCTCGAGAATTTCACGAAACATGGATGG-3′。首先，引物退火后與經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的Plko.1-puro質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化后構(gòu)建慢病毒包裝質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證后，與pCMV-VSV-G 及psPAX2 質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞包裝得到慢病毒LV-shPcif1。質(zhì)粒上的shRNA 片段和U6片段被克隆出來，與XbaⅠ和SpeⅠ限制性內(nèi)切酶切開的線性AAV包裝質(zhì)粒（RS-AAV-CMVNLS-EGFP）同源重組，得到的質(zhì)粒進(jìn)行AAV 包裝，得到AAV-shPcif1 和AAV-EGFP。AAV-shPcif1和AAV-EGFP的病毒元件包括反向末端重復(fù)序列、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、增強(qiáng)綠色熒光蛋白和U6 啟動(dòng)子，Pcif1-shRNA 序列為AAV-shPcif1獨(dú)有，病毒使用滴度為3.5×1012vp/mL。

1.2.3 立體定位注射AAV-shPcif1 敲低小鼠海馬Pcif1小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組：Pcif1敲低組（注射AAVshPcif1）、假手術(shù)組（注射AAV-EGFP）和野生組（不做任何處理）。異氟烷麻醉小鼠，小鼠頭部被固定在立體定位儀上，切開小鼠頭皮暴露顱骨，并保持前后囟門的高度差和矢狀縫左右10 mm 處的高度差均在0.3 mm 以內(nèi)。使用手持顱鉆鉆開顱骨，微量注射器在左右背側(cè)海馬CA1區(qū)，即前囟后2.0 mm、矢狀縫左右1.5 mm以及腦組織下1.0 mm處分別注射1 μL病毒，注射速率為100 nL/min。注射完成后常規(guī)飼養(yǎng)小鼠3周，使病毒充分表達(dá)。小鼠全腦冰凍切片熒光成像確認(rèn)病毒進(jìn)入海馬組織，Western blot驗(yàn)證Pcif1的敲低效率。

1.2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試小鼠空間學(xué)習(xí)記憶 立體定位注射3 周后對(duì)小鼠進(jìn)行Morris 水迷宮測(cè)試，步驟參照文獻(xiàn)［19-20］，觀察小鼠在平臺(tái)可視期（第1天）的游泳速度、在訓(xùn)練期（第2～6天）的逃避時(shí)間以及在測(cè)試期（第7天）的跨平臺(tái)次數(shù)和目的象限停留時(shí)間。

1.2.5 Western blot檢測(cè)海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解緩沖液和PMSF 提取海馬組織蛋白。蛋白產(chǎn)物經(jīng)4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集上清液。按4∶1的體積比例加入上樣緩沖液，95 ℃加熱15 min使蛋白變性。對(duì)變性蛋白溶液行聚丙烯酰胺凝膠電泳以分離蛋白，蛋白溶液的上樣量根據(jù)Western blot預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的內(nèi)參蛋白的濃度進(jìn)行調(diào)整。電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉60 min。然后將PVDF膜切割成合適大小的條帶，將條帶置于兔源Pcif1（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）、BACE1（1∶1 000）、Caspase 3（1∶2 000）、PSD95（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）一抗中4 ℃孵育過夜。次日回收一抗，PBST洗膜3次，加入羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育60 min?；厥斩?，PBST洗膜3次，滴加ECL曝光液，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像。

1.2.6 構(gòu)建穩(wěn)定敲低Pcif1的HT22細(xì)胞系 使用LV-shPcif1感染HT22 細(xì)胞（感染復(fù)數(shù)=1），完成感染后使用嘌呤霉素篩選細(xì)胞得到穩(wěn)定敲低Pcif1的HT22 細(xì)胞（HT22-shPcif1 組）。使用對(duì)照慢病毒感染HT22細(xì)胞并進(jìn)行篩選，得到對(duì)照HT22細(xì)胞（HT22-Ctrl組）。Western blot鑒定2組細(xì)胞Pcif1表達(dá)水平，方法參照1.2.5。

1.2.7 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq） 使用Trizol 試劑提取HT22-Ctrl 組和HT22-shPcif1 組細(xì)胞總RNA，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)樣本，所有樣本RNA的完整度值均≥9.7。RNA質(zhì)控及測(cè)序工作委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。使用Trim Glore 預(yù)處理RNA-seq 原始數(shù)據(jù)，使用Kallisto 將測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到mouse genome（vM25）參考基因組?；虿町惐稊?shù)＞1且FDR 校正后P＜0.05 的基因定義為差異表達(dá)基因。在ToppGene Suite（http://toppgene.cchmc.org）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，富集結(jié)果進(jìn)行FDR 多重比較校正（P＜0.05）［21］。

