馬 琳, 朱衛(wèi)芳, 占繡萍, 陳建波, 趙 莉*,

(1. 上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201103；2. 上海市青浦區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201700)

藍(lán)莓Semen trigonellae屬于杜鵑花科越橘屬植物，世界糧農(nóng)組織將其推薦為五大健康水果之一[1]，市場前景持續(xù)看好。2019 年中國藍(lán)莓種植面積達(dá)到6.03 萬hm2，年產(chǎn)值約41 億元，主要產(chǎn)區(qū)分布在山東、貴州、遼寧、浙江、湖北、四川、云南等27 個(gè)省份，預(yù)計(jì)2026 年我國將超越北美成為全球第一藍(lán)莓生產(chǎn)國[2]。隨著藍(lán)莓在中國商業(yè)化種植面積和年限的不斷增加，藍(lán)莓病蟲害特別是病害逐年加重，種類增多，呈多元化發(fā)生態(tài)勢，嚴(yán)重影響了藍(lán)莓產(chǎn)量和產(chǎn)業(yè)發(fā)展[3-5]。

除選用抗病品種、輪作換茬、避雨栽培等常規(guī)措施外，藥劑防治仍然是主要措施[3-6]。據(jù)查閱“中國農(nóng)藥信息網(wǎng)”[7]，截至2021 年11 月30 日，中國尚未有農(nóng)藥在藍(lán)莓上獲得登記許可，生產(chǎn)中農(nóng)民只能憑經(jīng)驗(yàn)用藥，導(dǎo)致藍(lán)莓上安全合理用藥問題較大。此外，中國藍(lán)莓采收期長達(dá)3 個(gè)多月，每日連續(xù)采收，且其果實(shí)沒有外果皮，屬于直接入口的鮮食水果，因此給藍(lán)莓的食用安全帶來了極大的風(fēng)險(xiǎn)。

嘧霉胺 (pyrimethanil，圖式1) 屬苯基氨基嘧啶類殺菌劑，可用于黃瓜、草莓、韭菜等作物上防治灰霉病[8-10]。付巖等[11]進(jìn)行了保護(hù)地草莓中嘧霉胺殘留的膳食風(fēng)險(xiǎn)評估，結(jié)果表明，噴施嘧霉胺后 3～7 d 內(nèi)的草莓對 2～4 歲、18～30 歲和 60～70 歲人群的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)都很低，均在可接受范圍之內(nèi)。鑒于灰霉病菌容易產(chǎn)生抗藥性[12]，本研究選擇在上海市藍(lán)莓生產(chǎn)中已有使用的嘧霉胺進(jìn)行了殘留試驗(yàn)，并就其在藍(lán)莓中的膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估，旨在為制定其在藍(lán)莓上的安全合理使用間隔期及其最大殘留限量 (maximum residue limits，MRL) 標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖式1 嘧霉胺結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of pyrimethanil

1 材料與方法

1.1 主要儀器和藥劑

1290 超高效液相色譜儀及 G6460 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 (UPLC-MS/MS，美國 Agilent 公司)；Milli-Q 超純水儀 (美國 Millipore 公司)；T18 ULTRATURRAX 高速勻漿機(jī) (德國 IKA 集團(tuán))；MP1000B百分之一天平 (上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司) 等。

98.5% 嘧霉胺 (pyrimethanil) 標(biāo)準(zhǔn)品 (上海市農(nóng)藥研究所有限公司)；400 g/L 嘧霉胺懸浮劑(pyrimethanil 400 g/L SC，拜耳作物科學(xué) (中國) 有限公司)。乙腈和甲醇均為色譜純，氯化鈉為分析純。

1.2 田間試驗(yàn)

按照《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[13]和《農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)區(qū)域指南》[14]，400 g/L 嘧霉胺SC 在藍(lán)莓中的規(guī)范殘留試驗(yàn)于2021 年在上海市松江區(qū)新浜鎮(zhèn)進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)處理和對照區(qū)，每小區(qū)8 株藍(lán)莓樹，小區(qū)間設(shè)保護(hù)帶。400 g/L 嘧霉胺SC 施藥劑量為有效成分360 g/hm2，于藍(lán)莓灰霉病發(fā)生初期噴霧施藥2 次，施藥間隔7 d (參照嘧霉胺在草莓上的推薦施藥要求進(jìn)行試驗(yàn))。分別于末次施藥后3、5、7 和10 d 采用隨機(jī)取樣法采集藍(lán)莓樣本。每次在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)8 株藍(lán)莓植株的上、下、左、右采集藍(lán)莓果實(shí)2 份，每份不少于2 kg，除去果柄后，四分法縮分留樣250 g 兩份，于 -20 ℃保存，備用。

1.3 殘留分析方法

1.3.1 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取10 g (精確至0.1 g)藍(lán)莓樣品至100 mL 具塞塑料離心管內(nèi)，加入10 mL乙腈，高速勻漿1 min；加入6 g 氯化鈉，劇烈振蕩1 min 后于4 000 r/min 下離心5 min；取1 mL 上清液，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，供UPLC-MS/MS 檢測。