1.2.8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 提前將HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細(xì)胞分別置于400 μmol/L H2O2條件下培養(yǎng)2 d，然后在0、12、24、36 和48 h 時(shí)間點(diǎn)使用CCK-8探針孵育細(xì)胞，方法參考CCK-8 試劑盒說明書，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值，繪制細(xì)胞的增殖曲線。

1.2.9 細(xì)胞劃痕檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 方法參考文獻(xiàn)［22］，將HT22-shPcif1組和HT22-Ctrl組細(xì)胞分別接種到6孔板，接種密度為1×105/孔。待細(xì)胞擴(kuò)增到相互接觸形成單層細(xì)胞薄層時(shí)，使用100 μL 的槍頭劃痕，在劃痕后0 h 和36 h，在顯微鏡下觀察并拍攝多個(gè)位置的細(xì)胞遷移狀態(tài)。使用Photoshop CC2014軟件測(cè)量空白區(qū)域的面積，計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕面積-36 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 HT22-shPcif1 組和HT22-Ctrl組分別在400 μmol/L H2O2條件下培養(yǎng)2 d后，使用異硫氰酸熒光素（FITC）和碘化丙啶（PI）染劑孵育細(xì)胞，完成孵育的細(xì)胞在1 h 內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞總的凋亡水平，即早期和晚期凋亡細(xì)胞百分比之和。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 除了RNA-seq 數(shù)據(jù)以外的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2 組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；3 組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey’s 檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Pcif1在小鼠大腦內(nèi)的表達(dá)水平 通過查詢公共數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，Pcif1在大腦中呈時(shí)空表達(dá)。Tabula Muris 數(shù)據(jù)庫(kù)提示Pcif1在少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、Bergmann 膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)較高，見圖1A。檢索Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，Pcif1在小鼠大腦的多個(gè)腦區(qū)和核團(tuán)中均有表達(dá)，表達(dá)量由高到低依次為嗅覺皮層、杏仁核、海馬、大腦皮層、小腦、基底神經(jīng)節(jié)、腦橋和髓質(zhì)、丘腦、中腦和下丘腦，見圖1B。檢索Human Brain Transcriptome數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，Pcif1在胚胎期高表達(dá)，出生后略有下降，但在整個(gè)生命過程中一直保持相對(duì)穩(wěn)定的高表達(dá)，見圖1C。

Fig.1 Pcif1 related expression data from Tabula Muris,Human Protein Atlas and Human Brain Transcriptome datasets圖1 Tabula Muris,Human Protein Atlas和Human Brain Transcriptome數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)Pcif1的表達(dá)數(shù)據(jù)

2.2 敲低海馬Pcif1對(duì)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶的影響 立體定位注射3 周后，小鼠冰凍腦切片熒光成像在海馬CA1區(qū)觀察到綠色熒光，提示建模成功，見圖2。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的第1天（平臺(tái)可視期），3 組小鼠的游泳速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在第5 天（訓(xùn)練期），敲低組的逃避時(shí)間短于假手術(shù)組（P＜0.05）；在第6 天（訓(xùn)練期），敲低組的逃避時(shí)間短于野生組（P＜0.05）；在第7 天（測(cè)試期），敲低組小鼠的目的象限時(shí)間顯著長(zhǎng)于其他2組，此時(shí)3組跨平臺(tái)次數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3、表1。

Fig.2 Representative fluorescence image of frozen mouse brain section(×25)圖2 小鼠冰凍腦切片熒光成像圖（×25）

Fig.3 Representative swimming paths of mice from 3 groups圖3 3組小鼠水迷宮測(cè)試游泳軌跡圖

2.3 與敲低HT22細(xì)胞Pcif1有關(guān)的差異表達(dá)基因及其功能注釋 與HT22-Ctrl組比較，HT22-shPcif1組細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)2 065 個(gè)差異表達(dá)基因，其中84 個(gè)基因顯著上調(diào)，74個(gè)基因顯著下調(diào)，見表2、圖4。功能富集分析顯示，表達(dá)上調(diào)基因在4 類分子功能、118個(gè)生物學(xué)過程和4 種細(xì)胞成分中顯著富集，主要與細(xì)胞凋亡、遷移和增殖有關(guān)；表達(dá)下調(diào)基因主要在6類分子功能和42個(gè)生物學(xué)過程富集，見圖5。

2.4 HT22-shPcif1 組細(xì)胞在正常環(huán)境下遷移能力的變化及H2O2環(huán)境下凋亡和增殖能力的變化 Western blot 結(jié)果證實(shí)，HT22-shPcif1 組細(xì)胞中Pcif1表達(dá)較HT22-Ctrl組明顯下調(diào)，見圖6。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常培養(yǎng)條件下HT22-shPcif1 組細(xì)胞的遷移率比HT22-Ctrl 組更高（P＜0.01），見圖7、表3。在400 μmol/L H2O2條件下培養(yǎng)48 h 后，CCK-8 實(shí)驗(yàn)顯示HT22-shPcif1 組細(xì)胞的增殖能力高于HT22-Ctrl 組，見圖8；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，HT22-shPcif1 組細(xì)胞的凋亡率相比HT22-Ctrl 組顯著降低（P＜0.01），見圖9、表3。

Tab.1 Morris water maze results of 3 groups of mice表1 3組小鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果 （n=9）

Tab.2 Differentially expressed genes of HT22-shPcif1表2 HT22-shPcif1差異表達(dá)基因

Fig.4 Volcano plot of differentially expressed genes of HT22-shPcif1圖4 HT22-shPcif1差異表達(dá)基因火山圖

Fig.5 GO analysis of differentially expressed genes of HT22-shPcif1圖5 HT22-shPcif1差異表達(dá)基因GO分析

Fig.6 Protein levels of Pcif1 in HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells measured by Western blot assay圖6 Western blot檢測(cè)HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細(xì)胞的Pcif1蛋白水平

Fig.7 Comparison of migration between HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells(×100)圖7 HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細(xì)胞遷移的比較（×100）

Tab.3 Comparison of cell migration and apoptosis of HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells表3 HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細(xì)胞遷移和凋亡比較 （n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of cell migration and apoptosis of HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells表3 HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細(xì)胞遷移和凋亡比較 （n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01。

Fig.8 Growing curves of HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells under 400 μmol/L H2O2 condition圖8 400 μmol/L H2O2條件下HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

Fig.9 Comparison of apoptosis measured by flow cytometry between HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells under 400 μmol/L H2O2 condition圖9 400 μmol/L H2O2條件下流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細(xì)胞凋亡比較

2.5 敲低Pcif1 促進(jìn)小鼠海馬組織中抗凋亡蛋白的表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，與野生組和假手術(shù)組相比，敲低組小鼠海馬組織Pcif1 的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；抗凋亡蛋白Bcl-2 顯著上調(diào)（P＜0.05），促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。敲低組BACE-1 蛋白的表達(dá)較野生組和假手術(shù)組顯著上調(diào)；PSD95 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖10、表4。

Fig.10 The relative expression of Pcif1,Bcl-2,Bax,Caspase3,BACE-1 and PSD95 in hippocampal tissues of three groups of mice measured by Western blot assay圖10 Western blot檢測(cè)3組小鼠海馬組織Pcif1、Bcl-2、Bax、Caspase3、BACE-1和PSD95的相對(duì)表達(dá)

3 討論

3.1Pcif1在小鼠的大腦的主要區(qū)域終生維持較高的表達(dá)水平 公共數(shù)據(jù)庫(kù)提供的信息表明，無論是基因還是蛋白質(zhì)水平，Pcif1在小鼠大腦中均保持較高的表達(dá)水平。在人腦中，Pcif1終生維持較高的表達(dá)水平，由于Pcif1具有高度的進(jìn)化保守性［23］，其在小鼠的大腦中也應(yīng)該終生表達(dá)。Pcif1的廣泛表達(dá)與m6Am在小鼠腦內(nèi)的廣泛分布具有一致性［24］。據(jù)此可以推測(cè)，Pcif1能夠像其他RNA甲基化調(diào)節(jié)蛋白酶一樣，對(duì)大腦的生理功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。