1.3.2 檢測條件

色譜條件：Agilent Proshell 120 EC-C18不銹鋼色譜柱 (3 mm × 100 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相 A 為體積分?jǐn)?shù) 0.1% 的甲酸水溶液，流動(dòng)相 B 為甲醇；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量 2 μL；流速 0.4 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

質(zhì)譜條件：ESI 源正離子模式電離 (ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流量12 L/min；霧化氣壓力 0.28 MPa；毛細(xì)管電壓3 000 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流量7 L/min。嘧霉胺定性離子對 (m/z)：200.1/107.0 及200.1/183.0，定量離子對 (m/z) 200.1/107.0，碎裂電壓120 V，碰撞能量25/25 V。

1.3.3 方法的靈敏度及正確度 準(zhǔn)確稱取適量嘧霉胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再分別用藍(lán)莓空白基質(zhì)溶液和甲醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L 的藍(lán)莓基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按照1.3.2 節(jié)條件進(jìn)行測定，以嘧霉胺的進(jìn)樣質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積 (y) 為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。

向藍(lán)莓空白樣品中分別添加0.01、0.1 和1.0 mg/kg 3 個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，測定添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)，每個(gè)水平重復(fù)5 次，以空白樣品作對照。按照1.3.1 節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，按照1.3.2 節(jié)條件測定，以最低添加水平為方法的定量限 (LOQ)。

1.4 基于規(guī)范殘留試驗(yàn)數(shù)據(jù)的長期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估

以聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署/糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(UNEP/FAO/WHO) 食品污染和監(jiān)控程序 (GEMS/FOOD) 的居民膳食調(diào)查數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，按公式(1) 計(jì)算各農(nóng)藥的國家估算每日攝入量 (national estimated daily intake，NEDI) ，單位為μg/(kg bw·d)，按公式(2)計(jì)算各農(nóng)藥的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)商(chronic risk quotient，CRQ)，當(dāng)CRQ≤1時(shí)，表示風(fēng)險(xiǎn)可以接受，數(shù)據(jù)越小，風(fēng)險(xiǎn)越??；當(dāng)CRQ＞1 時(shí)，表示風(fēng)險(xiǎn)不可接受，數(shù)據(jù)越大，風(fēng)險(xiǎn)越大[15-19]。

式中：STMR (supervised trials median residue)為規(guī)范試驗(yàn)殘留中值，mg/kg；Fi(food intake)為農(nóng)產(chǎn)品的消費(fèi)量，g/d[20]；bw (body weight)表示人群平均體重，kg[20]。ADI (allowable daily intake) 為每日允許攝入量，mg/(kg bw·d)[21]。

鑒于目前僅有嘧霉胺在藍(lán)莓一種食用農(nóng)產(chǎn)品上的殘留數(shù)據(jù)，并無其他登記作物上的STMR 值，無法計(jì)算其包含所有登記作物在內(nèi)的膳食暴露NEDI值，因此，只計(jì)算藍(lán)莓中嘧霉胺殘留膳食暴露占NEDI 的份額及對全膳食風(fēng)險(xiǎn)的貢獻(xiàn)率 (CRQ%)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的靈敏度及正確度

結(jié)果 (表2) 表明：在0.005～1 mg/L 范圍內(nèi)，嘧霉胺的質(zhì)量濃度與其響應(yīng)值間呈良好線性關(guān)系，R2在0.998 1～0.999 9 之間。

添加回收試驗(yàn)結(jié)果 (表2) 表明：嘧霉胺在藍(lán)莓中的平均回收率在97%～100%之間，RSD≤12%，方法定量限為0.01 mg/kg。本研究所建立的殘留檢測方法可滿足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[13]的要求，適用于嘧霉胺在藍(lán)莓中的殘留分析。

表2 嘧霉胺在藍(lán)莓中的添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、線性方程及定量限Table 2 The spiked recoveries，RSDs，linear equation and LOQ of pyrimethanil in blueberries

2.2 消解動(dòng)態(tài)

消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果 (表3) 表明：嘧霉胺在藍(lán)莓中的消解規(guī)律符合一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。整個(gè)試驗(yàn)過程中，嘧霉胺在藍(lán)莓中的殘留量呈遞減趨勢，其消解速率較快，藥后1 d，消解率為50%左右，藥后10 d，消解率達(dá)90%以上，半衰期僅為3.2 d。

表3 嘧霉胺在藍(lán)莓中的消解動(dòng)態(tài)Table 3 Dissipation of pyrimethanil in blueberries