3.2 敲低海馬Pcif1的表達(dá)能夠促進(jìn)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶 本研究發(fā)現(xiàn)，Morris 水迷宮測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相反，敲低海馬組織的Pcif1促進(jìn)了小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。以往研究表明，其他RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和RNA 甲基位點(diǎn)結(jié)合蛋白對(duì)大腦的可塑性和學(xué)習(xí)記憶起有益的調(diào)節(jié)作用，而RNA去甲基化酶則起不利的調(diào)節(jié)作用。例如，在小鼠腦組織敲低Mettl3會(huì)導(dǎo)致小腦發(fā)育異常，并提高小腦內(nèi)新生的顆粒細(xì)胞的凋亡水平［25］；條件性敲除海馬組織的Mettl3和YTHDF1會(huì)損害小鼠的長(zhǎng)期記憶形成［5-6］；下調(diào)海馬組織的Fto可增強(qiáng)小鼠的恐懼記憶［9］?？傮w來說，RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)小鼠的認(rèn)知能力，這是因?yàn)槠淠艽呋⒕S持RNA甲基化修飾，從而對(duì)相關(guān)基因的RNA 翻譯和RNA 定位起正向調(diào)節(jié)作用［26］。Pcif1對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的調(diào)控與其他RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶相反，可能是由于催化的RNA 甲基化種類不同，Pcif1催化形成m6Am，而Mettl3催化形成m6A。m6Am 修飾僅發(fā)生在mRNA 的5′端帽子結(jié)構(gòu)后的第1 個(gè)腺嘌呤上，而m6A 修飾主要發(fā)生在mRNA 的3′未翻譯區(qū)域和終止密碼子的腺嘌呤上。m6A是哺乳動(dòng)物mRNA 最常見的修飾，而m6Am 的含量只占m6A 含量的1/30～1/10。m6Am 和m6A 修飾的位置及含量的差異可能會(huì)導(dǎo)致甲基基團(tuán)對(duì)mRNA理化性質(zhì)影響不同，最終影響基因的表達(dá)以及小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的表現(xiàn)。

3.3 敲低Pcif1會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡、遷移和增殖發(fā)生變化 對(duì)HT22-shPcif1 細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq 分析，發(fā)現(xiàn)了許多差異表達(dá)基因，這些基因能夠富集到細(xì)胞凋亡、遷移和增殖等通路，提示Pcif1對(duì)細(xì)胞凋亡、遷移和增殖等重要功能具有調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了RNA-seq 的預(yù)測(cè)結(jié)果，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明敲低Pcif1后細(xì)胞的遷移、增殖能力提高，細(xì)胞凋亡水平下降。海馬組織的Western blot 結(jié)果表明敲低Pcif1會(huì)促進(jìn)海馬組織內(nèi)的抗凋亡蛋白的表達(dá)，該結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致，表明敲低Pcif1可通過上調(diào)抗凋亡蛋白降低細(xì)胞的凋亡水平。

Tab.4 Comparison of hippocampal relative protein levels of Pcif1,Bcl-2,Bax,Caspase3,BACE-1 and PSD95 of three groups of mice表4 3組小鼠海馬組織Pcif1、Bcl-2、Bax、Caspase3、BACE-1和PSD95蛋白相對(duì)水平 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of hippocampal relative protein levels of Pcif1,Bcl-2,Bax,Caspase3,BACE-1 and PSD95 of three groups of mice表4 3組小鼠海馬組織Pcif1、Bcl-2、Bax、Caspase3、BACE-1和PSD95蛋白相對(duì)水平 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與野生組比較，b與假手術(shù)組比較，P＜0.05。

3.4Fgf21是潛在的Pcif1影響學(xué)習(xí)記憶的中介因子 有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gf21具有神經(jīng)保護(hù)作用，能在體內(nèi)和體外降低細(xì)胞凋亡水平［27］，而神經(jīng)元凋亡水平升高會(huì)損害個(gè)體的認(rèn)知功能［28］；敲除Fgf21會(huì)降低上皮細(xì)胞遷移和傷口愈合速率［29］，而神經(jīng)元遷移可以促進(jìn)長(zhǎng)期記憶的形成［30］；上調(diào)Fgf21的表達(dá)會(huì)促進(jìn)海馬神經(jīng)元再生［31］，足夠的正常神經(jīng)元對(duì)于維持突觸網(wǎng)絡(luò)和信息傳遞至關(guān)重要。另外，給AD大鼠注射外源性Fgf21會(huì)緩解AD 大鼠的記憶障礙和降低磷酸化tau 表達(dá)及氧化應(yīng)激［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低Pcif1會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的遷移、抗凋亡和增殖等功能，這與上調(diào)Fgf21對(duì)細(xì)胞功能的影響一致。RNA-seq 也證實(shí)了Fgf21在HT22-shPcif1 細(xì)胞中的表達(dá)量顯著增加了1.86 倍，進(jìn)一步增加了Fgf21是中介因子的可能性。筆者下一步計(jì)劃在海馬共同敲低Pcif1和Fgf21，研究其對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響；在HT22細(xì)胞上共同敲低Pcif1和Fgf21，研究其對(duì)細(xì)胞遷移、增殖和凋亡的影響，明確Fgf21是否為敲低Pcif1促進(jìn)空間學(xué)習(xí)記憶的中介因子。

綜上所述，敲低海馬RNA甲基轉(zhuǎn)移酶Pcif1對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)是有利的，在細(xì)胞水平，能夠上調(diào)抗凋亡蛋白表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖；在動(dòng)物水平，能夠促進(jìn)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。