2.3 最終殘留量

最終殘留量數(shù)據(jù)見表4。隨著時(shí)間的延長，嘧霉胺在藍(lán)莓中的殘留量逐漸降低，與消解動(dòng)態(tài)規(guī)律一致。

表4 嘧霉胺在藍(lán)莓中的最終殘留量Table 4 Terminal residues of pyrimethanil in blueberries

400 g/L 嘧霉胺SC 按照有效成分360 g/hm2劑量施藥2 次，間隔7 d，距最后1 次施藥3、5、7 和10 d 分別采樣測定，藍(lán)莓中嘧霉胺的殘留量在0.18～1.54 mg/kg 之間。目前，中國規(guī)定嘧霉胺在藍(lán)莓上的最大殘留限量 (MRL) 為8 mg/kg[22]。本研究中，末次施藥后3、5、7 和10 d 采收的藍(lán)莓樣品中嘧霉胺的殘留量均未超標(biāo)。鑒于在采收期，藍(lán)莓每日連續(xù)采收，本研究采用末次施藥后3、5、7 和10 d 藍(lán)莓樣品中的殘留量數(shù)據(jù)對嘧霉胺進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。

2.4 長期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)

JMPR 規(guī)定，嘧霉胺的ADI 值為0.2 mg/kg bw[21]，結(jié)合本研究規(guī)范殘留試驗(yàn)獲得的殘留中值(表4)，以及GEMS/FOOD 中各年齡段居民97.5%位點(diǎn)的漿果類農(nóng)產(chǎn)品膳食消費(fèi)量及體重調(diào)查數(shù)據(jù)[20]，計(jì)算末次施藥后3～10 d 攝入藍(lán)莓中嘧霉胺殘留對各類消費(fèi)人群長期暴露風(fēng)險(xiǎn)商 (CRQ) 的貢獻(xiàn)率(CRQ%) (表5)。從表5 中數(shù)據(jù)可見：對于各類消費(fèi)人群，藍(lán)莓中嘧霉胺殘留量對風(fēng)險(xiǎn)商的貢獻(xiàn)率普遍較低，僅為0.002 4%～0.079%。該結(jié)果顯示，藍(lán)莓生產(chǎn)中按規(guī)定施用嘧霉胺不會(huì)對各消費(fèi)人群產(chǎn)生長期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)。

表5 藍(lán)莓中嘧霉胺殘留的長期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果Table 5 The results of long-term dietary intake risk assessment of pyrimethanil in blueberries

3 結(jié)論與討論

目前，嘧霉胺在中國尚未獲得在藍(lán)莓上的登記許可，國內(nèi)也暫無嘧霉胺在藍(lán)莓上殘留狀況的研究報(bào)道。本研究中田間殘留試驗(yàn)施藥濃度以上海地區(qū)藍(lán)莓種植戶實(shí)際生產(chǎn)中使用的劑量為基礎(chǔ)，參考登記信息中相近農(nóng)作物 (草莓) 上的推薦施用劑量，設(shè)定的施藥濃度原則上能滿足生產(chǎn)上病蟲害防治的需要。

消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明：400 g/L 嘧霉胺SC 在藍(lán)莓上的半衰期為3.2 d，藥后10 d 消解率達(dá)到90%以上。賈春虹等[23]報(bào)道，嘧霉胺SC 在草莓上的半衰期為4.1～7.5 d，表明嘧霉胺在藍(lán)莓和草莓上的消解速率基本一致。

400 g/L 嘧霉胺SC 按有效成分360 g/hm2劑量施藥2 次，每次間隔7 d，藥后3、5、7 、10 d時(shí)藍(lán)莓中嘧霉胺的殘留量在 0.18～1.54 mg/kg之間，符合GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[22]中規(guī)定的嘧霉胺在藍(lán)莓上的MRL 值8 mg/kg 的要求。距最后一次施藥后 3、5、7、10 d 采摘的藍(lán)莓果實(shí)中嘧霉胺的殘留量對各消費(fèi)人群長期膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)商的貢獻(xiàn)率小于0.1%，說明通過藍(lán)莓?dāng)z入嘧霉胺殘留對人體產(chǎn)生的長期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)較低。綜上，筆者認(rèn)為，嘧霉胺懸浮劑可考慮登記用于藍(lán)莓上防治灰霉病，推薦其最高施藥劑量為有效成分 360 g/hm2，每季最多施藥2 次，安全間隔期3 d。此外，因藍(lán)莓目前仍屬于小宗作物，總體用藥量較少，企業(yè)自主登記積極性不高，故建議可由相關(guān)管理部門牽頭，組織各有意向企業(yè)進(jìn)行聯(lián)合登記，共享登記成果，一方面可解決種植戶無藥可用的困境，另一方面也可減輕企業(yè)負(fù)擔(dān)。

按照制定安全合理使用建議及規(guī)范MRL 值的規(guī)則，需要多個(gè)有代表性試驗(yàn)點(diǎn)的殘留數(shù)據(jù)，以得到較為合理的殘留中值(STMR)及殘留最高值(HR)。由于本研究只有一年一地的殘留數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)量及代表性尚不足以說明全國的情況，因此本研究結(jié)果僅供風(fēng)險(xiǎn)評估及制定MRL 值時(shí)參考。